Name: Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Naucz się szybkiego zliczania jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowanego do mikrobiomu Drosophila. Ta zautomatyzowana metoda oferuje stukrotną przewagę czasową nad tradycyjnymi technikami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper i członkowie laboratorium Ludington wnieśli cenny wkład w rozwój tego protokołu. Finansowanie zostało zapewnione przez 2032985 grantowy NSF IOS, grant DP5OD017851 NIH, grant Carnegie Institution of Canada oraz Carnegie Institute for Science's Endowment.

1. Kolonizacja much
UWAGA: Ta metoda jest odpowiednia do analizy ilościowej muszek z kulturowym mikrobiomem jelitowym poprzez posiewanie wzrostu CFU. Szczegółowy protokół hodowli much gnotobiotycznych został wcześniej opublikowany12.
<ol>
	<li>Ustanowić stabilną kolonizację przez komensalny gatunek bakterii.
	<ol>
		<li>Przygotować świeżą kulturę bakteryjną, osad przez odwirowanie przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS do OD600 1,0. W tym protokole Lactiplantibacillus plantarum (wcześniej znany jako Lactobacillus plantarum) wyhodowano w ciągu nocy do OD600 wynoszącego 2,0.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl na żywność w fiolce na muchy (patrz tabela materiałów). Rozprowadź równomiernie i pozostaw płyn do wchłonięcia przez 15-30 minut.</li>
		<li>Przenieś 20 wolnych od zarazków much do tej fiolki, używając standardowej techniki przewracania fiolki na fiolkę34. Każda mucha zje mniej więcej równą ilość dawki bakteryjnej35. Alternatywnie można dodać jaja wolne od zarazków.</li>
		<li>Przenoś muchy do świeżej, sterylnej żywności codziennie przez 3 dni. Zrób to wszystko w komorze bezpieczeństwa biologicznego i użyj sterylnej techniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed pomiarem obciążenia CFU przenieś muchy do fiolki zawierającej sterylną wodę agarową na 4 godziny, aby usunąć przejściowe bakterie z jelit. Fiolki z wodą agarową stanowią źródło wilgoci dla muchy, ale nie stanowią pożywienia dla muchy ani bakterii na powierzchni. Są one przygotowywane w tych samych sterylnych fiolkach na muchy, co w przypadku standardowej żywności, ale zawierają tylko wodę dejonizowaną i 1,5% agaru.</li>
</ol>
2. Homogenizacja muszek pojedynczo na 96-dołkowej płytce PCR
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej talerze do ubijania koralików.
	<ol>
		<li>Wlej szklane koraliki 0,5 μm (patrz Tabela materiałów) na tackę do pomiaru koralików (wydrukowaną w 3D za pomocą dodatkowego pliku kodowania 1 S1-bead-measurer.stl). Rozłóż koraliki na tacy, aby wszystkie dołki były pełne i równe, a następnie zetrzyj nadmiar koralików do stożkowej tuby, aby je odzyskać.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR z półspódniczką (patrz Tabela materiałów) do góry nogami na tacy miarowej i wyrównaj ją z dołkami, dopasowując ją do wgłębienia na tacy miarowej. Następnie szybko odwróć go, aby przenieść koraliki.</li>
		<li>Usuń nadmiar koralików z powierzchni płytki PCR i przykryj ją folią. Sprawdź płytkę PCR, aby upewnić się, że wszystkie studzienki zawierają koraliki. W razie potrzeby użyj miarki do ważenia, aby dodać koraliki do jednego dołka. Jeśli elektryczność statyczna powoduje przywieranie kulek do powierzchni płytki, przetrzyj lub spryskaj tylną część tacki pomiarowej i płytki PCR 70% etanolem.</li>
		<li>Przykryj folią aluminiową. W ten sposób można przygotować wiele płytek, a następnie sterylizować w autoklawie i przechowywać do późniejszego wykorzystania. Gdy będzie gotowy do użycia, dodaj 100 μl PBS do każdego dołka za pomocą 96-kanałowego pipetora (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed homogenizacją wysterylizuj powierzchniowo muchy skolonizowane przez drobnoustroje (patrz krok 1) 70% etanolem.
