Name: Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj hybrydowy system 96-well do analizy kurczliwości i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Ta metoda dostarcza danych w czasie rzeczywistym niezbędnych do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Spraw Gospodarczych i Działań na rzecz Klimatu (ZIM) oraz z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (KMUinnovativ). Dziękujemy firmie FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) za uprzejme udostępnienie kardiomiocytów oraz Ncardia B.V. (Leiden, Holandia) za uprzejme dostarczenie kardiomiocytów wykorzystanych w tym badaniu.

UWAGA: Przebieg pracy dla pomiaru kurczliwości i impedancji/EFP jest podany na rysunku uzupełniającym 2.
1. Powłoka płyty
<ol>
	<li>Otwórz zamknięte próżniowo opakowanie i wyjmij płytkę 96-dołkową. Procedury postępowania z płytkami 96-dołkowymi obu modułów są takie same. Płytkę skurczową należy pozostawić przykrytą dodatkowo dostarczoną osłoną membranową do czasu pomiaru w module kurczliwości.</li>
	<li>Pokryj elastyczne 96-dołkowe płytki do wysiewu kardiomiocytów.
	<ol>
		<li>Przygotować rozcieńczony roztwór do powlekania żelem EHS, przenosząc 2,75 ml gotowego do użycia roztworu żelu EHS w sterylnej probówce wirówkowej. Następnie dodaj 8,25 ml DPBS z Ca2+ i Mg2+. Dokładnie wymieszaj roztwór. 
		UWAGA: Opcjonalnie fibronektyna może być również użyta do pokrycia studzienek: przygotuj 13 ml roztworu powlekającego fibronektynę w sterylnej probówce wirówkowej, rozcieńczając 650 μl roztworu podstawowego fibronektyny (1 μg/ml) w 13 ml DPBS z Ca2+ i Mg2+, co daje roztwór roboczy o stężeniu 50 μg/ml. Dokładnie wymieszaj roztwór.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś roztwór powlekający do sterylnego zbiornika odczynnika umieszczonego w robocie automatyki laboratoryjnej.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu powlekającego do każdego dołka za pomocą robota automatyki laboratoryjnej za pomocą programu "ADD100μL". Umieścić pokrywkę z powrotem na płytce 96-dołkowej i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Program robota automatyki laboratoryjnej należy wcześniej ustawić ręcznie.</li>
</ol>
2. Wysiewanie ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do elastycznych 96-dołkowych płytek (Dzień 0)
<ol>
	<li>Rozmrozić ogniwa zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą ręcznej komory liczącej i dostosuj komórki w zalecanym podłożu galwanicznym zgodnie z instrukcjami producenta ogniwa (np. 1 x 105 komórek/dołek), co daje 11 x 106 komórek/11 ml do wysiewu całej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Usuń roztwór żelu EHS ze studzienek za pomocą robota automatyki laboratoryjnej za pomocą programu "REMOVE100μL". Wyjmij z robota zbiornik odczynnika zawierający dozowany roztwór powlekający.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek (łącznie 11 ml) do sterylnego zbiornika na odczynnik umieszczonego w robocie automatyki laboratoryjnej i zasiej komórki 100 μl/studzienkę za pomocą programu "CELLS_ADD100 μL".</li>
	<li>Natychmiast po wysianiu komórek przenieś elastyczną 96-dołkową płytkę do inkubatora (37 °C, 5% CO2 , kontrolowana wilgotność) i pozwól komórkom osiąść przez noc.</li>
</ol>
3. Wymiana medium elastycznych płytek 96-dołkowych (Dzień 1)
<ol>
	<li>Podgrzać co najmniej 22 ml pożywki podtrzymującej kardiomiocyty na płytkę do temperatury 37 °C w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml po wysianiu płytek, 18-24 godziny po wysianiu płytek.</li>
	<li>Przenieś świeżą pożywkę (co najmniej 22 ml) do sterylnego zbiornika na odczynnik i pozostaw ją tuż obok robota automatyzującego laboratorium. Umieść pusty zbiornik odczynnika w robocie i wykonaj usuwanie medium za pomocą programu "REMOVE100μL". Następnie należy wymienić zbiornik odczynnika zawierający pożywkę odpadową na zbiornik odczynnika zawierający świeżą pożywkę i dozować 200 μl świeżego podłoża na studzienkę za pomocą programu "ADD100μL". Wykonaj ten krok dwukrotnie, aby osiągnąć 200 μl/studzienkę.</li>
