Name: Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj efektywną transfekcję mRNA in vitro w komórkach nabłonka oskrzelowego przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych. Ta metoda wspiera rozwój szczepionek śluzówkowych i terapii genowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, Grant nr 82041045 i 82173764), główny projekt Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chin, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) oraz Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Autorzy są wdzięczni dr Xiaoyanowi Dingowi za pomiar średnicy hydrodynamicznej (nm) i wskaźnika polidyspersyjności (PDI).

1. Transkrypcja in vitro chemicznie zmodyfikowanego mRNA
UWAGA: Wymagane jest używanie probówek, odczynników, szkła, końcówek do pipet, itp., ponieważ RNazy są wszechobecne w środowisku, takim jak roztwory laboratoryjne, powierzchnie instrumentów, włosy, skóra, kurz, itp. Wyczyść dokładnie powierzchnie stołu i pipety przed użyciem oraz załóż rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.
<ol>
	<li>Wykonaj linearyzację matrycy DNA.
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj otwartą ramkę odczytu (ORF) lucyferazy Metridia (MetLuc) otoczoną promotorem polimerazy T7, regionem 5' nieulegającym translacji (UTR), 3'UTR i ogonami poli (A) i sklonuj ją do wektora PUC57, który ulega ekspresji w bakteriach (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Sekwencja kodowania matrycy DNA znajduje się w pliku uzupełniającym 1.</li>
		<li>Hoduj bakterie, poddaj je lizie i oczyść plazmidowy DNA za pomocą odpowiedniej kolumny (patrz zestaw do ekstrakcji plazmidowego DNA w Tabeli materiałów).</li>
		<li>Przeprowadzić pojedynczą reakcję o objętości 50 μl, która zawiera 2 μl BamHI, 2 μl KpnI (patrz tabela materiałów) i 2 μg plazmidowego DNA w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i osiągnąć linearyzację matrycy DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj transkrypcję in vitro, aby wygenerować mRNA bez capped-IVT.
	<ol>
		<li>Przeprowadź syntezę mRNA w pojedynczej reakcji 20 μl przy użyciu zestawu transkrypcyjnego T7 i pseudourydyny (patrz tabela materiałów): 10 μl (0,8-1 μg) zlinearyzowanej matrycy DNA, 1,5 μl (150 mM) ATP, pseudo-UTP, GTP i CTP, 2 μl 10x buforu transkrypcyjnego, 1 μl enzymu T7 i 1 μl wody wolnej od nukleaz (woda NF). Dokładnie wymieszać wyżej wymienione składniki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń matrycę DNA.
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl (1 U) DNazy (wolnej od RNazy) po procesie transkrypcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić oczyszczanie mRNA bez osłonki IVT za pomocą wytrącania chlorku litu.
	<ol>
		<li>Oczyść nieosłonięte mRNA IVT za pomocą chlorku litu (patrz tabela materiałów) o stężeniu roboczym 10 mM. Dodać 50 μl 10 mM chlorku litu do 20 μl roztworu mRNA bez nakrętki IVT.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj całą objętość i schładzaj w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę. Zbieraj mRNA bez osłonki IVT przez 12 minut przy 12 000 x g, co rutynowo wytwarza 80-120 μg nieosłoniętego mRNA IVT z każdej pojedynczej reakcji o objętości 20 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj capping mRNA IVT.
	<ol>
		<li>Wykonaj capping mRNA IVT za pomocą systemu capping 1 (patrz Tabela materiałów). Krótko usunąć, wtórną strukturę 50 μg nieosłoniętego mRNA IVT, ogrzewając w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie połączyć koniec 5' mRNA bez osłonki IVT z czapeczką 1, którą przygotowuje się przez modyfikację struktury kapu m7G przy użyciu 2,5 μl s-adenozylometioniny (SAM) (20 mM) i 4 μl 2'-O-metylotransferazy (100 U) w reakcji 100 μl w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.</li>
		<li>Oczyść 100 μl zamkniętego mRNA IVT za pomocą 250 μl 10 mM chlorku litu i rozcieńczyć w 50 μl wody NF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ czystość i wielkość cząsteczkową mRNA z czapeczką IVT.