	<ol>
		<li>Znieczulij muchy 100% CO2 przez 5 s. Przenieś znieczulone muchy z fiolki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą małego lejka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A-2). W tym badaniu zwykle dodawano 25 much na rurkę.</li>
		<li>Natychmiast rozpyl ~1 ml 70% etanolu do probówki, zamknij probówkę i mieszaj przez odwrócenie przez 10 s. Następnie odessaj etanol za pomocą pipety P1000, uważając, aby nie zassać żadnych much. Powtórz jeszcze raz z etanolem, a następnie dwa razy ze sterylnym PBS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ostatnim umyciu PBS zamknij rurkę i nakrętką skierowaną w dół postukaj nią kilka razy mocno w ławkę, aby muchy weszły do nasadki.</li>
	<li>Otwórz probówkę i wlej muchy do studzienek za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-4). Umieść po jednej muchy w każdej studzience (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-5). Podczas ładowania trzymaj talerz na lodzie, aby muchy były znieczulone.</li>
	<li>Uszczelnij płytę za pomocą folii termozgrzewalnej Thermal Bond (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Najpierw usuń wszelkie zabłąkane koraliki, które znajdują się w pobliżu studzienek, ponieważ mogą one spowodować wyciek z uszczelki foliowej. Upewnij się, że matowa strona folii jest skierowana w dół na płycie, a błyszcząca strona do góry w kierunku zgrzewarki. Mocno dociśnij zgrzewarkę (patrz Tabela materiałów) przez 5 sekund (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-6). Polerowanie za pomocą aplikatora ręcznego (patrz Tabela materiałów), aby zabezpieczyć folię. 
		UWAGA: Słabe uszczelnienie jest przyczyną utraty próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabezpiecz płytkę w wytrząsarce do płyt. Homogenizuj przez 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-7). Obracaj płytkę stopki przez 30 s w mini-wirówce do płytek (patrz tabela materiałów) na poziomie 350 x g, aby usunąć płyn z folii uszczelniającej.</li>
	<li>Usuń folię, trzymając płytkę, aby nie rozpryskiwać kropelek homogenatu muchowego z dołków.</li>
</ol>
3. Seryjne rozcieńczanie homogenatu muchowego i plamienie na płytkach CFU
<ol>
	<li>Umieść cztery prostokątne płytki do wzrostu agaru MRS (patrz Tabela materiałów) w komorze bezpieczeństwa biologicznego i zdejmij ich pokrywki. W tym protokole agar MRS został użyty do wzrostu L. plantarum. Pozostaw te płytki do wyschnięcia na co najmniej 10 minut (20 minut, jeśli są świeżo wylane lub schłodzone z przechowywania). 
	UWAGA: Jeśli płytki są mokre, kropelki z płytki 96-dołkowej spłyną razem i zrujnują liczenia.</li>
	<li>Przygotować trzy płytki rozcieńczające, dodając 100 μl PBS do każdego dołka sterylnej płytki 96-dołkowej za pomocą pipetora 96-kanałowego. Załaduj stojak z końcówkami P20 do 96-kanałowego pipetora.</li>
	<li>Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:10, odsysając 11,1 μl homogenatu z płytki próbki przygotowanej w sekcji 2 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A-8). Pamiętaj, aby rysować od środka studzienek, a nie od dna studzienek, ponieważ homogenat muchy i szklane kulki zatkają pipety. Koraliki toną, a cząstki much unoszą się na wodzie, pozostawiając środkową warstwę w większości przezroczystą.</li>
	<li>Dozować 11,1 μl do pierwszej płytki rozcieńczającej, która zawiera już 100 μl sterylnego PBS na studzienkę. Trzymać płytkę rozcieńczającą na wytrząsarce płytowej przez 10 s przy 600 obr./min. Wymieszać ponownie, pipetując w górę i w dół przez pięć cykli. Przenieść 11,1 μl z pierwszej płytki rozcieńczającej na drugą płytkę rozcieńczającą i powtórzyć etapy mieszania dla dwóch następnych płytek rozcieńczających.</li>
	<li>Wykonać posiewy seryjne z rozcieńczeniami, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Wyjmij płytki wzrostowe z szafy bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Zaczynając od najbardziej rozcieńczonej płytki, naniec 2 μl z każdej studzienki na płytki agarowe za pomocą pipety 96-dołkowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A-9).