	<li>Natychmiast po wymianie pożywki przenieść płytkę z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Przeprowadzać wymianę pożywki (200 μl/studzienkę) co drugi dzień, aż do dodania mieszanki.</li>
</ol>
4. Końcowa wymiana podłoża przed dodaniem mieszanki (Dzień 5-7)
<ol>
	<li>Wykonać końcową wymianę podłoża 4-6 godzin przed dodaniem mieszanki.</li>
	<li>Ogrzać co najmniej 22 ml buforu do oznaczania na jedną elastyczną płytkę 96-dołkową. Bufor do oznaczania składa się z pożywki podtrzymującej lub jej pochodnych (np. pożywki o niskim lub zerowym poziomie surowicy, pożywki wolne od czerwieni fenolowej lub inne izotoniczne).</li>
	<li>Przenieś świeżą pożywkę do sterylnego zbiornika na odczynniki i pozostaw ją tuż obok robota automatyki laboratoryjnej. Umieść pusty zbiornik odczynnika w robocie i wykonaj usuwanie pożywki. Następnie wymień zbiornik odczynnika zawierający pożywkę odpadową na zbiornik odczynnika zawierający świeże podłoże i dozuj 200 μl/studzienkę świeżego podłoża.</li>
	<li>Natychmiast po wymianie pożywki przenieść elastyczną płytkę z powrotem do inkubatora.</li>
</ol>
5. Dodawanie związków i zapis danych (Dzień 5-7)
UWAGA: Przykładowy plan pomiarowy dla eksperymentu znajduje się na rysunku uzupełniającym 3.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór roboczy na związek o stężeniu 4x w okapie z przepływem laminarnym za pomocą sterylnej płytki dołkowej o głębokości 96. Roztwór złożony jest oparty na buforze testowym użytym w kroku 4. Przenieść płytkę dołka o głębokości 96 cm, zawierającą roztwór związku, na co najmniej 1 godzinę do inkubatora, aby dostosować ją do tego samego stanu, co płytka elastyczna. 
	UWAGA: Stężenie 1x każdego leku użytego w każdym eksperymencie jest podane na rysunkach i legendach.</li>
	<li>Przenieść płytkę do odpowiedniego urządzenia pomiarowego na 1 godzinę przed wykonaniem pomiaru podstawowego.</li>
	<li>Otwórz Edit Protocol w oprogramowaniu sterującym (część hybrydowego systemu analizy komórek) i wybierz odpowiedni tryb pomiaru: kurczliwość lub impedancję/EFP.</li>
	<li>Określ czas trwania przemiatania (długość jednego pomiaru, np. 30 s) i interwał powtórzeń (czas między pomiarami; np. 5 min) i zapisz numer protokołu.</li>
	<li>Wybierz opcję Rozpocznij protokół > Kontynuuj i wypełnij wymagane pola.</li>
	<li>Na koniec wybierz opcję Rozpocznij pomiar. Wykonaj co najmniej trzy pomiary podstawowe (przemiatanie) w odstępach 5-minutowych na krótko przed dodaniem mieszanki. 
	UWAGA: Przykładowe dane dotyczące pomiaru linii bazowej kurczliwości przy użyciu modułu kurczliwości przed dodaniem związku przedstawiono na rysunku uzupełniającym 4</li>
	<li>Usunąć 50 μl buforu testowego z każdej studzienki bez wyjmowania elastycznej płytki 96-dołkowej z urządzenia pomiarowego.</li>
	<li>Dodać 50 μl 4x stężonego roztworu związku do każdego dołka płytki, zgodnie z planem pomiarów.</li>
	<li>Wybierz opcję Dodaj znacznik regionu i zdefiniuj układ blachy złożonej oraz objętość roztworu złożonego po dodaniu składnika.</li>
	<li>Na koniec wybierz opcję Kontynuuj pomiar standardowy lub Kontynuuj serię pomiarów zgodnie z planem eksperymentu.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania do nagrywania mierz przebiegi, których długość i interwał powtórzeń są definiowane przez użytkownika.</li>
	<li>Dzięki oprogramowaniu analitycznemu uchwyć kształt sygnału, automatycznie odczytując parametry, takie jak amplituda, szybkość dudnienia, szerokość impulsu i tak dalej. 
	UWAGA: Uśredniony sygnał z uwzględnieniem odchylenia standardowego, tzw. średniego uderzenia, jest automatycznie obliczany na podstawie danych z jednego przebiegu. Użytkownik może zdefiniować parametry kurczliwości/IMP/EFP, które oprogramowanie oblicza i wyświetla.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania analitycznego oblicz krzywą dawka-odpowiedź i IC50/EC50 dla każdego związku. 
	UWAGA: Surowe dane i wyniki analizy wygenerowane za pomocą oprogramowania analitycznego można łatwo wyeksportować w różnych formatach. Na koniec raporty danych są generowane automatycznie w celu podsumowania i zarchiwizowania wyników eksperymentu. Wyczerpujący opis tego, co i jak mierzy sygnał EFP, znajduje się w 17.</li>
</ol>

