Name: Generowanie mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią do badań nad decydualizacją endometrium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę generowania sztucznej decydualizacji u myszy po owariotomii do badań nad endometrium. Model ten pozwala kontrolować wpływ hormonów i zapewnia wysoką powtarzalność wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Nauk o Przyrodzie Chin (82001629, XQS), Młodzieżowego Programu Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20200116, XQS) oraz Funduszy na Studia Podoktoranckie w Prowincji Jiangsu (2021K277B, XQS).

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (nr 20171202) Szpitala Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School. Wszystkie operacje są prowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi agencji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
UWAGA: Myszy były hodowane w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF), o temperaturze 22 °C ± 1 °C, wilgotności względnej 50% ± 1%, cyklu światło/ciemność 12 godzin/12 godzin oraz swobodnym dostępie do jedzenia i wody.
1. Owariektomia myszy
<ol>
	<li>Narzędzia chirurgiczne należy wysterylizować sterylizatorem wysokotemperaturowym i wysokociśnieniowym na 1 dzień przed operacją.</li>
	<li>Zważ 8-tygodniowe myszy C57BL / 6 i dootrzewnowo (i.p) wstrzyknij odpowiednio 1% pentobarbitalu sodu, aby znieczulić myszy. Stosowana dawka to 40 mg/kg17. Dawka ta zapewnia 40-60 minut sedacji, co spełnia wymagania wycięcia jajników. W przypadku analgezji przedoperacyjnej należy wstrzyknąć myszom meloksykam (s.c) w dawce 5 mg/kg (s.c). 
	UWAGA: Skuteczne znieczulenie u myszy może być wskazane przez zanik głębokich odruchów mięśniowych i jednostajny oddech. Oznaki udanego znieczulenia to brak mrugania podczas dotykania wewnętrznej kantu, brak połykania podczas ciągnięcia języka, brak zginania nóg podczas szczypania skóry między palcami i brak podskakiwania podczas nakłuwania ogona.</li>
	<li>Nałóż ochronną maść na oczy na gałki oczne, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Rozpocznij operację, gdy myszy są całkowicie znieczulone. Umieść i zamocuj myszy w pozycji leżącej na powierzchni operacyjnej i ogol włosy z tyłu po zwilżeniu ich wodą z mydłem. Po goleniu zdezynfekuj skórę 70% etanolem.</li>
	<li>Znajdź miejsce nacięcia operacji na wysokości 0,5 cm (lub 1,0 cm poniżej żebra) na górnej krawędzi nasady uda obu kończyn tylnych równolegle do kręgosłupa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Prawidłowe miejsce nacięcia jest niezbędne do szybkiej lokalizacji jajnika.</li>
	<li>Weź miejsce nacięcia jako środek i zdezynfekuj obszar nacięcia jodoforem 3x, a następnie umieść serwetę chirurgiczną wokół obszaru nacięcia.</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie około 0,5-1,0 cm za pomocą nożyczek. Przetnij powięź i biernie oddziel mięśnie pęsetą.</li>
	<li>Znajdź kawałek białej poduszeczki tłuszczowej w polu nacięcia w pobliżu dolnego bieguna nerki przez cienką warstwę mięśniową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Biała poduszeczka tłuszczowa jest najbardziej oczywistym wskaźnikiem lokalizacji jajnika.</li>
	<li>Zacisnąć masę tłuszczową za pomocą klipsów hemostatycznych i wyciągnąć jajnik owinięty poduszką tłuszczową z nacięcia.</li>
	<li>Zacisnąć połączenie jajnika i jajowodu za pomocą zakrzywionej pęsety i usunąć jajnik wzdłuż szypułki jajnika nożyczkami. Zatamować krwawienie za pomocą wstrzykiwacza do elektrokoagulacji lub igły strzykawki o pojemności 1 ml podgrzanej na lampie alkoholowej. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby zachować jajowód, który jest anatomicznym punktem orientacyjnym dla późniejszego wstrzyknięcia oleju sezamowego do rogów macicy.</li>
	<li>Przepłucz nacięcie chirurgiczne zwykłą solą fizjologiczną, aby zapobiec zrostowi tkanek, użyj szwu 4-0, aby zszyć odpowiednio mięsień i skórę, a następnie ponownie zdezynfekuj nacięcie chirurgiczne jodoforem.</li>
	<li>Umieść myszy w pozycji leżącej w klatce i reanimuj je w inkubatorze o temperaturze 25 °C wyposażonym w źródło światła i system wentylacji przez około 2 godziny.</li>