	<ol>
		<li>Zmierz stężenie mRNA z czapeczką IVT za pomocą spektrofotometru UV-visible. Używając markera RNA (patrz Tabela materiałów), przeanalizuj wielkość cząsteczkową mRNA z czapeczką IVT w 1% denaturującym formaldehyd żelu agarozowym zawierającym 18% formaldehydu (napięcie wynosi 120 V). Upewnij się, że mRNA bez osłonki IVT i mRNA z pokrywą IVT są przechowywane w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Uznano, że mRNA IVT ma dobrą czystość w stosunku A260/A280 1,8-2,1 i stosunku A260/A230 2,0 lub nieco wyższym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generacja mRNA/PP-sNp IVT
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy poloksaminy 704 (T704) przez solubilizację T704 (patrz Tabela materiałów) w wodzie NF w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: T704 zawiera strukturę w kształcie litery X wykonaną z centralnej grupy etylenodiaminy połączonej z czterema łańcuchami bloków poli(tlenku propylenu) (PPO) i bloków poli(tlenku etylenu) (PEO)24. Masa cząsteczkowa (Mw) T704 wynosi 5500.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy syntetycznego peptydu (sPep, patrz Tabela Materiałów) poprzez solubilizację sPep (sekwencja: KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE 
	RSMNFCG) w wodzie NF w celu otrzymania roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml i przechowywania w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór mRNA IVT, rozmrażając mRNA IVT (krok 1) na lodzie i krótko odwirowując przez 3 s przy 300 x g w temperaturze pokojowej przed otwarciem probówki. Rozcieńczyć roztwór mRNA IVT do 0,04 μg/μl NF-water. 
	UWAGA: Zaleca się pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, gdy tylko jest to możliwe, z mRNA IVT.</li>
	<li>Przygotować roztwór mieszaniny T704 i sPep, rozcieńczając roztwór sPep do 0,555 μg/μl, a roztwór T704 do 8 μg/μl wodą NF. Inkubować zmieszany roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed dalszym użyciem. 
	UWAGA: Oblicz wymagany składnik sPep na podstawie żądanego współczynnika N/P. Stosunek N/P to całkowita liczba reszt azotu (N) w sPep do całkowitej liczby ujemnie naładowanych grup fosforanowych (P) w mRNA IVT. Oblicz wymagany T704 na podstawie stosunku masy do masy (w/w) między T704 a mRNA IVT. Konieczne jest, aby stosunek N/P wynosił 5, a stosunek w/w wynosił 100.</li>
	<li>Przygotuj preparat mRNA/PP-sNp IVT, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Pobrać roztwór mRNA IVT (krok 3) do strzykawki o pojemności 1 ml, upewniając się, że w końcówce strzykawki nie ma szczelin powietrznych ani pęcherzyków powietrza. Załadować strzykawkę po jednej stronie wkładu obok obracającego się bloku.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem mieszanki T704 i sPep (krok 4). Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub szczeliny powietrzne na końcówce strzykawki i umieścić strzykawkę w drugim wlocie pompy (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Ustaw pompę na stosunek przepływu 1:1 i całkowite natężenie przepływu 4-10 ml/min. 
		UWAGA: Całkowite natężenie przepływu wynoszące 6 ml/min jest optymalne w prezentowanych tutaj badaniach.</li>
		<li>Umieścić stożkową probówkę o pojemności 10 ml wolną od RNaz (patrz tabela materiałów) w celu zebrania zmieszanego roztworu IVT-mRNA/PP-sNp na końcu ścieżki przepływu urządzenia mieszającego.</li>
		<li>Uruchom pompę, aby rozpocząć mieszanie, upewniając się, że parametry są prawidłowo wprowadzone. Po zakończeniu pracy pompy przez 6 s, pobrać próbkę IVT-mRNA/PP-sNp z rurki stożkowej. 
		UWAGA: PP-sNp zostały wygenerowane przy użyciu mieszalnika mikroprzepływowego (rysunek uzupełniający 1). Urządzenie składa się z pompy o stałym przepływie, urządzenia łączącego, układu scalonego i urządzenia stałego. W procesie mieszania pompa o stałym przepływie podłączona do wióra dostarcza ciecz do wióra zgodnie z ustawionym natężeniem przepływu. Podłączoną pompę o stałym przepływie można podłączyć do wielu kanałów wejściowych układu za pomocą jednego kanału wyjściowego. Elementy urządzenia, w tym chip, zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych i racjonalnie zmontowane (patrz tabela materiałów). Parametry, takie jak natężenie przepływu i objętość roztworu mRNA IVT i roztworu mieszanego T704-sPep, mogą różnić się od tych wyświetlanych w bieżącym protokole, jeśli używana jest inna konfiguracja i należy je odpowiednio zoptymalizować.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar średnicy hydrodynamicznej i polidyspersyjności IVT-mRNA/PP-sNp
<ol>
	<li>Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu mRNA/PP-sNp IVT (etap 2) wodą NF, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.</li>
	<li>Zmierz rozmiar hydrodynamiczny i wskaźnik polidyspersyjności (PDI) za pomocą półmikro kuwety25. Dodaj roztwór mRNA/PP-sNp IVT do kuwety i umieść go w mierniku wielkości cząstek (patrz tabela materiałów). Ustaw standardową procedurę operacyjną i kliknij Start, aby rozpocząć pobieranie danych.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek do transfekcji
<ol>
	<li>Płytki z ludzkimi komórkami nabłonka oskrzeli (16HBE) i linią komórek dendrytycznych (DC2.4) na płytkach 96-dołkowych o gęstości 3,5 x 104 komórek/dołk, 24 godziny przed transfekcją. Hoduj komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny/streptomycyny. 