<ol><li>Weaver, R. J., Valentin, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Today%27s+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+%26%2334%3Bmind-the-gap%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &#34;mind-the-gap&#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li>
<li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology%3A+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li>
<li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+Validation+studies+and+best+practice+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).</li>
<li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells%3A+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892(2020).</li>
<li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Methods+in+Cardiovascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Cardiac+cell+culture%3A+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).</li>
<li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li>
<li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracycline+cardiotoxicity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li>
<li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracycline-induced+cardiotoxicity%3A+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+%28hiPSC-CMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li>
<li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225(2018).</li>
<li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li>
<li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li>
<li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li>
<li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li>
<li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li>
<li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li>
<li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Workshop+report%3A+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell+cardiac+%C2%B5GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li>
<li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906(2019).</li>
</ol>

B.L., M.Go. i P.L. są zatrudnieni w innoVitro GmbH, producencie płyt elastycznych. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. i S.S. są zatrudnieni w firmie Nanion Technologies GmbH, producencie urządzenia hybrydowego.

Hybrydowy system impedancji/EFP/kurczliwości jest kompleksową metodologią wysokoprzepustowej, bezpiecznej, farmakologicznej i toksykologicznej oceny obciążeń serca na potrzeby przedklinicznego opracowywania leków. Zapewnia nowoczesne podejście do przedklinicznych badań bezpieczeństwa bez użycia modeli zwierzęcych, ale z większą przepustowością, która znacznie skraca czas i koszty. System ten może być wykorzystany jako podejście uzupełniające dla Langendorff Heart i innych modeli zwierzęcych do przedklinicznej oceny toksy...