	<li>Zwróć uwagę na myszy po operacji, umieść je z powrotem w pierwotnym miejscu karmienia, aż całkowicie wyzdrowieją, i daj im wystarczającą ilość wody i jedzenia.</li>
</ol>
2. Odpoczynek pooperacyjny a preparat estrogenu i progesteronu
<ol>
	<li>Upewnij się, że myszy odpoczywają przez 2 tygodnie po wycięciu jajników.</li>
	<li>W ultra czystej szafce dodaj estrogen (2 ng/μl) i progesteron (0,2 ng/μl) do oleju sezamowego w probówkach wirówkowych bez enzymów RNA.</li>
	<li>Umieścić probówki wirówkowe w termostatycznej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ciągle wstrząsać probówkami, aby przyspieszyć rozpuszczanie.</li>
	<li>Po całkowitym rozpuszczeniu podziel roztwór oleju sezamowego na 100 μl aliqoutów dla wygody użycia. Przygotowane roztwory estrogenu i progesteronu przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Sztuczny model decydualizacji indukowanej
<ol>
	<li>Podskórnie (s.c) wstrzyknij 100 ng estrogenu w 50 μl oleju sezamowego każdej myszy przez 3 dni, a następnie 2 dni odpoczynku15. 
	UWAGA: Upewnij się, że estrogen i progesteron zostały sformułowane i umieszczone w różnych miejscach. Każde zanieczyszczenie estrogenu progesteronem może prowadzić do niepowodzenia.</li>
	<li>Wstrzyknij (s.c.) 1 mg progesteronu i 10 ng estrogenu w 50 μl oleju sezamowego każdej myszy przez kolejne 3 dni15.</li>
	<li>Uruchom myszy, aby wywołać sztuczny model decydualizacji15 6 godzin po trzecim połączonym wstrzyknięciu estrogenu i progesteronu.</li>
	<li>Znajdź róg macicy na dolnym końcu jajowodu i powoli wstrzyknij 20 μl oleju sezamowego wraz z rogiem macicy, odepchnij tkankę do tyłu, zszyj nacięcie i pozwól myszy dojść do siebie. Podejście do operacji jest takie samo jak w przypadku wycięcia jajników u myszy15. 
	UWAGA: Drugą operację należy przeprowadzić tylko w przypadku udanej wycięcia jajników (nacięcie skóry jest dobrze zagojone, jajnik jest całkowicie wycięty, a resztkowy koniec jajowodu nie przylega do otaczających tkanek). 
	UWAGA: Do wywołania modelu AD odpowiednie jest 20 μl oleju sezamowego; ponad 20 μl oleju sezamowego z łatwością przeniknie na drugą stronę.</li>
	<li>Wstrzyknij (s.c.) 50 μl oleju sezamowego zawierającego 1 mg progesteronu i 10 ng estrogenu (H.) przez kolejne 4 dni. Zobacz szczegóły w Rysunek 215,18.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji (n = 6) przez uduszenie dwutlenkiem węgla i zbierz macicę. Obserwuj kształt obustronnej macicy, rób zdjęcia i waż rogi macicy (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A, B).</li>
	<li>Przymocuj 3-5 mm tkanki macicy za pomocą 10% formaliny, zanurz w parafinie i pokrój je. Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną, aby zaobserwować zmiany morfologiczne19 (Rysunek 4A).</li>
	<li>Zanurz kolejne 3-5 mm tkanki macicy w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w lodówce o temperaturze -80 °C. Zamrożone przecięcie tkanki do 10 μm i wykrycie aktywności fosfatazy alkalicznej w tkance macicy metodą sprzęgania azowego20 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). 
	UWAGA: Zadowalające wyniki można uzyskać przy użyciu skrawków zamrożonych do wykrywania zawartości ALP, a nie skrawków parafinowych.</li>
	Wyodrębnij całkowite RNA macicy za pomocą odczynnika Trizol i wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) w systemie PCR w czasie rzeczywistym (Tabela materiałów) z główną mieszanką qPCR (Tabela materiałów) w celu wykrycia względnej ekspresji mRNA członka podrodziny prolaktyny 8 2 (Prl8a2), fosfatazy alkalicznej wątroby / kości / nerki (Alpl) i białka wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (Igfbp1) 15 poprzez normalizację do poziomów mRNA 18S (<li> <silna klasa="xfig">Rysunek 4C-E). Postępuj zgodnie z warunkami PCR: Etap 1, 95 °C przez 30 s; Etap 2, 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s; Powtórz cykl 40 razy. Pełny wykaz sekwencji starterów znajduje się w tabeli 1.</li>
	<li>Analizuj dane qPCR za pomocą metody 2-ΔΔCT i metody testu t do analizy statystycznej w odpowiednim oprogramowaniu. W tym badaniu p < 0,05 uznano za statystycznie istotne.</li>
</ol>