	UWAGA: Ogniwa zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze (37 °C i 5% atmosferyCO2) przez 24 godziny, aby upewnić się, że komórki są zlewane w 60%-80% przed transfekcją.</li>
</ol>
5. Transfekcja hodowanych komórek
<ol>
	<li>Po usunięciu pożywki wzrostowej przemyć posiane komórki 0,2 ml/studzienkę 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 170 μl pożywki hodowlanej bez surowicy do każdego dołka zawierającego posiane kultury komórkowe.</li>
	<li>Dodawać kroplami preparat mRNA/PP-sNp zawierający 0,4 μg mRNA MetLuc (przygotowanego w kroku 2) w ilości 30 μl/basenik.</li>
	<li>Inkubować komórki z preparatem mRNA/PP-sNp IVT w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej w 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
	<li>Zastąp pożywkę do transfekcji 0,2 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. 
	UWAGA: Płodową surowicę bydlęcą podgrzewano w temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu inaktywacji.</li>
	<li>Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C i w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2 przez 24 godziny i zebrać supernatanty do wykrycia w każdym dołku.</li>
</ol>
6. Analiza skuteczności transfekcji komórek za pomocą testu Metridia lucyferazy (MetLuc)
<ol>
	<li>Oznaczyć supernatant z każdej studzienki pod kątem aktywności MetLuc przy użyciu substratu celenterazyny (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór do oznaczania, dodając 1x PBS do substratu coelenterazine (stężenie coelenterazine wynosi 15 mM).</li>
		<li>Wirować roztwór celelenterazyny przez 10 sekund w celu dokładnego wymieszania.</li>
		<li>Dodać 50 μl supernatantu (zebranego w kroku 5) do płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Ustawić czytnik mikropłytek (patrz tabela materiałów) tak, aby czas odczytu wynosił 1 000 ms przed dodaniem 30 μl roztworu coelenterazine (15 mM) do każdego dołka ręcznie lub przez automatyczne wstrzyknięcie.</li>
		<li>Kliknij Start, aby zmierzyć sygnał luminescencji natychmiast po dodaniu roztworu koelenkterazyny do supernatantu. 
		UWAGA: Sygnał luminescencji jest mierzony za pomocą czytnika mikropłytek, a jego aktywność jest wyrażana we względnych jednostkach światła. Wartości uzyskane ze studni transfekowanych PBS zostaną wykorzystane jako ślepe próby kontrolne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nature.com/collections/hcajdiajij">https://www.nature.com/collections/hcajdiajij</a> (2020).</li>
<li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).</li>
<li>Mulligan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+study+of+COVID-19+RNA+vaccine+BNT162b1+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults.</a> Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnologies+in+delivery+of+DNA+and+mRNA+vaccines+to+the+nasal+and+pulmonary+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa.</a> Nanomaterials. 12 (2), 226(2022).</li>
<li>Freyn, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-targeting%2C+nucleoside-modified+mRNA+influenza+virus+vaccine+provides+broad+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice.</a> Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines+confer+broad+neutralization+as+primary+or+booster+series+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice.</a> Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).</li>
<li>Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+for+infectious+diseases%3A+Principles%2C+delivery+and+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).</li>
<li>Kormann, M. S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li>
<li>Tavernier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+as+gene+therapeutic%3A+How+to+control+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression.</a> Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).</li>
<li>Walsh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+two+RNA-based+Covid-19+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).</li>
<li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).</li>
<li>Guan, S., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnologies+in+delivery+of+mRNA+therapeutics+using+nonviral+vector-based+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems.</a> Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).</li>
<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+pathways+of+RNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+the+messenger%3A+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li>
<li>Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).</li>
<li>Hajj, K. A., Whitehead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+translation%3A+Non-viral+materials+for+therapeutic+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 2, 17056(2017).</li>