Jednym z głównych celów rozwoju nowoczesnych leków jest poprawa wskaźnika sukcesu nowych terapii w procesie odkrywania nowych leków. Testy farmakologiczne bezpieczeństwa tych nowych leków często ujawniają działania niepożądane leków na układ sercowo-naczyniowy, które stanowią prawie jedną czwartą wskaźnika wyczerpania leków na etapach przedklinicznych1. Rozwój i integracja metodologii nowego podejścia (NAM) odgrywają kluczową rolę w modernizacji oceny przedklinicznej, w szczególności narządów rdzeniowych, takich jak serce. Ponieważ metodologie te są podejściem wolnym od zwierząt, wykorzystanie modeli komórek opartych na ludziach, takich jak kardiomiocyty (CM) pochodzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), stało się koniem pociągowym w ciągu ostatniej dekady dla nowoczesnej oceny bezpieczeństwa problemów farmakologicznych i toksykologicznych2. Powszechnie stosowanymi systemami testowymi do takich badań są matryce mikroelektrod (MEA) i podejścia eksperymentalne oparte na barwnikach wrażliwych na napięcie3.
Niemniej jednak, deklarowana fenotypowa i funkcjonalna niedojrzałość tego typu komórek stawia przeszkody na drodze do idealnego modelu komórkowego opartego na człowieku, z potencjałem do zmniejszenia luk translacyjnych między badaniami nieklinicznymi i klinicznymi4.
Przez lata prowadzono ogromne badania, aby zrozumieć przyczynę domniemanego niedojrzałego fenotypu i znaleźć sposoby na przyspieszenie procesu dojrzewania ludzkich iPSC-CM in vitro.
Brak wskazówek dojrzewania serca, takich jak wydłużony czas hodowli komórek, brak innych typów komórek w pobliżu, lub brak stymulacji hormonalnej wpływa na proces dojrzewania5. Również niefizjologiczne środowisko zwykłych płytek do hodowli komórkowych zostało zidentyfikowane jako istotna przyczyna utrudniająca dojrzewanie ludzkich iPSC-CM, ze względu na brak sztywności substratu fizjologicznego rodzimego ludzkiego serca5,6.
Aby rozwiązać ten problem, opracowano różne systemy testowe skupiające się na natywnych warunkach fizjologicznych, w tym systemy hodowli komórkowych 3D, w których komórki są ustawione trójwymiarowo, aby przypominały natywną architekturę serca, a nie typowe dwuwymiarowe hodowle komórek7. Chociaż lepsze dojrzewanie uzyskuje się za pomocą testów 3D, zapotrzebowanie na wykwalifikowaną siłę roboczą i niska przepustowość tych systemów utrudniają obfite wykorzystanie ich w procesie opracowywania leków, ponieważ czas i koszt odgrywają fundamentalną rolę w ocenie nowych terapii na poziomie finansowym8.
Ważne wnioski dla bezpieczeństwa farmakologicznej i toksykologicznej oceny nowych terapii to zmiany w funkcjonalnych i strukturalnych cechach ludzkich iPSC-CMs, ponieważ wywołane związkiem niepożądanym reakcje na leki układu sercowo-naczyniowego zwykle wpływają na jedną lub obie te właściwości1,9. Dobrze znanymi przykładami takich szerokich działań niepożądanych są leki przeciwnowotworowe z rodziny antracyklin. W tym przypadku niebezpieczne funkcjonalne i niekorzystne skutki strukturalne na układ sercowo-naczyniowy są szeroko zgłaszane w trakcie i po leczeniu raka u pacjentów, a także w testach komórkowych in vitro10,11.
W niniejszym badaniu opisujemy kompleksową metodologię oceny zarówno funkcjonalnych, jak i strukturalnych skutków ubocznych związków na hiPSC-CMs. Metodologia obejmuje analizę siły skurczu i impedancji kardiomiocytów/potencjału pola zewnątrzkomórkowego (EFP). Siła skurczu jest mierzona w fizjologicznych warunkach mechanicznych, a komórki są hodowane na miękkich (33 kPa) podłożach silikonowych, odzwierciedlających środowisko mechaniczne rodzimej tkanki ludzkiego serca.
System jest wyposażony w 96-dołkowe płytki do wysokoprzepustowej analizy ludzkich iPSC-CM do przedklinicznych badań farmakologicznych i toksykologicznych bezpieczeństwa serca, co daje przewagę obecnie stosowanym metodom 3D, takim jak serce Langendorffa lub plastry serca12,13.
Szczegółowo, system hybrydowy składa się z dwóch modułów, albo do oceny kurczliwości serca w warunkach fizjologicznych, albo do analizy strukturalnej toksyczności komórkowej w czasie rzeczywistym6,14. Oba moduły współpracują ze specjalistycznymi płytkami 96-dołkowymi o wysokiej przepustowości w celu szybkiego i ekonomicznego pozyskiwania danych.
Bez potrzeby tworzenia konstrukcji 3D, moduł kurczliwości wykorzystuje specjalne płytki, które zawierają elastyczne membrany silikonowe jako podłoże dla komórek, zamiast sztywnego szkła lub plastiku, z których zwykle składają się zwykłe płytki do hodowli komórkowych. Membrany odzwierciedlają typowe dla człowieka właściwości biomechaniczne serca i dlatego naśladują warunki in vivo w sposób wysokoprzepustowy. Podczas gdy ludzkie iPSC-CM często nie wykazują zachowania dorosłych kardiomiocytów w odniesieniu do dodatniej inottropii indukowanej związkiem w innych testach komórkowych14, reakcję bardziej podobną do dorosłej można ocenić, gdy komórki są hodowane na płytkach modułu kurczliwości. W poprzednich badaniach wykazano, że iPSC-CM wykazują pozytywne działanie inotropowe po leczeniu związkami takimi jak izoproterenol, S-Bay K8644 lub omecamtiv mecarbil6,15. W tym miejscu można ocenić wiele parametrów kurczliwości, takich jak parametry podstawowe, takie jak amplituda siły skurczu (mN/mm2), czas trwania dudnień i szybkość dudnień, a także drugorzędne parametry cyklu skurczu, takie jak obszar pod krzywą, nachylenia skurczu i relaksacji, zmiany szybkości dudnień i arytmie (rysunek uzupełniający 1)16. Wywołane lekiem zmiany wszystkich parametrów są oceniane nieinwazyjnie za pomocą pojemnościowego wykrywania odległości. Surowe dane są następnie analizowane przez specjalistyczne oprogramowanie.
Moduł toksyczności strukturalnej dodaje swoje unikalne parametry impedancji i EFP jako odczyt dla strukturalnej toksyczności komórkowej i analizy właściwości elektrofizjologicznych17,18. Technologia spektroskopii impedancji elektrycznej ujawnia wywołane przez związki zmiany w gęstości komórek lub integralności komórek i monowarstw monitorowane w czasie rzeczywistym, jak pokazano w przypadku ludzkich iPSC-CM traktowanych znanymi związkami kardiotoksycznymi13. Dzięki odczytom impedancji przy różnych częstotliwościach (1-100 kHz) możliwa jest dalsza analiza reakcji fizjologicznej, a tym samym ujawnienie zmian w topografii błony, połączeniach komórka-komórka lub komórka-macierz. Dodatkowy zapis EFP ludzkich iPSC-CM umożliwia dalszą analizę efektów elektrofizjologicznych wywołanych przez leczenie związkiem, jak wykazano w świetle badania17,19.
W obecnym badaniu, zastosowano ludzkie iPSC-CMs, leczone epirubicyną i doksorubicyną, oba dobrze opisane jako kardiotoksyczne antracykliny, oraz erlotynib, inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI) o raczej niskim ryzyku toksyczności sercowo-naczyniowej. Przewlekłą ocenę epirubicyny, doksorubicyny i erlotynibu prowadzono przez 5 dni. Wynik pokazuje niewielkie zmiany w kurczliwości i impedancji zasadowej, gdy komórki były traktowane erlotynibem, ale zależny od czasu i dawki toksyczny spadek amplitudy skurczu i impedancji zasady po leczeniu odpowiednio epirubicyną i doksorubicyną. Ostre pomiary przeprowadzono za pomocą blokera kanału wapniowego nifedypiny i wykazały spadek amplitudy skurczu, czasu trwania potencjału pola i impedancji zasady, wykazując kardiotoksyczne skutki uboczne tego związku na poziomie funkcjonalnym i strukturalnym.