<ol><li>Carson, S. A., Kallen, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+infertility%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of infertility: A review.</a> JAMA. 326 (1), 65-76 (2021).</li>
<li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+female+infertility+dagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Genetics of human female infertility dagger.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li>
<li>Sang, Y., Li, Y., Xu, L., Li, D., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+endometrial+decidualization+and+pregnancy-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of endometrial decidualization and pregnancy-related diseases.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 52 (2), 105-115 (2020).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+decidualization%3A+The+primary+driver+of+pregnancy+health%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endometrial decidualization: The primary driver of pregnancy health.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4092(2020).</li>
<li>Birgit, G., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchymal-epithelial+transition+in+endometrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function.</a> Human Reproduction Update. 25 (1), 114-133 (2019).</li>
<li>Paulson, E. E., Comizzoli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+receptivity+and+embryo+implantation+in+carnivores-commonalities+and+differences+with+other+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Endometrial receptivity and embryo implantation in carnivores-commonalities and differences with other mammalian species.</a> Biology of Reproduction. 104 (4), 771-783 (2021).</li>
<li>Kelleher, A. M., Milano-Foster, J., Behura, S. K., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+glands+coordinate+on-time+embryo+implantation+and+impact+endometrial+decidualization+for+pregnancy+success%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Uterine glands coordinate on-time embryo implantation and impact endometrial decidualization for pregnancy success.</a> Nature Communications. 9 (1), 2435(2018).</li>
<li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+monoamine+oxidase+a+impairs+endometrial+receptivity+in+women+with+adenomyosis+via+downregulation+of+FOXO1dagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Attenuated monoamine oxidase a impairs endometrial receptivity in women with adenomyosis via downregulation of FOXO1dagger.</a> Biology of Reproduction. 105 (6), 1443-1457 (2021).</li>
<li>Large, M. J., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+embryo+implantation+and+endometrial+decidualization+by+progesterone+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 155-165 (2012).</li>
<li>Dunn, C. L., Kelly, R. W., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrial+stromal+cell%3A+an+enigmatic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic transformation.</a> Reproductive BioMedicine Online. 7 (2), 151-161 (2003).</li>
<li>Zhu, H., Hou, C. C., Luo, L. F., Hu, Y. J., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+stromal+cells+and+decidualized+stromal+cells%3A+Origins%2C+transformation+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Endometrial stromal cells and decidualized stromal cells: Origins, transformation and functions.</a> Gene. 551 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Jose, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+and+decidual+stromal+precursors+show+a+different+decidualization+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Endometrial and decidual stromal precursors show a different decidualization capacity.</a> Reproduction. 160 (1), 83-91 (2020).</li>
<li>Pan-Castillo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphophysical+dynamics+of+human+endometrial+cells+during+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Morphophysical dynamics of human endometrial cells during decidualization.</a> Nanomedicine. 14 (7), 2235-2245 (2018).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mouse+decidualization+models+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mouse decidualization models at the molecular level.</a> Genes. 11 (8), 935(2020).</li>
<li>De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55168(2017).</li>
<li>Kerger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+oxygen+delivery+and+interstitial+oxygenation+during+sodium+pentobarbital+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Microvascular oxygen delivery and interstitial oxygenation during sodium pentobarbital anesthesia.</a> Anesthesiology. 86 (2), 372-386 (1997).</li>
<li>Filant, J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+glands+are+essential+for+blastocyst+implantation+and+decidualization+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Endometrial glands are essential for blastocyst implantation and decidualization in the mouse uterus.</a> Biology of Reproduction. 88 (4), 93(2013).</li>
<li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+protease+LONP1+maintains+oocyte+development+and+survival+by+suppressing+nuclear+translocation+of+AIFM1+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals.</a> EBioMedicine. 75, 103790(2022).</li>
<li>Grogg, E., Pearse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+azo+dye+methods+for+histochemical+demonstration+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling azo dye methods for histochemical demonstration of alkaline phosphatase.</a> Nature. 170 (4327), 578-579 (1952).</li>
<li>Labarta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+serum+and+endometrial+progesterone+in+determining+endometrial+receptivity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Analysis of serum and endometrial progesterone in determining endometrial receptivity.</a> Human Reproduction. 36 (11), 2861-2870 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Decydualizacja u myszy jest procesem spontanicznym zależnym od obecności zarodków, który różni się od ludzi. Stwierdzono jednak, że sztuczna stymulacja, taka jak wstrzyknięcie do macicy szklanych kulek i uszkodzenie macicy, może wywołać decydualizację endometrium zamiast zarodków. Ponadto naukowcy odkryli, że wiele czynników może indukować decydualizację lub uczestniczyć w decydualizacji, takich jak wstrzykiwanie hormonów steroidowych, prostaglandyn i czynników hamujących wzrost do jamy macicy21. ...