<li>Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+vaccines%3A+Prospects+for+non-viral+delivery+of+mRNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).</li>
<li>Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+the+delivery+of+mRNA-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines.</a> Pharmaceutics. 12 (2), 102(2020).</li>
<li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li>
<li>Sahin, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+vaccine+BNT162b1+elicits+human+antibody+and+T%28H%291+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses.</a> Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).</li>
<li>Azzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immune+response+in+BNT162b2+COVID-19+vaccine+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients.</a> EBioMedicine. 75, 103788(2022).</li>
<li>Guan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide-poloxamine+nanoparticles+enable+in+vitro+and+in+vivo+genome+restoration+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis.</a> Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).</li>
<li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+self-assembling+DNA%2Fpoloxamine+nanospheres+for+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer.</a> Nucleic Acids Research. 32 (20), 159(2004).</li>
<li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+particle+size+distribution+in+turbid+solutions+by+dynamic+light+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54885(2017).</li>
<li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+lipid+nanoparticle+size+on+mRNA+vaccine+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity.</a> Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).</li>
<li>Suk, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+penetration+of+fresh+undiluted+sputum+expectorated+by+cystic+fibrosis+patients+by+non-adhesive+polymer+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles.</a> Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).</li>
<li>Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barriers+to+inhaled+gene+therapy+of+obstructive+lung+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review.</a> Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).</li>
<li>Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+production+of+particles%3A+Mechanism%2C+methodology%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications.</a> Small. 16 (9), 1904673(2020).</li>
<li>Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigations+on+optimizing+and+nebulization+of+IVT-mRNA+formulations+for+potential+pulmonary-based+alpha-1-antitrypsin+deficiency+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1281(2021).</li>
<li>Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+formulation+of+nanoparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 274, 120826(2021).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół nie tylko pozwala na opłacalną i szybką produkcję preparatów szczepionek mRNA IVT o określonych właściwościach, ale także oferuje możliwość dostosowania preparatu PP-sNp do określonych celów terapeutycznych, takich jak terapia genowa. Aby zapewnić pomyślne wytworzenie mRNA/PP-sNP IVT, sugeruje się zwrócenie szczególnej uwagi na kilka krytycznych kroków. Podczas pracy z mRNA należy zawsze pamiętać, że warunki wolne od RNaz powinny być utrzymywane przez cały proces, ponieważ mRNA IVT jest bardzo wraż...

Szczepienie zostało ogłoszone jako jedna z najskuteczniejszych interwencji medycznych mających na celu zmniejszenie zachorowalności i śmiertelności spowodowanej chorobami zakaźnymi1. Znaczenie szczepionek zostało udowodnione od czasu wybuchu epidemii choroby koronawirusowej w 2019 r. (COVID-19). W przeciwieństwie do tradycyjnej koncepcji wstrzykiwania inaktywowanych lub żywych, atenuowanych patogenów, najnowocześniejsze podejścia do szczepionek, takie jak szczepionki na bazie kwasów nukleinowych, koncentrują się na zachowaniu właściwości immunostymulujących docelowych patogenów przy jednoczesnym unikaniu potencjalnych problemów związanych z bezpieczeństwem związanych z konwencjonalnymi szczepionkami zawierającymi wirusa całego drobnoustroje lub szczepionkami na bazie bakterii. Zarówno szczepionki oparte na DNA, jak i RNA (tj. transkrybowanym in vitro informacyjnym RNA, mRNA IVT) wykazują potencjał profilaktyczny lub terapeutyczny przeciwko różnym chorobom, w tym chorobom zakaźnym i nowotworom2,3. Zasadniczo potencjał szczepionek opartych na kwasach nukleinowych odnosi się do ich produkcji, skuteczności i bezpieczeństwa4. Szczepionki te mogą być produkowane w sposób bezkomórkowy, co umożliwia opłacalną, skalowalną i szybką produkcję.