<table><tbody><tr><td>Komercyjne kardiomiocyty ludzkie pochodzące z iPSC&nbsp;</td><td>Wirówka Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>(probówki 50 ml)</td><td></td>12-kanałowa regulowana pipeta <td>Thermo Fisher Scientific</td> 15878722 <td></td></tr><tr><td>(100-1250 &mu; L)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS z Ca2+ i Mg2+</td><td>GE Healthcare HyClone</td><td>SH304264.01</td><td></td></tr><tr><td>96</td><td>płytka głębinowa Thermo Fisher Scientific</td><td>A43075</td><td></td></tr><tr><td>EHS żel</td><td></td><td></td><td>Żel do macierzy zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>FLEXcyte 96/CardioExcyte urządzenie hybrydowe</td><td>Nanion Technologies&nbsp;</td><td>19 1004 1005</td><td>Hybrydowy system analizy komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>FLX-96 FLEXcyte Płytki sensoryczne</td><td>Nanion Technologies</td><td>20 1010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Roztwór podstawowy fibronektyny (opcjonalnie dla Geltrex)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified, gotowy do użycia, o obniżonym czynniku wzrostu Podstawna membrana</td> membranowa <td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do powlekania i konserwacji ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC</td> Inkubator <td>FCDI</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>(37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51023121</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51032678</td><td></td></tr><tr><td>NSP-96 CardioExcyte 96 Płytki sensoryczne 2,0 mm przezroczyste</td><td>Nanion Technologies</td><td>20 1011</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1250&micro; L)</td><td>Integra Biosciences</td><td>94420813</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik odczynników</td><td>Integra Biosciences</td><td>8096-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna (np. 25 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16440901</td><td></td></tr><tr><td>Jednokanałowa pipeta regulowana (np. 100-1000 &mu; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>System zasysania próżni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567479</td><td></td></tr><tr><td>Opcjonalnie: VIAFLO ASSIST</td><td>Integra Biosciences</td><td>4500</td><td>Automatyzacja laboratoryjna Robot</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna (37 &deg; c)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15365877</td><td></td> Naukowy</tr></tbody></table>

hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z ipsc do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Ocena kurczliwości serca ma ogromne znaczenie dla rozwoju nowych terapii i ich bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych. Podczas gdy indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CM) mogą służyć jako model istotny dla człowieka w przedklinicznych fazach odkrywania leków i farmakologii bezpieczeństwa, ich dojrzałość jest nadal kontrowersyjna w środowisku naukowym i jest stale rozwijana. Przedstawiamy hybrydową technologię kurczliwości i impedancji/potencjału pola zewnątrzkomórkowego (EFP), dodając znaczące funkcje pro-dojrzewania do standardowej w branży platformy 96-dołkowej.
System impedancji/EFP monitoruje funkcjonalność sieci komórkowej w czasie rzeczywistym. Oprócz szybkości dudnienia komórek kurczliwych, odczyty spektroskopii impedancji elektrycznej wykrywają zmiany morfologiczne wywołane związkiem, takie jak gęstość komórek i integralność monowarstwy komórkowej. W drugim komponencie hybrydowego systemu analizy komórek komórki są hodowane na błonach biozgodnych, które naśladują środowisko mechaniczne prawdziwej tkanki serca. To środowisko fizjologiczne wspomaga dojrzewanie hiPSC-CM in vitro, prowadząc do bardziej podobnych do dorosłych reakcji skurczowych, w tym pozytywnych efektów inotropowych po leczeniu izoproterenolem, S-Bay K8644 lub omecamtiv mecarbil. Parametry takie jak amplituda siły skurczu (mN/mm2) i czas trwania dudnienia ujawniają również dalsze działanie związków mających wpływ na właściwości elektrofizjologiczne i obsługę wapnia.
System hybrydowy stanowi idealne narzędzie do holistycznej analizy komórek, umożliwiając przedkliniczną ocenę ryzyka sercowo-naczyniowego poza obecnymi perspektywami testów komórkowych istotnych dla człowieka.

Wpływ inhibitora kinazy erlotynibu na kurczliwość hiPSC-CMs przedstawiono na Rysunku 1. Komórki traktowano stężeniami w zakresie od 10 nM do 10 µM przez 5 dni, a parametry skurczów rejestrowano codziennie. Erlotynib, inhibitor EGFR (receptora epidermalnego czynnika wzrostu) i kinazy tyrozynowej o stosunkowo niskim ryzyku kardiotoksyczności, wykazał niewielki efekt zależny od dawki i czasu w odniesieniu do hiPSC-CMs jedynie przy stężeniach w zakresie mikromolarnym. Przy najniższym stężeniu (1...