		<ol>
			<li>Powoli opuść głowicę pipety na płytkę, uważając, aby nie wbić się w agar. Dokładnie sprawdź płytkę i upewnij się, że wszystkie plamki zostały dozowane; jeśli nie, ręcznie dodaj 2 μl w odpowiednie miejsce. Sprawdź, czy plamy płynu szybko wsiąkają w agar i nie spływają razem.</li>
			<li>Jeśli plamy biegną razem, wysusz nowy zestaw świeżych płytek agarowych przez dłuższy czas i powtórz plamienie. Jeśli istnieje wiele rodzajów płytek (np. z różnymi podłożami lub z antybiotykami), należy je również wykryć. Dozuje pozostały roztwór z powrotem do płytki rozcieńczającej i przejść do następnego wyższego stężenia. 
			UWAGA: W przypadku punktowych rozcieńczeń należy wymieszać następne rozcieńczenie pięć razy, aby upewnić się, że zawartość końcówek pipet została oczyszczona z poprzedniego rozcieńczenia. Płytki rozcieńczające można przechowywać >8 godzin w temperaturze 4 °C bez wpływu na liczbę kolonii35.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć proces powlekania zgodnie z opisem w kroku 3.5 dla pozostałych płytek rozcieńczających, przechodząc od najbardziej rozcieńczonych do najbardziej skoncentrowanych, aż do płytki z oryginalnym homogenatem.</li>
	<li>Gdy cały płyn zostanie wchłonięty przez agar, odwróć płytki i umieść je w inkubatorze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-10). Dla Lactiplantibacillus i Acetobacter z Drosophila optymalna temperatura wynosi 30 °C na pożywkach MRS. Inkubuj, aż kolonie osiągną optymalną wielkość: kolonie są wystarczająco duże, aby je wyraźnie zobaczyć, ale nie na tyle duże, aby łączyły się lub przeszkadzały sobie nawzajem we wzroście (patrz reprezentatywne wyniki w celu ilościowego określenia optymalnej wielkości). 
	UWAGA: Optymalne warunki wzrostu są zależne od odmiany i muszą być określone empirycznie. Dla Lactiplantibacillus z Drosophila optymalny czas inkubacji wynosi od 26 h do 30 h na agarze MRS. W przypadku Acetobacter z Drosophila optymalny czas inkubacji wynosi od 30 h do 48 h na MRS w zależności od szczepu.</li>
	<li>Po inkubacji, w razie potrzeby, przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do liczenia.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja CFU
<ol>
	<li>Określ ilościowo CFU, fotografując płytki, a następnie licząc kolonie za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania, jak opisano poniżej. Jeśli płytki były przechowywane w temperaturze 4 °C, najpierw pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową, aby nie doszło do kondensacji na płytach, która powoduje odblaski.</li>
	<li>Uporządkuj płyty w logicznej kolejności i utrzymuj je w tej kolejności podczas fotografowania — ułatwia to nazywanie plików. Ustaw wszystkie płytki tak, aby komórka A1 znajdowała się w lewym górnym rogu wszystkich płyt. Zaleca się oznaczenie narożnika A1 unikalnym identyfikatorem, aby upewnić się, że zdjęcia nie zostaną pomylone. Ułóż każdą serię rozcieńczeń w kolejności.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę talerza i umieść talerz na stoliku z A1 zorientowanym we właściwym rogu. Dołączone są projekty pudełka na zdjęcia płyt (plik uzupełniający 1, plik uzupełniający 2), który jest zoptymalizowany pod kątem fotografowania tych płyt tacowych i zawiera opcje oświetlenia i filtrów do obrazowania kolonii fluorescencyjnych.</li>
	<li>Wyobraź sobie płyty. Użyj aparatu (patrz Tabela materiałów) z ustawieniami ręcznymi, aby uzyskać stały poziom ekspozycji między płytami. Zalecane jest ustawienie długiej ogniskowej, aby zminimalizować zniekształcenia perspektywy. Zrób zdjęcie za pomocą zdalnej migawki, aby zminimalizować rozmycie spowodowane drganiami aparatu.</li>
	<li>Przenieś obrazy do komputera i zmień ich nazwy, w tym nazwę eksperymentu, rodzaj podłoża, współczynnik rozcieńczenia i wszelkie inne istotne szczegóły. Niektóre systemy operacyjne (patrz Spis materiałów) mają przydatną funkcję zmiany nazw wsadowych w Finderze poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy wybranych plików.</li>
</ol>
5. Automatyczne liczenie kolonii za pomocą zestawu Count-On-It (Plik uzupełniający 3)
<ol>
	<li>Przytnij obrazy za pomocą dostarczonej wtyczki Croptacular (Supplemental Coding File 2) dla ImageJ. Ta wtyczka pomaga podzielić obraz na uporządkowaną tablicę podregionów (np. 8 x 12 dla płytki 96-dołkowej). Podregiony będą liczone indywidualnie. 