Pojedyncza szczepionka oparta na kwasie nukleinowym może kodować wiele antygenów, umożliwiając dotarcie do wielu wariantów wirusa lub bakterii przy zmniejszonej liczbie szczepień i wzmacniając odpowiedź immunologiczną przeciwko odpornym patogenom5,6. Poza tym, szczepionki oparte na kwasach nukleinowych mogą naśladować naturalny proces inwazji wirusa lub infekcji bakteryjnej, wywołując zarówno odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem limfocytów B, jak i T. W przeciwieństwie do niektórych szczepionek opartych na wirusach lub DNA, szczepionki oparte na mRNA IVT oferują ogromną przewagę pod względem bezpieczeństwa. Mogą one szybko eksprymować pożądany antygen w cytozolu i nie są zintegrowane z genomem gospodarza, co eliminuje obawy związane z mutagenezą insercji7. IVT-mRNA ulega automatycznej degradacji po udanej translacji, dzięki czemu kinetykę ekspresji białka można łatwo kontrolować8,9. Wysiłki firm/instytucji na całym świecie, katalizowane przez pandemię koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), umożliwiły wprowadzenie na rynek wielu rodzajów szczepionek. Technologia szczepionek opartych na mRNA IVT wykazuje ogromny potencjał i po raz pierwszy wykazała się wcześniej oczekiwanym sukcesem dzięki szybkiej konstrukcji i elastycznej zdolności do adaptacji do dowolnych docelowych antygenów w ciągu kilku miesięcy. Sukces szczepionek mRNA IVT przeciwko COVID-19 w zastosowaniach klinicznych nie tylko otworzył nową erę badań i rozwoju szczepionek mRNA IVT, ale także zgromadził cenne doświadczenie w szybkim rozwoju skutecznych szczepionek do radzenia sobie z ogniskami chorób zakaźnych10,11.
Pomimo obiecującego potencjału szczepionek mRNA IVT, skuteczne wewnątrzkomórkowe dostarczanie mRNA IVT do miejsca działania (tj. cytoplazmy) nadal stanowi główną przeszkodę12, szczególnie dla tych podawanych drogą powietrzną4. mRNA IVT jest z natury niestabilną cząsteczką o wyjątkowo krótkim okresie półtrwania (~7 h)13, co sprawia, że mRNA IVT jest wysoce podatne na degradację przez wszechobecną RNazę14. Limfocyty wrodzonego układu odpornościowego mają tendencję do pochłaniania rozpoznanego mRNA IVT w przypadku aplikacji in vivo. Co więcej, wysoka gęstość ładunku ujemnego i duża masa cząsteczkowa (1 x 104-1 x 106 Da) mRNA IVT upośledzają jego skuteczne przenikanie przez anionową dwuwarstwę lipidową błon komórkowych15. W związku z tym wymagany jest system dostarczania z pewnymi materiałami biofunkcjonalnymi, aby zahamować degradację cząsteczek mRNA IVT i ułatwić wychwyt komórkowy16.
Poza kilkoma wyjątkowymi przypadkami, w których nagie mRNA IVT zostało bezpośrednio wykorzystane do badań in vivo, różne systemy dostarczania są używane do przenoszenia mRNA IVT do terapeutycznego miejsca działania17,18. Wcześniejsze badania wykazały, że tylko kilka mRNA IVT jest wykrywanych w cytozolu bez pomocy systemu dostarczania19. Opracowano liczne strategie mające na celu poprawę dostarczania RNA dzięki ciągłym wysiłkom w tej dziedzinie, począwszy od kondensacji protaminy, a skończywszy na enkapsulacji lipidów20. Nanocząstki lipidowe (LNP) są najbardziej zaawansowane klinicznie spośród nośników mRNA, o czym świadczy fakt, że wszystkie zatwierdzone szczepionki mRNA COVID-19 do użytku klinicznego wykorzystują systemy dostarczania oparte na LNP21. Jednak LNP nie mogą pośredniczyć w skutecznej transfekcji mRNA, gdy preparaty są dostarczane drogą oddechową22, co znacznie ogranicza stosowanie tych preparatów w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej lub leczeniu chorób związanych z płucami, takich jak mukowiscydoza lub niedobór α1-antytrypsyny. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowatorskiego systemu dostarczania w celu ułatwienia skutecznego dostarczania i transfekcji mRNA IVT w komórkach związanych z drogami oddechowymi, aby rozwiązać tę niezaspokojoną potrzebę.