Wraz z rozwojem technologii wspomaganego rozrodu, obecny wskaźnik ciąż klinicznych z transferem zarodków in vitro (IVF-ET) osiągnął lub nawet przewyższył ten z naturalnej ciąży. Mimo to wiele pacjentek w praktyce klinicznej wspomaganego rozrodu nadal poddaje się wielokrotnym transferom zarodków, ale nie udaje im się zajść w ciążę zgodnie z oczekiwaniami. Jednak jego specyficzny mechanizm molekularny jest nadal niejasny, więc interwencja kliniczna jest nieskuteczna, co jest jednym z istotnych wyzwań stojących przed medycyną reprodukcyjną1,2.
Czynniki endometrium odpowiadają za około dwie trzecie przyczyn niepowodzeń in vitro3. Implantacja ludzkiego zarodka dzieli się na trzy etapy: pozycjonowanie, adhezja i inwazja4,5,6. Błona śluzowa macicy matki przechodzi szereg zmian, aby sprostać pojawieniu się zarodka. Tworzenie "okresu okienkowego" implantacji zapewnia korzystne warunki do implantacji zarodka7,8.
U większości ssaków, po tym jak blastocysta przylega do nabłonka światła macicy, komórki zrębu otaczające blastocystę szybko zaczynają się namnażać i różnicować, a szybka przebudowa mezenchymisty zmienia jej kształt i funkcję, prowadząc do implantacji zarodka5,9,10. Szybki wzrost objętości i masy miejsca pozwala blastocyście zagnieździć się w zrębie macicy, w procesie znanym jako decydualizacja11. Zrąb endometrium różnicuje się i przebudowuje w ramach przygotowań do ciąży, podczas gdy przejście komórek zrębu zapewnia przestrzeń i nowe połączenia sygnalizacyjne dla komórek dziesiętnych, aby mogły wykonywać swoje funkcje12,13. Komórki zrębu przekształcają się w komórki dziesiętne i wydzielają wiele kultowych czynników, takich jak prolaktyna (PRL), białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (Igfbp1) i tak dalej. Badania wykazały, że nieprawidłowa decydualizacja jest jedną z głównych przyczyn niepowodzenia implantacji zarodka, ale przyczyna nieprawidłowej decydualizacji jest nadal niejasna i wymaga dalszego wyjaśnienia1,14.
Mysi model sztucznej decydualizacji jest niezbędny do badania procesu fizjologicznego i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw decydualizacji. Sztuczne decydualizacja (AD) odnosi się głównie do procesu decydualizacji endometrium ustanowionego sztucznymi metodami w celu symulacji ciąży lub cyklu miesiączkowego. Jeśli chodzi o morfologię, ogólna różnica między decydualizacją ciąży a sztuczną decydualizacją jest niewielka15,16. Gruczoły maciczne istnieją w błonie śluzowej macicy przed utworzeniem decydui i znikają po zdziesiątkowaniu. Jeśli chodzi o ekspresję genu, stwierdzono tylko niewielką różnicę między naturalną decydualizacją ciąży (NPD) a AD15. W związku z tym model sztucznej decydualizacji u myszy może symulować decydualizację ciąży w celu zbadania nieznanej patogenezy i nowego leczenia chorób rozrodczych u ludzi.
NPD, AD i decydualizacja in vitro (IVD) to trzy metody osiągania dziesiątkowania myszy. Model NPD zależy od naturalnej ciąży i jest najbliższy matczynemu stanowi fizjologicznemu, w tym efektom ze strony zarodków. Porównywanie różnic między miejscami implantacji i bez implantacji jest bardziej fizjologicznym i wygodnym podejściem do badania decydualizacji. Model AD został opracowany przy użyciu wewnątrzmacicznego wstrzyknięcia oleju sezamowego jako stymulanta w celu wywołania decydualizacji u pseudociężarnej samicy myszy skrzyżowanej z samcami po wazektomii, aby uniknąć wpływu zarodków. Zarówno model NPD, jak i AD odgrywają istotną rolę w różnych celach badawczych, ale nie mogą uniknąć niepowodzenia kojarzenia i różnic wewnątrz grupy spowodowanych różnymi czynnościami metabolizmu hormonów matczynych. IVD to metoda zależna od leczenia skojarzonym estrogenem i progesteronem na poziomie komórkowym, która wymaga bardziej rygorystycznych warunków eksperymentalnych i zdolności operacyjnej. Jednak model in vitro nie może w pełni symulować odpowiedzi dziesiętnej w warunkach fizjologicznych15. Dlatego proponujemy prostą i ulepszoną metodę indukcji, zmodyfikowaną w stosunku do tradycyjnej choroby Alzheimera, w celu zmniejszenia wpływu hormonów endogennych na decydualizację. Opierając się na zapewnieniu powodzenia indukcji decydualizacji, jest bliższa stanowi fizjologicznemu i bardziej odpowiednia do eksperymentów, które muszą wykluczyć czynniki zarodkowe.