	UWAGA: Osobna wtyczka do liczenia okrągłych tabliczek o nazwie Circus jest opisana w Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm.
	<ol>
		<li>Uporządkuj obrazy do przetworzenia w celu oceny ilościowej w folderze. Wybierz nazwy plików, które odróżniają płyty, ponieważ te nazwy plików stają się tytułami kolumn dla każdego zestawu zliczeń. W tym folderze utwórz podfoldery o nazwach "przycięte" i "paragony" .</li>
		<li>Uruchom Croptacular i kliknij OK, aby rozpocząć przycinanie. 
		UWAGA:Wyświetlane są ustawienia domyślne, które zwykle są wystarczające. W zależności od rozdzielczości obrazu, oświetlenia, rozmiaru plamki itp., pomocne może być dostosowanie parametrów bazowych.</li>
		<li>Jeśli obraz jest już prosty, po prostu naciśnij spację. W przeciwnym razie wyprostuj obraz, rysując linię wzdłuż krawędzi, która powinna stać się pozioma. Przerysuj linię tyle razy, ile to konieczne, jeśli obraz nadal nie wygląda na wyprostowany.</li>
		<li>Następnie narysuj pole graniczne obszaru, dla którego ma zostać wykonane liczenie. Dostosuj rozmiar i proporcje, aż wszystkie plamki znajdą się w swoich komórkach. Przeciągnij kursor poza obwiednię, aby odświeżyć siatkę. Gdy siatka wygląda dobrze, naciśnij Spacja.</li>
		<li>Upewnij się, że następny obraz automatycznie obraca się pod tym samym kątem, co pierwszy; wtyczka zakłada, że wszystkie zdjęcia są wyrównane tak samo. Jeśli to prawda, naciśnij spację, aby kontynuować. W przeciwnym razie wyprostuj obraz jak poprzednio. Siatka również przywołuje tę samą pozycję, co na poprzednim obrazie; W razie potrzeby dostosuj, a następnie naciśnij Spacja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wylicz kolonie na płytkach za pomocą dołączonej wtyczki Count-On-It: Gridiron dla ImageJ (Supplemental Coding File 4). Szczegółowe instrukcje dotyczące instalacji i korzystania z wtyczki znajdują się w Pliku Uzupełniającym 3.