Potwierdzono, że system dostarczania samoorganizujących się nanocząsteczek peptyd-poloksamina (PP-sNp) może pośredniczyć w efektywnej transfekcji kwasów nukleinowych w drogach oddechowych myszy23. PP-sNp przyjmuje wielofunkcyjne podejście do projektowania modułowego, które może integrować różne moduły funkcjonalne z nanocząstkami w celu szybkiego przesiewania i optymalizacji23. Syntetyczne peptydy i elektrycznie obojętne amfifilowe kopolimery blokowe (poloksamina) w PP-sNp mogą spontanicznie oddziaływać z mRNA IVT, tworząc równomiernie rozmieszczone nanocząstki o zwartej strukturze i gładkiej powierzchni23. PP-sNp może poprawić efekt transfekcji genów cząsteczek mRNA IVT w hodowanych komórkach i drogach oddechowych myszy23. W niniejszym badaniu opisano protokół generowania PP-sNp zawierającego mRNA IVT, który koduje lucyferazy Metridia (MetLuc-mRNA) (<silna klasa = "xfig">Figura 1). W tym protokole wykorzystuje się kontrolowane i szybkie mieszanie za pomocą mikroprzepływowego urządzenia mieszającego, które wykorzystuje naprzemienną konstrukcję mieszania w jodełkę. Procedura jest łatwa do wykonania i pozwala na generowanie PP-sNp o bardziej jednolitych rozmiarach. Ogólnym celem produkcji PP-sNp za pomocą mieszalnika mikroprzepływowego jest wytworzenie PP-sNp do kompleksowania mRNA w dobrze kontrolowany sposób, umożliwiając w ten sposób wydajną i powtarzalną transfekcję komórek in vitro. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie, składanie i charakterystykę PP-sNp zawierającego MetLuc-mRNA.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>Takara</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>cap 1 system zamykania</td><td>Jinan</td><td>M082</td><td></td></tr><tr><td>Dendrytyczna linia komórkowa</td><td>Sigma</td><td>SCC142</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencja DNA</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli</td><td>Sigma</td><td>SCC150</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>Takara</td><td>1068</td><td></td></tr><tr><td>LP</td><td>Beyotime</td><td>C0533</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu</td><td>APEXBio</td><td>B6083</td><td></td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer Nano ZS90</td><td>Malvern</td><td>NB007605</td><td></td></tr><tr><td>Układ mikroprzepływowy</td><td>ZHONGXINQIHENG</td><td>Standardowy układ</td><td></td>PDMS</tr><tr><td>Czytniki mikropłytek</td><td>ThermoFisher</td><td>Varioskan lux</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W (A30221)</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pseudourydyna</td><td>APE&czasy; Bio</td><td>B7972</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Quanti-Luc</td><td>InvivoGen</td><td>Rep-qlc2</td><td></td></tr><tr><td>RiboRuler High Range RNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>SM1821</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa bez RNaz</td><td>Biosharp</td><td>BS-100-M</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemyx</td><td>Fusion 101</td><td></td></tr><tr><td>T7 zestaw do transkrypcji</td><td>Jinan</td><td>E131</td><td></td></tr></tbody></table>

wydajna transfekcja transkrybowanego mrna in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

Szczepionki z transkrybowanym informacyjnym RNA (mRNA) in vitro wykazały ogromny potencjał w walce z pandemią koronawirusa 2019 (COVID-19). Ze względu na delikatne właściwości mRNA szczepionki muszą być zawarte w wydajnych i bezpiecznych systemach dostarczania. Samoorganizujący się system dostarczania genów nanocząstek peptydowo-poloksaminowych (PP-sNp) został specjalnie zaprojektowany do dostarczania kwasów nukleinowych do płuc i wykazuje obiecujące możliwości w pośredniczeniu w udanej transfekcji mRNA. W tym miejscu opisano ulepszoną metodę przygotowania PP-sNp w celu wyjaśnienia, w jaki sposób PP-sNp otacza mRNA Metridia lucyferazy (MetLuc) i skutecznie transfekuje hodowane komórki. MetLuc-mRNA otrzymuje się w procesie transkrypcji in vitro z liniowej matrycy DNA. PP-sNp jest wytwarzany przez zmieszanie syntetycznego peptydu/poloksaminy z roztworem mRNA za pomocą mieszalnika mikroprzepływowego, co pozwala na samoorganizację PP-sNp. Ładunek PP-sNp jest następnie oceniany poprzez pomiar potencjału zeta. Tymczasem polidyspersyjność i rozmiar hydrodynamiczny nanocząstek PP-sNp są mierzone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Nanocząstki mRNA/PP-sNp są transfekowane do hodowanych komórek, a supernatanty z hodowli komórkowej są oznaczane pod kątem aktywności lucyferazy. Reprezentatywne wyniki wskazują na ich zdolność do transfekcji in vitro. Protokół ten może rzucić światło na rozwój systemów dostarczania szczepionek mRNA nowej generacji.

Plazmid rekombinowany poddano trawieniu w celu otrzymania zlinearyzowanej matrycy DNA (Rycyna 2A). Zgodnie z opisanym protokołem, zestaw do transkrypcji T7 in vitro pozwala na otrzymanie do 80-120 µg niekaptalkowanego MetLuc-mRNA z 20 µL reakcji oraz 50-60 µg kaptalkowanego MetLuc-mRNA z 100 µL reakcji. W analizie elektroforetycznej nienaruszony MetLuc-mRNA wysokiej jakości powinien wykazywać pojedynczy, wyraźny prążek, jak przedstawiono na Rycynie 2B. ...