<table><tbody><tr><td>Estrogen</td><td>Sigma</td><td>E2758</td><td>Suplement hormonalny</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P0130</td><td>Suplement hormonalny</td></tr><tr><td>Olej sezamowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3547</td><td>Suplement hormonalny</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu&nbsp;</td><td>Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.</td><td></td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Meloksykam do wstrzykiwań</td><td>Qilu Animal Health Products Co., Ltd</td><td></td><td>Analgezja</td></tr><tr><td>Alkaliczny zestaw barwników fosfatazowych (metoda łączenia Kaplowa / Azo)</td> <td>Solarbio</td><td>G1480</td><td>Alkaliczna plama fosfatazowa</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Servicebio</td><td>G1005-2</td><td>HE Barwnik</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Servicebio</td><td>G1005-1</td><td>Barwnik HE</td></tr><tr><td>ChamQ Uniwersalny SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q711-02</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Lircon</td><td>ZH1120090</td><td>Dezynfekcja</td></tr><tr><td>Jodoforu</td><td>Runzekang</td><td>RZK-DF</td><td>Dezynfekcja</td></tr><tr><td>Erytromycyna Maść do oczu</td><td>Guangzhou Baiyunshan</td><td></td><td>Myszy Eyeball protect</td></tr><tr><td>4-0 szew</td><td>Ethicon</td><td>W329</td><td>Szew do nacięcia</td></tr><tr><td>10% formaliny</td><td>Yulu</td><td>L25010118</td><td>Tissue fix</td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia związek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Odczynnik Ssection</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>qPCR</td></tr></tbody></table>