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na przedkliniczne pytania związane z bezpieczeństwem kardiologicznym i toksycznością, wykorzystując rzeczywiste dane pochodzące z badań na ludziach w celu bezpiecznego przejścia nowych kandydatów na leki do etapów klinicznych. Zamiast stosowania zestawu różnych technik in vitro i in vivo, główną zaletą tego systemu hybrydowego jest jednoczesna ocena kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPC, parametrów elektrofizjologicznych i żywotności oraz analiza właściwości kurczliwych w warunkach fizjologicznych. Metoda ta może być stosowana do odkrywania leków, ponieważ obejmuje zmiany elektrofizjologiczne, strukturalne i kurczliwe kardiomiocytów oraz system o wyższej przepustowości, który pozwala na jednoczesne testowanie 69 studzienek.Aby rozpocząć powlekanie płyty, należy pozostawić dolną część płytki skurczowej przykrytą dodatkowo dostarczoną osłoną membranową do czasu pomiaru w module kurczliwości. Do wysiewu kardiomiocytów należy przygotować rozcieńczony roztwór do powlekania żelem EHS, przenosząc 2,75 mililitra gotowego do użycia roztworu żelu EHS i 8,25 mililitra DPBS z wapniem i magnezem w sterylnej probówce wirówkowej. Następnie wymieszaj roztwór.Zdejmij osłonę membrany z płytki skurczowej. Przygotowany roztwór powlekający przenieść do sterylnego zbiornika odczynnika w robocie automatyki laboratoryjnej. Skorzystaj z programu, dodaj 100 mikrolitrów za pomocą robota automatyzacji laboratoryjnej i dodaj 100 mikrolitrów roztworu powlekającego na studzienkę.Następnie umieść pokrywkę z powrotem na 96-dołkowej płytce i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu i policzeniu komórek dostosuj komórki w zalecanym podłożu galwanicznym zgodnie z instrukcjami producenta ogniw, co daje 11 razy od 10 do szóstych komórek na 11 mililitrów do wysiewu całej 96-dołkowej płytki. Użyj programu usuń 100 mikrolitrów, aby usunąć roztwór żelu EHS ze studzienek za pomocą robota automatyzującego laboratorium.Następnie przenieś 11 mililitrów zawiesiny komórek do sterylnego zbiornika odczynnika umieszczonego w robocie automatyzującym laboratorium i zasiej komórki 100 mikrolitrami zawiesiny na studzienkę. Za pomocą programu komórki dodają 100 mikrolitrów. Natychmiast po wysianiu komórek przenieś elastyczną 96-dołkową płytkę do inkubatora o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i pozwól komórkom osiąść na noc.Podgrzej 22 mililitry pożywki podtrzymującej kardiomiocyty, którą należy dodać do każdej płytki, do 37 stopni Celsjusza w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. 18 do 24 godzin po wysianiu płytek przenieś świeżą pożywkę do sterylnego zbiornika odczynnika i pozostaw ją obok robota automatyzującego laboratorium. Następnie wykonaj usuwanie pożywki za pomocą programu, usuń 100 mikrolitrów.Następnie umieść zbiornik odczynnika zawierający świeżą pożywkę w robocie automatyzacji laboratorium i dozuj 200 mikrolitrów świeżej pożywki na studzienkę za pomocą programu, dodaj 100 mikrolitrów. Wykonaj ten krok dwukrotnie, aby osiągnąć 200 mikrolitrów na studzienkę. Natychmiast po wymianie pożywki przenieść płytkę do inkubatora.Wykonuj wymianę pożywki co drugi dzień, aż do dodania mieszanki. Cztery do sześciu godzin przed dodaniem związku wykonaj ostateczną zmianę pożywki, przenosząc 22 mililitry świeżego i ciepłego buforu testowego do sterylnego zbiornika odczynnika i pozostawiając go obok robota automatyzującego laboratorium. Natychmiast po wymianie pożywki przenieś elastyczną płytkę z powrotem do inkubatora.Na godzinę przed pomiarem linii podstawowej przenieś płytkę do odpowiedniego urządzenia pomiarowego. W oprogramowaniu sterującym otwórz Edit Protocol i wybierz odpowiedni tryb pomiaru, Flex Site lub Impedancja EFP. Określ czas trwania lub długość przemiatania jednego pomiaru do 30 sekund i interwał powtarzania do 10 minut przed zapisaniem numeru protokołu.Następnie wybierz opcję Start Protocol (Uruchom protokół) i kontynuuj wypełnianie wymaganych pól. Po ustawieniu parametrów wybierz opcję Rozpocznij pomiar. Wykonaj co najmniej trzy pomiary podstawowe w odstępach pięciominutowych na krótko przed dodaniem mieszanki.Usunąć 50 mikrolitrów buforu testowego z każdej studzienki bez wyjmowania elastycznej 96-dołkowej płytki z urządzenia pomiarowego, a następnie dodać 50 mikrolitrów czterokrotnie stężonego roztworu związku do każdej studzienki płytki zgodnie z planem pomiaru. Po dodaniu związku wybierz opcję dodaj znacznik odczynnika, aby zdefiniować układ płytki związku i objętość roztworu związku. Następnie wybierz opcję Kontynuuj pomiar standardowy lub Kontynuuj serię pomiarów zgodnie z planem eksperymentalnym.Analiza reprezentatywna wykazała wpływ inhibitora kinazy erlotynibu na kurczliwość ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przy najniższym stężeniu erlotynib powodował statystycznie nieistotne zmniejszenie amplitudy, podczas gdy stężenia mikromolowe erlotynibu wykazywały działanie kardiotoksyczne zależne od czasu i dawki. Początek efektu obserwowano po 96 godzinach w przypadku jednego mikromolowego Erlotynibu, podczas gdy leczenie 10 mikromolowym Erlotynibem spowodowało znaczne zmniejszenie 24 godziny po dodaniu związku.Po zastosowaniu 10 mikromolowych epirubicyn komórki przestały bić w ciągu 24 godzin. Po zastosowaniu jednej mikromolowej epirubicyny drastyczny spadek amplitudy po 24 godzinach następował po całkowitym zaprzestaniu dudnienia do 48 godzin. Przy 100 nanomolach zaobserwowano zależny od czasu spadek amplitudy dudnień.Przy najniższym stężeniu 10 nanomolowców amplituda wahała się równomiernie, co potwierdza, że działanie epirubicyny było zależne tylko od dawki. Leczenie doksorubicyną i nifedypiną przez 24 godziny zmniejsza żywotność komórek w sposób zależny od stężenia i czasu. Po zastosowaniu rosnących stężeń nifedypiny, zapisy potencjału pola na komórkach ujawniają zależne od stężenia skrócenie czasu trwania pola znormalizowane.Ocena kurczliwości serca nifedypiny wykazała również znaczny spadek amplitudy zależny od stężenia po ostrym pomiarze przy stężeniach 10 nanomolowych i 13 nanomolowych. Należy pamiętać, że komórki są na ogół wrażliwe na parametry środowiskowe, takie jak zmiany temperatury i pH, a także symulację mechaniczną, która jest szczególnie wspierana na płytkach skurczowych.

