Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na przedkliniczne pytania związane z bezpieczeństwem kardiologicznym i toksycznością, wykorzystując rzeczywiste dane pochodzące z badań na ludziach w celu bezpiecznego przejścia nowych kandydatów na leki do etapów klinicznych. Zamiast stosowania zestawu różnych technik in vitro i in vivo, główną zaletą tego systemu hybrydowego jest jednoczesna ocena kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPC, parametrów elektrofizjologicznych i żywotności oraz analiza właściwości kurczliwych w warunkach fizjologicznych. Metoda ta może być stosowana do odkrywania leków, ponieważ obejmuje zmiany elektrofizjologiczne, strukturalne i kurczliwe kardiomiocytów oraz system o wyższej przepustowości, który pozwala na jednoczesne testowanie 69 studzienek.

Aby rozpocząć powlekanie płyty, należy pozostawić dolną część płytki skurczowej przykrytą dodatkowo dostarczoną osłoną membranową do czasu pomiaru w module kurczliwości. Do wysiewu kardiomiocytów należy przygotować rozcieńczony roztwór do powlekania żelem EHS, przenosząc 2,75 mililitra gotowego do użycia roztworu żelu EHS i 8,25 mililitra DPBS z wapniem i magnezem w sterylnej probówce wirówkowej. Następnie wymieszaj roztwór.

Zdejmij osłonę membrany z płytki skurczowej. Przygotowany roztwór powlekający przenieść do sterylnego zbiornika odczynnika w robocie automatyki laboratoryjnej. Skorzystaj z programu, dodaj 100 mikrolitrów za pomocą robota automatyzacji laboratoryjnej i dodaj 100 mikrolitrów roztworu powlekającego na studzienkę.

Następnie umieść pokrywkę z powrotem na 96-dołkowej płytce i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu i policzeniu komórek dostosuj komórki w zalecanym podłożu galwanicznym zgodnie z instrukcjami producenta ogniw, co daje 11 razy od 10 do szóstych komórek na 11 mililitrów do wysiewu całej 96-dołkowej płytki. Użyj programu usuń 100 mikrolitrów, aby usunąć roztwór żelu EHS ze studzienek za pomocą robota automatyzującego laboratorium.

Następnie przenieś 11 mililitrów zawiesiny komórek do sterylnego zbiornika odczynnika umieszczonego w robocie automatyzującym laboratorium i zasiej komórki 100 mikrolitrami zawiesiny na studzienkę. Za pomocą programu komórki dodają 100 mikrolitrów. Natychmiast po wysianiu komórek przenieś elastyczną 96-dołkową płytkę do inkubatora o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i pozwól komórkom osiąść na noc.

Podgrzej 22 mililitry pożywki podtrzymującej kardiomiocyty, którą należy dodać do każdej płytki, do 37 stopni Celsjusza w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. 18 do 24 godzin po wysianiu płytek przenieś świeżą pożywkę do sterylnego zbiornika odczynnika i pozostaw ją obok robota automatyzującego laboratorium. Następnie wykonaj usuwanie pożywki za pomocą programu, usuń 100 mikrolitrów.

Następnie umieść zbiornik odczynnika zawierający świeżą pożywkę w robocie automatyzacji laboratorium i dozuj 200 mikrolitrów świeżej pożywki na studzienkę za pomocą programu, dodaj 100 mikrolitrów. Wykonaj ten krok dwukrotnie, aby osiągnąć 200 mikrolitrów na studzienkę. Natychmiast po wymianie pożywki przenieść płytkę do inkubatora.

Wykonuj wymianę pożywki co drugi dzień, aż do dodania mieszanki. Cztery do sześciu godzin przed dodaniem związku wykonaj ostateczną zmianę pożywki, przenosząc 22 mililitry świeżego i ciepłego buforu testowego do sterylnego zbiornika odczynnika i pozostawiając go obok robota automatyzującego laboratorium. Natychmiast po wymianie pożywki przenieś elastyczną płytkę z powrotem do inkubatora.

Na godzinę przed pomiarem linii podstawowej przenieś płytkę do odpowiedniego urządzenia pomiarowego. W oprogramowaniu sterującym otwórz Edit Protocol i wybierz odpowiedni tryb pomiaru, Flex Site lub Impedancja EFP. Określ czas trwania lub długość przemiatania jednego pomiaru do 30 sekund i interwał powtarzania do 10 minut przed zapisaniem numeru protokołu.

Następnie wybierz opcję Start Protocol (Uruchom protokół) i kontynuuj wypełnianie wymaganych pól. Po ustawieniu parametrów wybierz opcję Rozpocznij pomiar. Wykonaj co najmniej trzy pomiary podstawowe w odstępach pięciominutowych na krótko przed dodaniem mieszanki.

Usunąć 50 mikrolitrów buforu testowego z każdej studzienki bez wyjmowania elastycznej 96-dołkowej płytki z urządzenia pomiarowego, a następnie dodać 50 mikrolitrów czterokrotnie stężonego roztworu związku do każdej studzienki płytki zgodnie z planem pomiaru. Po dodaniu związku wybierz opcję dodaj znacznik odczynnika, aby zdefiniować układ płytki związku i objętość roztworu związku. Następnie wybierz opcję Kontynuuj pomiar standardowy lub Kontynuuj serię pomiarów zgodnie z planem eksperymentalnym.

Analiza reprezentatywna wykazała wpływ inhibitora kinazy erlotynibu na kurczliwość ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przy najniższym stężeniu erlotynib powodował statystycznie nieistotne zmniejszenie amplitudy, podczas gdy stężenia mikromolowe erlotynibu wykazywały działanie kardiotoksyczne zależne od czasu i dawki. Początek efektu obserwowano po 96 godzinach w przypadku jednego mikromolowego Erlotynibu, podczas gdy leczenie 10 mikromolowym Erlotynibem spowodowało znaczne zmniejszenie 24 godziny po dodaniu związku.

Po zastosowaniu 10 mikromolowych epirubicyn komórki przestały bić w ciągu 24 godzin. Po zastosowaniu jednej mikromolowej epirubicyny drastyczny spadek amplitudy po 24 godzinach następował po całkowitym zaprzestaniu dudnienia do 48 godzin. Przy 100 nanomolach zaobserwowano zależny od czasu spadek amplitudy dudnień.

Przy najniższym stężeniu 10 nanomolowców amplituda wahała się równomiernie, co potwierdza, że działanie epirubicyny było zależne tylko od dawki. Leczenie doksorubicyną i nifedypiną przez 24 godziny zmniejsza żywotność komórek w sposób zależny od stężenia i czasu. Po zastosowaniu rosnących stężeń nifedypiny, zapisy potencjału pola na komórkach ujawniają zależne od stężenia skrócenie czasu trwania pola znormalizowane.

Ocena kurczliwości serca nifedypiny wykazała również znaczny spadek amplitudy zależny od stężenia po ostrym pomiarze przy stężeniach 10 nanomolowych i 13 nanomolowych. Należy pamiętać, że komórki są na ogół wrażliwe na parametry środowiskowe, takie jak zmiany temperatury i pH, a także symulację mechaniczną, która jest szczególnie wspierana na płytkach skurczowych.