generowanie mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią do badań nad decydualizacją endometrium

Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research

Dziesiątkowanie endometrium to unikalny proces różnicowania endometrium, ściśle związany z miesiączką i ciążą. Upośledzenie decydualizacji prowadzi do różnych zaburzeń endometrium, takich jak niepłodność, nawracające poronienia i przedwczesny poród. Opracowanie i wykorzystanie modelu decydualizacji endometrium w badaniach reprodukcyjnych od dawna stanowi ważne dla badaczy zajmujących się reprodukcją. Mysz była szeroko stosowana w badaniu reprodukcji i decydualizacji. Istnieją trzy dobrze ugruntowane modele mysie dotyczące decydualizacji, a mianowicie naturalna decydualizacja ciąży (NPD), sztuczna decydualizacja (AD) i decydualizacja in vitro (IVD). Wśród nich AD jest uważany za wiarygodny model decydualizacji myszy, który jest łatwy do wdrożenia i bliski NPD. Niniejsza praca koncentruje się na zmodyfikowanej metodzie generowania i stosowania mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią w celu uniknięcia wpływu na jajniki, co pozwala uzyskać wysoce powtarzalne wyniki przy małych wariancjach w obrębie grupy. Metoda ta zapewnia dobry i wiarygodny model zwierzęcy do badania decydualizacji endometrium.

Wskaźniki modelu decydualizacji u myszy obejmują ogólną morfologię macicy, stosunek masy macicy zdecydualizowanej do niezdecydualizowanej, morfologię histologiczną błony śluzowej macicy oraz poziom ekspresji cząsteczek markerowych decydualizacji. Ogólna morfologia sztucznie zdecydualizowanej macicy myszy indukowanej olejem jest bardziej zbliżona do morfologii macicy w ciąży. Trzon macicy ulega pogrubieniu, a światło macicy staje się mniejsze niż po stronie nieindukowanej. Objętość i masa indukowanego rogu macicy są znacz...

Tutaj opisujemy metodę generowania sztucznego modelu decydualizacji za pomocą myszy z owariektomią, klasyczny eksperyment decydualizacji endometrium w dziedzinie badań nad decydualizacją endometrium.

Generowanie mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią do badań nad decydualizacją endometrium

Endometrial decidualization is a unique differentiation process of the endometrium, closely related to menstruation and pregnancy. Impairment of ...