Samoorganizująca się nanocząstka peptydu-poloksaminy (PP-sNp) jest rozwijana przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia mieszającego do kapsułkowania i dostarczania in vitro transkrybowanego informacyjnego RNA. Opisane mRNA/PP-sNp może skutecznie transfekować hodowane komórki in vitro.

Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

Nanocząstki peptydowo-poloksaminy są jednym z potencjalnych systemów dostarczania mRNA do płuc. Nasz protokół sprawia, że nanocząstki peptydowo-poloksaminowe mają wyższą produktywność i wydajność, co ułatwia opracowanie szczepionki mRNA błony śluzowej. Materiały wymagane przez tę technikę są tanie, a protokół można ukończyć w krótkim czasie.Nanocząstki peptydowo-poloksaminy mają zdolność pośredniczenia w efektywnej transfekcji mRNA. Nanocząstki peptydowo-poloksaminy wykazały udaną transfekcję mRNA w ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli, co implikuje dodatkowe zastosowania szczepionek przeciwko COVID-19 błony śluzowej, leczeniu raka płuc i terapii genowej mukowiscydozy. Oczekuję, że dana osoba będzie miała podstawową wiedzę w pokrewnej dziedzinie, z protokołem i wieloma technikami, zanim zacznie przeprowadzać eksperymenty.Po zsyntetyzowaniu otwartej ramki odczytu lucyferazy Metridia i sklonowaniu jej do wektora pUC57, przygotuj zlinearyzowaną matrycę DNA przy użyciu BamHI i KpnI w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przygotuj reakcję o objętości 20 mikrolitrów do syntezy mRNA przy użyciu zestawu do transkrypcji T7 i pseudourydyny, jak opisano w manuskrypcie. Dokładnie wymieszaj składniki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Następnie usuń drugorzędową strukturę 50 mikrogramów nieosłoniętego mRNA IVT, podgrzewając je w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Użyj systemu cappingu Cap 1 do cappingu mRNA IVT i przygotuj Cap 1, modyfikując strukturę czapu 7-metylopanozyny za pomocą S-adenozylometioniny i 2'O-metylotransferaz w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Zmierz stężenie zamkniętego mRNA IVT za pomocą spektrofotometru widzialnego w promieniowaniu UV.Za pomocą markera RNA przeanalizuj wielkość cząsteczki zamkniętego mRNA IVT w 1% denaturującym formaldehyd żelu agarozowym zawierającym 18% formaldehydu. Przygotować 10 miligramów na mililitr roztworu podstawowego poloksaminy 704, rozpuszczając T704 w wodzie wolnej od nukleaz. Przygotuj 2 miligramy na mililitr roztworu podstawowego peptydu, rozpuszczając peptyd w wodzie wolnej od nukleaz.Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozmrozić mRNA IVT na lodzie. Przed otwarciem probówki należy odwirować probówkę o sile 300 razy G przez trzy sekundy w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć roztwór mRNA IVT wodą wolną od nukleaz.Przygotuj roztwór mieszaniny T704 i syntetycznych peptydów, rozcieńczając roztwór T704 do ośmiu mikrogramów na mikrolitr stężenia, a syntetyczny roztwór peptydowy do stężenia 0,555 mikrograma na mikrolitr, odpowiednio wodą wolną od nukleaz. Inkubować zmieszany roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed dalszym użyciem. Pobrać roztwór mRNA IVT do jednomililitrowej strzykawki, unikając szczelin powietrznych lub pęcherzyków w końcówce strzykawki.Załadować strzykawkę po jednej stronie wkładu obok obracającego się bloku. Następnie napełnij jednomililitrową strzykawkę roztworem mieszanki T704 i syntetycznych peptydów i usuń wszelkie pęcherzyki lub szczeliny powietrzne na końcówce strzykawki. Umieścić strzykawkę w drugim wlocie pompy i ustawić pompę na całkowite natężenie przepływu od 4 do 10 mililitrów na minutę.Umieść dziesięciomililitrową stożkową rurkę wolną od RNaz, aby zebrać zmieszany roztwór mRNA / PP-sNp IVT na końcu ścieżki przepływu urządzenia mieszającego. Uruchom pompę, aby rozpocząć mieszanie, upewniając się, że parametry są prawidłowo wprowadzone. Po uruchomieniu pompy na sześć sekund pobrać próbkę mRNA/PP-sNp IVT ze stożkowej probówki.Umieść ludzkie komórki nabłonka oskrzeli i linię komórek dendrytycznych na 96-dołkowych płytkach 24 godziny przed transfekcją. Hoduj komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną streptomycyną. Po usunięciu pożywki wzrostowej umyj platerowane komórki 0,2 mililitra na studzienkę PBS.Dodać 170 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez surowicy do każdej studzienki zawierającej posiane kultury komórkowe. Następnie dodaj 30 mikrolitrów preparatu mRNA / PP-sNp IVT zawierającego 0,4 mikrograma mRNA lucyferazy Metridia kroplami do każdej studzienki. Inkubuj komórki z preparatem mRNA/PP-sNp IVT w wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.Odessać pożywkę do transfekcji i dodać 0,2 mililitra świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% streptomycyną penicyliny. Inkubować transfekowane komórki przez 24 godziny, jak wykazano wcześniej, i zebrać supernatanty, które mają być wykryte z każdej studzienki. Przygotować świeży roztwór do oznaczania, dodając PBS do substratu celenterazyny.Dokładnie wymieszaj roztwór, wirując przez 10 sekund. Dodać 50 mikrolitrów zebranego supernatantu do płytki 96-dołkowej. Ustawić czytnik mikropłytek z czasem odczytu wynoszącym 1 000 milisekund i dodać 30 mikrolitrów roztworu coelenterazine do każdej studzienki ręcznie lub przez automatyczne wstrzyknięcie.Natychmiast po dodaniu roztworu koelenterazyny do supernatantu należy kliknąć przycisk Start, aby zmierzyć sygnał luminescencji. Rekombinowany plazmid wyizolowano i strawiono w celu wytworzenia zlinearyzowanej matrycy DNA. Transkrypcja in vitro wytworzyła mRNA MetLuc z upcapem i capedem.Komórki transfekowane mRNA Metridia lucyferazy / PP-sNp wykazywały znacznie wyższą ekspresję lucyferazy w porównaniu z komórkami transfekowanymi komercyjnie dostępnym odczynnikiem do transfekcji na bazie lipidów, nagim mRNA lucyferazy Metridia, syntetycznymi peptydami PBS lub T7044, mieszanym roztworem w ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli, 16 HBE i dendrytyczną linią komórkową DC2.4 Metridia lucyferazy mRNA/PP-sNp wykazywały wyższą ekspresję lucyferazy niż LP.co sugeruje, że system dostarczania PP-sNp jest ważny dla ochrona mRNA MetLuc przed degradacją oraz promowanie skuteczności transfekcji egzogennego mRNA lucyferazy Metridia. Upewnij się, że syntetyczna struktura niezamkniętego Met-mRNA została pomyślnie usunięta. Dokładnie oblicz i pobierz Met-mRNA T704 i związek peptydowy, aby przygotować i zagęścić nanocząstki poloksaminy.Transmisyjna mikroskopia elektronowa może być wykonywana w celu obserwacji morfologii nanocząstek peptyd-poloksamina. Technika ta pomaga naukowcom w opracowywaniu szczepionek mRNA błony śluzowej i umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe preparatów terapii genowej dla każdej spokrewnionej komórki.

efficient-transfection-vitro-transcribed-mrna-cultured-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowano system inżynieryjnych nanonośników na bazie żelatyny typu B (GENS) do systemowego dostarczania genów i transfekcji w leczeniu raka trzustki. Dzięki modyfikacji powierzchni nanocząstek specyficznym peptydem do receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), nanonośniki te mogą celować w receptor EGFR i uwalniać plazmid w środowisku redukującym, takim jak wysokie wewnątrzkomórkowe stężenia glutationu.

Terapeutyczna dostawa genów i transfekcja w ludzkich komórkach raka trzustki z wykorzystaniem nanocząstek żelatynowych celowanych w receptor epidermalnego czynnika wzrostu

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Obecny protokół opisuje metodę odwrotnej politransfekcji embrionalnych komórek macierzystych myszy podczas hodowli za pomocą pożywki 2i i LIF. Metoda ta zapewnia wyższą żywotność i wydajność niż tradycyjne protokoły transfekcji do przodu, a jednocześnie umożliwia jednoetapową optymalizację proporcji plazmidów.

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Poznaj efektywną transfekcję mRNA in vitro w komórkach nabłonka oskrzelowego przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych. Ta metoda wspiera rozwój szczepionek śluzówkowych i terapii genowych.

Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

Przeglądaj więcej filmów