	<ol>
		<li>Uruchom Count-On-It > Gridiron. Użyj tych samych ustawień siatki, co w przypadku Croptacular. Użytkownicy mogą grupować cały folder, analizować pojedynczy obraz lub zaczynać od bieżącego obrazu.</li>
		<li>Ustaw próg na podstawie górnej i dolnej wartości intensywności pikseli. Ustaw próg tak rygorystycznie, jak to możliwe, jednocześnie wybierając wszystkie kolonie. Idealnie byłoby, gdyby między wybranymi koloniami była pewna przestrzeń, ale oprogramowanie jest w stanie do pewnego stopnia segmentować plamy. Kliknij OK w oknie dialogowym "Wymagane działanie", gdy próg jest zadowalający.</li>
		<li>Aby sprawdzić wyniki, powiększ i przyjrzyj się dokładniej liczbie kolonii. Kliknięcie przycisku Anuluj spowoduje przerwanie działania wtyczki. Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.</li>
		<li>Na pierwszym obrazie upewnij się, że dostępna jest opcja kontynuowania lub powrotu do menu ustawień, na przykład w celu zmiany minimalnego rozmiaru kolonii. Aby kontynuować proces wsadowy, kliknij przycisk OK. Następnie wybierz folder, w którym chcesz przechowywać tabelę paragonów i wyników. Użyj folderu "paragony" lub utwórz nowy folder.</li>
		<li>Po pierwszym obrazie następne obrazy będą domyślnie ustawione na ten sam próg, co poprzednie ustawienia. Kliknij przycisk OK, aby użyć tych ustawień lub je dostosować. Jeśli zdjęcia są spójne, a ustawienie jest dokładne, kliknij OK w oknie dialogowym "Wymagane działanie". 
		UWAGA: Gdy wszystkie obrazy w partii zostaną ukończone, tabela wyników zostanie automatycznie zapisana w tym samym folderze, co paragony.</li>
		<li>Przejrzyj paragony inwentaryzacyjne generowane przez oprogramowanie i ręcznie skoryguj wszelkie błędy liczenia. Wtyczka ImageJ jest statystycznie dokładna, ale zdarzają się błędy. Sprawdzaj paragony, aby badać wartości odstające i identyfikować błędy w liczeniu. Oprogramowanie zapisuje dane CFU jako plik .csv w tym samym folderze, co paragony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą preferowanego przez użytkownika oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+in+a+bacterial+world%2C+a+new+imperative+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li>
<li>Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exclusive+metabolic+niche+enables+strain+engraftment+in+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota.</a> Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).</li>
<li>Taur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+domination+and+the+risk+of+bacteremia+in+patients+undergoing+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+in+quantitative+human+gut+microbiome+profiles+and+implications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research.</a> Nature Communications. 12 (1), 6740(2021).</li>
<li>D'hoe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+culturing%2C+modeling+and+transcriptomics+uncovers+complex+interactions+and+emergent+behavior+in+a+three-species+synthetic+gut+community%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community.</a> eLife. 7, 2892(2018).</li>
<li>Ludington, W. B., Ja, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the gut microbiome.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398(2020).</li>
<li>Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+of+diverse+Drosophila+species%3A+Ecological+context+of+a+host-microbe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system.</a> PLoS Genetics. 7 (9), 1002272(2011).</li>
<li>Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+establishes+a+species-specific+mutualistic+interaction+with+stable+gut-colonizing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005710(2018).</li>
<li>Adair, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+among-species+variation+in+microbiome+composition+in+drosophilid+flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies.</a> The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).</li>
<li>Koyle, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster+under+axenic+and+gnotobiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54219(2016).</li>
<li>Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiomes+as+modulators+of+Drosophila+melanogaster+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease.</a> Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).</li>
<li>Grenier, T., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+commensal+microbes+shape+the+physiology+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster.</a> Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).</li>
<li>Broderick, N. A., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+microbes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster.</a> Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).</li>
<li>Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitation+of+microbiota+abundance+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples.</a> Microbiome. 6 (1), 110(2018).</li>
<li>Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+association+of+a+Drosophila-derived+microbiota+with+its+animal+partner+and+the+nutritional+environment+throughout+a+fly+population%27s+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+homeostasis+by+the+homeobox+gene+caudal+and+commensal-gut+mutualism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila.</a> Science. 319 (5864), 777-782 (2008).</li>