Upośledzenie decentralizacji prowadzi do wirusowych zaburzeń endometrium, takich jak zgon, nawracające poronienia. Metoda ta zapewnia dobry i wiarygodny model zwierzęcy do badania decentralizacji endometrium. Ten sztuczny model decentralizacji z owariektomią może uniknąć wpływu angeliny na hormony, co często może być wysoce powtarzalne wyniki z niewielkimi różnicami w grupie.Aby rozpocząć sterylizację narzędzi chirurgicznych za pomocą sterylizatora wysokotemperaturowego i wysokociśnieniowego na dzień przed operacją. Nałóż ochronną maść na oczy na gałki oczne, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Rozpocznij operację, gdy myszy są całkowicie znieczulone.Umieść myszy w pozycji leżącej na powierzchni operacyjnej i ogol włosy z tyłu po zwilżeniu ich wodą z mydłem. Zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Znajdź miejsce nacięcia operacji w odległości 0,5 centymetra na górnej krawędzi nasady uda obu kończyn tylnych równolegle do kręgosłupa.Weź miejsce nacięcia jako środek i trzykrotnie zdezynfekuj obszar nacięcia jodoforem. Wykonaj podłużne nacięcie o długości około 0,5 do jednego centymetra za pomocą nożyczek. Przetnij powięź i biernie oddziel mięśnie pęsetą.Znajdź kawałek białej poduszeczki tłuszczowej w polu nacięcia w pobliżu dolnego bieguna nerki przez cienką warstwę mięśni. Zacisnąć masę tłuszczową za pomocą klipsów hemostatycznych i wyciągnąć jajnik owinięty poduszką tłuszczową z nacięcia. Zacisnąć połączenie jajnika i jajowodu zakrzywioną pęsetą i usunąć jajnik wzdłuż szypułki jajnika nożyczkami.Zatamować krwawienie za pomocą wstrzykiwacza do elektrokoagulacji lub igły jednomililitrowej strzykawki podgrzanej na lampie alkoholowej. Przepłucz nacięcie chirurgiczne zwykłą solą fizjologiczną, aby zapobiec zrostowi tkanek. Użyj szwu 4-0, aby zasiać odpowiednio mięsień i skórę i ponownie zdezynfekować nacięcie chirurgiczne jodoforem.Umieść myszy w pozycji leżącej w klatce i reanimuj je w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Wyposażony w źródło światła i system wentylacji na około dwie godziny. Zwróć uwagę na myszy po operacji.Umieść je z powrotem w pierwotnym miejscu karmienia samodzielnie, aż całkowicie wyzdrowieją i zapewnij im wystarczającą ilość wody i jedzenia. Podskórnie wstrzyknij 100 nanogramów estrogenu w 50 mikrolitrach oleju sezamowego każdej myszy przez trzy dni, a następnie dwa dni odpoczynku. Wstrzyknij jeden miligram progesteronu i 10 nanogramów estrogenu w 50 mikrolitrach oleju sezamowego każdej myszy przez kolejne trzy dni.Operuj myszy, aby wywołać model sztucznej rezydualizacji sześć godzin po trzecim połączonym wstrzyknięciu estrogenu i progesteronu. Znajdź róg macicy na dolnym końcu jajowodu i powoli wstrzyknij 20 mikrolitrów oleju sezamowego wzdłuż rogu macicy. Odepchnij tkankę do tyłu, zszyj nacięcie i pozwól myszy dojść do siebie.Przymocuj trzy do pięciu mililitrów tkanki macicy za pomocą 10% formaliny zatopionej w parafinie i pokrój je. Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną, aby zaobserwować zmiany morfologiczne. Osadź kolejne trzy do pięciu milimetrów tkanki macicy w optymalnej temperaturze cięcia, zamroź związek w ciekłym azocie i przechowuj w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Zamrożona tkanka dzieli się na 10 mikrometrów i wykrywa aktywność fosfatazy alkalicznej w tkance macicy metodą sprzęgania Azo. Ogólna morfologia sztucznej zdecentralizowanej macicy myszy wywołanej olejem jest bliższa morfologii macicy w ciąży. Trzon macicy staje się gruby, a jama macicy staje się mniejsza niż strona nieindukowana.Objętość i masa indukowanego rogu macicy są znacznie wyższe niż po stronie nieindukowanej. Barwienie tkanki macicy hematoksyliną i eozyną wykazało, że gruczoły zanikają, a końcowe komórki zrębu endometrium na indukowanym rozdarciu różnicują się w duże, okrągłe, cytoplazmatyczne i wielojądrowe komórki dziesiętne z niejasnymi granicami komórkowymi. Nieindukowane odcinki boczne pokazują morfologię tkanki endometrium w normalnym stanie fizjologicznym.Wynik metody sprzęgania azowego wykazał, że zawartość fosfatazy alkalicznej po stronie indukowanej olejem była znacznie wyższa niż po stronie nieindukowanej. Wyniki QPCR wykazały, że ekspresja mRNA PRL-8-A-2, ALPL i IGFBP-1 w indukowanym rogu była znacznie wyższa niż w nieindukowanym, co sugeruje, że olej może indukować sztuczną decentralizację u myszy. Suplementacja homo to długotrwały proces, który wymaga szczególnej uwagi: zanieczyszczenie między homo, co jest kluczem do sukcesu.Na podstawie tego modelu można wykonać iniekcję adenowirusa do rogu macicy, który może badać odpowiedni mechanizm działania określonych cząsteczek regulujących resztkowość.

