In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D

Protokół ten może zapewnić innym badaczom bezpośrednie i skuteczne podejścia eksperymentalne oraz szczegółowe kroki w celu oceny skuteczności odpowiedzi komórkowej nowych adiuwantów szczepionkowych. Nie tylko dostarcza naukowcom konkretnych metod oceny komórkowej adiuwantów, ale może również rozkładać metody ekstrakcji, takie jak choroba BM. Protokoły te nie tylko wykazują brak toksyczności i wysokie dostarczanie komórek, ale także zapewniają szczegółowe procedury oceny adiuwantów.

Na początek włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Następnie po zebraniu probówki z zamrożonymi komórkami L929 z ciekłego azotu, szybko rozmrozić w łaźni wodnej. Po pipetowaniu komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów, dodaj dwa mililitry DMEM i dobrze wymieszaj.

Odwirować próbki o masie 129 x g przez pięć minut. A po odrzuceniu supernatantu dodaj dwa mililitry DMEM, aby ponownie zawiesić komórki. Ponownie odwirować próbki.

A po odrzuceniu supernatantu dodaj sześć mililitrów kompletnej pożywki DMEM do ponownego zawieszenia i przenieś do kolby hodowlanej T25 centymetrów kwadratowych w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla do hodowli przez 48 godzin. W 24 dniu po pierwszym szczepieniu wyjmij myszy z pomieszczenia dla zwierząt, umieść je w szklanym naczyniu i moczyć w 75% alkoholu przez pięć minut. Umieść probówki wirówkowe na stojaku na probówki wirówkowe, ponumeruj jednorazowe szalki Petriego i dodaj pięć mililitrów PBS do każdej szalki Petriego za pomocą 10-mililitrowej pipety.

Wykonaj sześcio- lub ośmiocentymetrowe nacięcie nożyczkami na środku lewej brzusznej strony myszy. Rozerwij skórę, aby odsłonić ścianę brzucha i zlokalizuj długi czerwony pasek śledziony. Następnie podnieś otrzewną po dolnej stronie śledziony za pomocą kleszczy.

Rozetnij go i obróć do góry, aby odsłonić śledzionę. Podnieś śledzionę za pomocą kleszczy. Oddziel tkankę łączną pod śledzioną nożyczkami okulistycznymi i usuń śledzionę.

Umieścić śledzionę na szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów PBS i zmielić za pomocą sitka i tłoka strzykawki. Po zmieleniu przenieś płyn do 15-mililitrowej probówki wirówkowej za pomocą pipety zgodnie z numeracją. Następnie odwirować płyn o sile 453 x g przez pięć minut.

A po odrzuceniu supernatantu dodaj trzy mililitry buforu do lizy czerwonych krwinek do każdej probówki. Ponownie zawiesić komórki i lizować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie dodaj od 10 do 12 mililitrów PBS do każdej probówki.

Po wymieszaniu i odwirowaniu przy 453 x g przez pięć minut, wyrzucić supernatant i dodać 10 mililitrów PBS do każdej probówki wirówkowej i ponownie zawiesić komórki. Pobrać 20 mikrolitrów każdej próbki do dołka na płytce do liczenia komórek i zapisać liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie odwirować próbki o masie 453 x g przez pięć minut.

A po odrzuceniu supernatantu rozcieńczyć do 2,5 x 10 do szóstych komórek na mililitr pożywką RF10 i dodać do 96-dołkowej płytki w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę. Wytnij nożyczkami sześcio- do ośmiocentymetrowego nacięcia poniżej brzucha myszy i zaciśnij dwa końce otworu, aby oddzielić go w różnych kierunkach i odsłonić nogi myszy. Oddziel kość udową myszy od ciała myszy i kość piszczelową od stawu.

I utrzymuj kości w stanie nienaruszonym na obu końcach. Następnie usuń resztki tkanki i chrząstki ze stawów stawowych na obu końcach kości udowej za pomocą nożyczek i kleszczy. Namocz kości udowe w 75% alkoholu przez pięć minut, a następnie zanurz się w sterylnym roztworze PBS, aby zmyć alkohol z powierzchni.

Następnie odetnij końce kości udowych nożyczkami i przepłucz szpik kostny na sterylnej szalce Petriego sterylnym roztworem PBS, a następnie odessaj strzykawką o pojemności jednego mililitra. Powtórz pranie trzy do pięciu razy. Następnie przefiltruj przez sito komórkowe i zbierz komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Po odwirowaniu próbek o sile 290 x g przez pięć minut, odrzucić supernatant i dodać cztery mililitry buforu do lizy czerwonych krwinek, ponownie zawiesić i poddać lizie w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodać 10 mililitrów sterylnego roztworu PBS, aby zneutralizować lizat, a po odwirowaniu przy 290 x g przez pięć minut odrzucić supernatant. Zawiesić komórki w jednym mililitrze DMEM zawierającym 1% roztwór penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej i policzyć.

Następnie do pożywki dodać czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów oraz interleukinę-4. Dostosuj stężenie komórek do 5 x 10 do jednej piątej na mililitr i zaszczep komórki na szkiełkach nakrywkowych. Po dodaniu zawiesiny komórkowej do sześciodołkowej płytki w ilości dwóch mililitrów na studzienkę, umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 48 godzin.

Całkowicie zmień podłoże po dwóch dniach i zmień połowę podłoża po czterech dniach. Po eutanazji zanurz myszy w 75% alkoholu i umieść je twarzą do góry na szklanej szalce Petriego w ponumerowanej kolejności. Przełóż myszy przez okienko transferowe do sterylnej sali operacyjnej i umieść je na stole operacyjnym na pięć minut.

Za pomocą strzykawki odessać 10 mililitrów soli fizjologicznej. Przechylić myszy w dół pod kątem około 45 stopni i wstrzyknąć w środek jamy brzusznej. Pobrać około pięciu mililitrów zawiesiny komórkowej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej na każde 10 mililitrów i powtórzyć wstrzyknięcie trzy razy.

Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 129 x g przez pięć minut, aby uzyskać pierwotne makrofagi otrzewnowej myszy. Fibroblasty L929 są użytecznym modelem przesiewowym do badania toksyczności in vitro NOD. Kwantyfikacja poziomów cytokin zapalnych w śledzionie może pomóc naukowcom lepiej zrozumieć odpowiedź immunologiczną.

Monitorowanie cytotoksycznych limfocytów T za pomocą immunopunktu enzymatycznego jest złotym standardem w ocenie odporności limfocytów T specyficznej dla antygenu w badaniach klinicznych oraz w badaniach przesiewowych kandydatów na szczepionki. Zwiększony wychwyt antygenu przez komórki dendrytyczne może wywołać wzmocnione adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne. Makrofagi odgrywają ważną rolę w prezentowaniu antygenów limfocytom T, a także w indukowaniu innych komórek prezentujących antygen do ekspresji cząsteczek kostymulujących, inicjując w ten sposób adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne.

Ogromne znaczenie ma izolacja komórek w stosunku działania leku do działania komórki.