<li>Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+fast+method+for+determining+colony+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple and fast method for determining colony forming units.</a> Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).</li>
<li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li>
<li>Newell, P. D., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+determine+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+nutrient+allocation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).</li>
<li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Fadrosh, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+dual-indexing+approach+for+multiplexed+16S+rRNA+gene+sequencing+on+the+Illumina+MiSeq+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform.</a> Microbiome. 2 (1), 6(2014).</li>
<li>Vega, N. M., Ludington, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+a+parts+list+to+assembly+instructions+and+an+operating+manual%3A+How+small+host+models+can+re-write+microbiome+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory.</a> Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).</li>
<li>Sundarraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+interactions+dampen+pairwise+competition+in+the+zebrafish+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome.</a> mBio. 11 (5), 1-15 (2020).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+animal+models+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).</li>
<li>Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+structure+follows+simple+assembly+rules+in+microbial+microcosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms.</a> Nature Ecology & Evolution. 1, 0109(2017).</li>
<li>Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+plate+method+for+bacterial+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spiral plate method for bacterial determination.</a> Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).</li>
<li>Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+single+plate-serial+dilution+spotting+%28SP-SDS%29+with+sample+anchoring+as+an+assured+method+for+bacterial+and+yeast+cfu+enumeration+and+single+colony+isolation+from+diverse+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples.</a> Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).</li>
<li>Nuñez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost+and+open+source+multi-fluorescence+imaging+system+for+teaching+and+research+in+biology+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering.</a> PLoS One. 12 (11), 0187163(2017).</li>
<li>Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+automatically+count+bacterial+colony+forming+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit.</a> Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila.+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila. A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).</li>
<li>Dodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+niche+regulates+stable+association+of+a+multispecies+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Obadia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+invasion+underlies+natural+gut+microbiome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability.</a> Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).</li>
<li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLoS Biology. 15 (3), 2000633(2017).</li>
<li>Jaime, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+WAFFL+system+for+treating+and+monitoring+individual+Drosophila+melanogaster+adults%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+internal+and+external+bacterial+load+during+Drosophila+aging+without+life-span+trade-off%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off.</a> Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tutaj szczegółowe techniki umożliwiają >100-krotne zwiększenie liczby próbek, które można ocenić w eksperymencie zliczania CFU. Technika ta rozwija istniejące metody eksperymentów mikrobiomowych u Drosophila 12,35,36 poprzez wykorzystanie formatu 96-dołkowej płytki do oznaczania pojedynczych muszek. Ponadto stosuje bardziej wydajną metodę powlekania punktowego 19,31 oraz zautomatyzowany przepływ pracy z platformą fotograficzną i zliczania kolonii. Znaczenie tej metody dla Drosophila polega na standaryzacji eksperymentów do formatu płytki 96-dołkowej, co umożliwia jednoczesną obsługę dużej liczby kontrprób biologicznych z automatyzacją w celu osiągnięcia wysokoprzepustowej kwantyfikacji CFU.
Platforma 96-dołkowa pokazuje, że zwiększona częstotliwość transferu i "oczyszczanie" przejściowych bakterii powoduje znaczne zmniejszenie zarówno średniej liczebności, jak i zmienności między próbkami (Figura 1B, C), co dowodzi rygorystyczności tego ulepszonego protokołu. Jednym z ograniczeń much żyjących w jednym pomieszczeniu jest poziomy transfer bakterii między muchami. Proponowanym rozwiązaniem jest trzymanie much pojedynczo w formacie 96-dołkowej płytki, takiej jak Whole Animal Feeding Flat38.
Chociaż nie zaobserwowano znacznego zmniejszenia obciążenia bakteryjnego, gdy muchy były myte w etanolu, muchy te były trzymane w obecności bakterii zewnętrznych tylko przez 3 dni. Przetrzymywanie przez dłuższy czas może pozwolić na akumulację większego obciążenia bakteryjnego39. Dlatego nadal zaleca się mycie w etanolu.