generation-mouse-artificial-decidualization-model-with-ovariectomy

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

W tym filmie opisujemy zabieg chirurgiczny polegający na pobraniu nienaruszonego jajnika z modelu mysiego.

Nienaruszone jajniki pobrane od myszy: zabieg chirurgiczny mający na celu wyizolowanie całego jajnika z modelu mysiego

To badanie przedstawia standaryzowaną i zweryfikowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek zrębu i nabłonka endometrium myszy, które mogą być używane w systemie kokultury do badania decydualizacji in vitro.

Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

To badanie przedstawia zweryfikowaną i zoptymalizowaną procedurę izolacji i hodowli ludzkich komórek zrębu endometrium do przeprowadzenia testu decydualizacji in vitro. Co więcej, badanie to dostarcza szczegółowej metody skutecznego knockdown określonego genu za pomocą siRNA w ludzkich komórkach zrębu endometrium.

Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych fragmentów ludzkiego endometrium przeszczepionych myszom. Metoda pozwala na badanie wpływu wybranych leków na wielkość zmiany endometriotycznej poprzez monitorowanie i kwantyfikację fluorescencji emitowanej przez reporter fluorescencyjny w czasie...

Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Wiele modeli endometriozy u gryzoni jest ograniczonych przez techniczną złożoność, powtarzalność i/lub potrzebę stosowania zwierząt z obniżoną odpornością lub specjalnych myszy reporterowych. Przedstawiamy uproszczony system indukcji zmian chorobowych przy użyciu dowolnej myszy eksperymentalnej z niezależnie weryfikowalnym, obiektywnym systemem punktacji i bez konieczności wycinki owariektomii lub operacji przeżycia.

Syngeniczny mysi model endometriozy przy użyciu myszy z naturalną jazdą na rowerze

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Ustanowienie ciąży to dynamiczny proces obejmujący skomplikowane przenikanie się zarodków i macicy. Dokładny wkład środowiska macicy matki w te procesy pozostaje aktywnym obszarem badań. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły, które mają pomóc w projektowaniu modeli zwierzęcych in vivo, aby odpowiedzieć na te pytania badawcze.

Metody badania wkładu macicy w powstanie ciąży w mysim modelu owariektomii

Hormon folikulotropowy (FSH) w różnych tkankach i organach pozagonadalnych jest związany z patogenezą wielu chorób. Mysi model owariektomii i leczony FSH (OVF) może być wykorzystany do zbadania pozagonowego działania FSH.

Badanie niezależnych efektów hormonu folikulotropowego in vivo w modelu mysim

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Poznaj metodę generowania sztucznej decydualizacji u myszy po owariotomii do badań nad endometrium. Model ten pozwala kontrolować wpływ hormonów i zapewnia wysoką powtarzalność wyników.

Generowanie mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią do badań nad decydualizacją endometrium

Przeglądaj więcej filmów