hybrid-cell-analysis-system-to-assess-structural-contractile-changes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj pokazujemy generowanie ludzkiej tkanki serca z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów. Przedstawiono metodę analizy siły skurczu oraz przykładową zmianę wzorca skurczu przez inhibitor kanału hERG E-4031. Metoda ta wykazuje wysoki poziom odporności i przydatności do badań przesiewowych leków sercowych.

Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Spontanicznie kurczące się syncytia kardiomiocytów pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych są użytecznymi modelami ludzkiej fizjologii serca i farmakologii. Poniżej przedstawiamy wysokoprzepustowy system przesiewowy do ilościowego określania wpływu związków egzogennych na częstotliwość dudnienia, przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca i wielodołkowego czytnika płytek do obrazowania z kontrolowaną temperaturą.

Skurcze syncytii kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPSC mierzone za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca na płytkach 384-dołkowych o kontrolowanej temperaturze

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Prezentujemy model choroby niedokrwiennej serca za pomocą kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, wraz z metodą ilościowej oceny uszkodzeń tkanek spowodowanych niedokrwieniem. Model ten może stanowić użyteczną platformę do badań przesiewowych leków i dalszych badań nad chorobą niedokrwienną serca.

Model choroby niedokrwiennej serca i porównanie wideo skurczu kardiomiocytów przy użyciu kardiomiocytów pochodzących z hiPSC

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj hybrydowy system 96-well do analizy kurczliwości i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Ta metoda dostarcza danych w czasie rzeczywistym niezbędnych do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego leków.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego (Wideo) | JoVE Journal

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Przeglądaj więcej filmów