Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

Nanocząstki peptydowo-poloksaminy są jednym z potencjalnych systemów dostarczania mRNA do płuc. Nasz protokół sprawia, że nanocząstki peptydowo-poloksaminowe mają wyższą produktywność i wydajność, co ułatwia opracowanie szczepionki mRNA błony śluzowej. Materiały wymagane przez tę technikę są tanie, a protokół można ukończyć w krótkim czasie.

Nanocząstki peptydowo-poloksaminy mają zdolność pośredniczenia w efektywnej transfekcji mRNA. Nanocząstki peptydowo-poloksaminy wykazały udaną transfekcję mRNA w ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli, co implikuje dodatkowe zastosowania szczepionek przeciwko COVID-19 błony śluzowej, leczeniu raka płuc i terapii genowej mukowiscydozy. Oczekuję, że dana osoba będzie miała podstawową wiedzę w pokrewnej dziedzinie, z protokołem i wieloma technikami, zanim zacznie przeprowadzać eksperymenty.

Po zsyntetyzowaniu otwartej ramki odczytu lucyferazy Metridia i sklonowaniu jej do wektora pUC57, przygotuj zlinearyzowaną matrycę DNA przy użyciu BamHI i KpnI w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Przygotuj reakcję o objętości 20 mikrolitrów do syntezy mRNA przy użyciu zestawu do transkrypcji T7 i pseudourydyny, jak opisano w manuskrypcie. Dokładnie wymieszaj składniki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Następnie usuń drugorzędową strukturę 50 mikrogramów nieosłoniętego mRNA IVT, podgrzewając je w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Użyj systemu cappingu Cap 1 do cappingu mRNA IVT i przygotuj Cap 1, modyfikując strukturę czapu 7-metylopanozyny za pomocą S-adenozylometioniny i 2'O-metylotransferaz w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Zmierz stężenie zamkniętego mRNA IVT za pomocą spektrofotometru widzialnego w promieniowaniu UV.

Za pomocą markera RNA przeanalizuj wielkość cząsteczki zamkniętego mRNA IVT w 1% denaturującym formaldehyd żelu agarozowym zawierającym 18% formaldehydu. Przygotować 10 miligramów na mililitr roztworu podstawowego poloksaminy 704, rozpuszczając T704 w wodzie wolnej od nukleaz. Przygotuj 2 miligramy na mililitr roztworu podstawowego peptydu, rozpuszczając peptyd w wodzie wolnej od nukleaz.

Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozmrozić mRNA IVT na lodzie. Przed otwarciem probówki należy odwirować probówkę o sile 300 razy G przez trzy sekundy w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć roztwór mRNA IVT wodą wolną od nukleaz.

Przygotuj roztwór mieszaniny T704 i syntetycznych peptydów, rozcieńczając roztwór T704 do ośmiu mikrogramów na mikrolitr stężenia, a syntetyczny roztwór peptydowy do stężenia 0,555 mikrograma na mikrolitr, odpowiednio wodą wolną od nukleaz. Inkubować zmieszany roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed dalszym użyciem. Pobrać roztwór mRNA IVT do jednomililitrowej strzykawki, unikając szczelin powietrznych lub pęcherzyków w końcówce strzykawki.

Załadować strzykawkę po jednej stronie wkładu obok obracającego się bloku. Następnie napełnij jednomililitrową strzykawkę roztworem mieszanki T704 i syntetycznych peptydów i usuń wszelkie pęcherzyki lub szczeliny powietrzne na końcówce strzykawki. Umieścić strzykawkę w drugim wlocie pompy i ustawić pompę na całkowite natężenie przepływu od 4 do 10 mililitrów na minutę.

Umieść dziesięciomililitrową stożkową rurkę wolną od RNaz, aby zebrać zmieszany roztwór mRNA / PP-sNp IVT na końcu ścieżki przepływu urządzenia mieszającego. Uruchom pompę, aby rozpocząć mieszanie, upewniając się, że parametry są prawidłowo wprowadzone. Po uruchomieniu pompy na sześć sekund pobrać próbkę mRNA/PP-sNp IVT ze stożkowej probówki.

Umieść ludzkie komórki nabłonka oskrzeli i linię komórek dendrytycznych na 96-dołkowych płytkach 24 godziny przed transfekcją. Hoduj komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną streptomycyną. Po usunięciu pożywki wzrostowej umyj platerowane komórki 0,2 mililitra na studzienkę PBS.

Dodać 170 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez surowicy do każdej studzienki zawierającej posiane kultury komórkowe. Następnie dodaj 30 mikrolitrów preparatu mRNA / PP-sNp IVT zawierającego 0,4 mikrograma mRNA lucyferazy Metridia kroplami do każdej studzienki. Inkubuj komórki z preparatem mRNA/PP-sNp IVT w wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Odessać pożywkę do transfekcji i dodać 0,2 mililitra świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% streptomycyną penicyliny. Inkubować transfekowane komórki przez 24 godziny, jak wykazano wcześniej, i zebrać supernatanty, które mają być wykryte z każdej studzienki. Przygotować świeży roztwór do oznaczania, dodając PBS do substratu celenterazyny.

Dokładnie wymieszaj roztwór, wirując przez 10 sekund. Dodać 50 mikrolitrów zebranego supernatantu do płytki 96-dołkowej. Ustawić czytnik mikropłytek z czasem odczytu wynoszącym 1 000 milisekund i dodać 30 mikrolitrów roztworu coelenterazine do każdej studzienki ręcznie lub przez automatyczne wstrzyknięcie.

Natychmiast po dodaniu roztworu koelenterazyny do supernatantu należy kliknąć przycisk Start, aby zmierzyć sygnał luminescencji. Rekombinowany plazmid wyizolowano i strawiono w celu wytworzenia zlinearyzowanej matrycy DNA. Transkrypcja in vitro wytworzyła mRNA MetLuc z upcapem i capedem.

Komórki transfekowane mRNA Metridia lucyferazy / PP-sNp wykazywały znacznie wyższą ekspresję lucyferazy w porównaniu z komórkami transfekowanymi komercyjnie dostępnym odczynnikiem do transfekcji na bazie lipidów, nagim mRNA lucyferazy Metridia, syntetycznymi peptydami PBS lub T7044, mieszanym roztworem w ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli, 16 HBE i dendrytyczną linią komórkową DC2.4 Metridia lucyferazy mRNA/PP-sNp wykazywały wyższą ekspresję lucyferazy niż LP.co sugeruje, że system dostarczania PP-sNp jest ważny dla ochrona mRNA MetLuc przed degradacją oraz promowanie skuteczności transfekcji egzogennego mRNA lucyferazy Metridia. Upewnij się, że syntetyczna struktura niezamkniętego Met-mRNA została pomyślnie usunięta. Dokładnie oblicz i pobierz Met-mRNA T704 i związek peptydowy, aby przygotować i zagęścić nanocząstki poloksaminy.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa może być wykonywana w celu obserwacji morfologii nanocząstek peptyd-poloksamina. Technika ta pomaga naukowcom w opracowywaniu szczepionek mRNA błony śluzowej i umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe preparatów terapii genowej dla każdej spokrewnionej komórki.