Przeniesienie much do płytki 96-dołkowej jest krytycznym pierwszym krokiem do skonfigurowania przepływu pracy (rysunek 1A). Po umyciu much rozprowadza się je pojedynczo do studni. Wykres płytowy jest przydatny na tym etapie, aby zanotować, jakie warunki występują w każdym dołku i dodać wszelkie notatki, takie jak "mucha została utracona". Homogenizacja to kolejny krytyczny krok z kilkoma ważnymi zastrzeżeniami. Bakterie przeżywają proces homogenizacji w obecności muchy (ryc. 1D,E) i przypuszczalnie zasada ta jest również prawdziwa, gdy bakterie znajdują się w jelicie muchy. Jednak bakterie są również zabijane, gdy są homogenizowane w samych płytkach do ubijania, co pokazuje, że homogenizacja może zabić komórki bakteryjne w pewnych okolicznościach, co może być ważne, jeśli na przykład homogenizuje się wypreparowane jelita. Warto zauważyć, że utrata CFU podczas homogenizacji zależy od liczby CFU w próbce, a strata jest minimalna, gdy stosuje się ~105 CFU na studzienkę. Dalsze zachowanie CFU można osiągnąć, zatrzymując homogenizację w połowie i schładzając płytkę na lodzie.
Homogenizacja była wykonywana przez 5 minut w tym protokole w oparciu o eksperymenty kontrolne, w których znana liczba CFU została zmieszana z muchą wolną od zarazków, co zadziałało empirycznie w przypadku bakterii muchowych. Mniejsze dudnienie powodowało obecność większych części muchy, co zakłócało pipetowanie, podczas gdy znacznie dłuższy czas homogenizacji wynoszący ~10 minut sprawił, że liczba CFU była bardziej zróżnicowana. Zaobserwowano, że mniejsza objętość i kątowy kształt stożkowych studzienek płytkowych zmniejszają efektywność ubijania kulek w porównaniu z cylindrycznymi probówkami o pojemności 2 ml. Możliwych jest wiele wariantów tego ogólnego podejścia, w tym szczepy bakterii, który pojemnik do bicia koralików, które koraliki i jaki genotyp muchy są używane. Indywidualne przypadki użytkowników muszą korzystać z kontroli pozytywnych, aby ustalić swoje podejście.
Metodę posiewu punktowego zastosowano w specyficzny sposób: rozcieńczenia 1:2 L . plantarum WF w PBS namierzono na płytki MRS i inkubowano w temperaturze 30 °C przez 2 dni (można zastosować krótsze czasy inkubacji w celu uzyskania mniejszych rozmiarów kolonii). Metoda ta wymaga pewnych początkowych inwestycji w sprzęt, przede wszystkim ubijak do kulek i pipet 96-kanałowy (rysunek 2A), który jest niezbędny zarówno w przypadku serii rozcieńczeń, jak i powlekania punktowego. Dostępne są jednak tańsze opcje, w tym 96-dołkowy replikator płytkowy z kołkami szczelinowymi. Seria rozcieńczeń jest krytycznym krokiem, który wpływa na dokładność wyników zliczania CFU. Jeśli chodzi o tryby awaryjne, możliwe jest zatkanie końcówek pipet częściami muchowymi lub szklanymi kulkami, a końcówki pipet nie uszczelniają się prawidłowo na pipetorze lub ulegają uszkodzeniu z innego powodu. Wszystkie te problemy powodują niedoszacowanie dotkniętych odwiertów i powinny być monitorowane. Kluczowe znaczenie ma również odpowiednie mieszanie na każdym etapie serii rozcieńczania. Każde rozcieńczenie należy dokładnie wymieszać, umieszczając płytkę na wytrząsarce do płytek lub pipetując w górę i w dół 15-20 razy, co służy również do przepłukania końcówek. Poprzez nacieranie od najbardziej rozcieńczonej do najmniej rozcieńczonej płytki, końcówki mogą być ponownie użyte w całej serii rozcieńczeń. Przy rozcieńczeniach 1:2 liczenie jest dokładne w zakresie 2-25 kolonii, obejmującym rząd wielkości (rysunek 2C). Dlatego rozcieńczenia 1:10 oszczędzają czas i materiały. Inną zmienną, którą można wykorzystać, jest czas inkubacji, który można dostosować tak, aby wytwarzał mniejsze kolonie, a tym samym zwiększał zakres policzalnych miejsc, zapobiegając łączeniu się sąsiednich kolonii.
Wysokiej jakości zdjęcie płyty jest niezbędne, ponieważ staje się ono surowymi danymi źródłowymi, na podstawie których analizowane są CFU i mogą być archiwizowane w nieskończoność. FluoroBox przeznaczony jest do wykonywania zdjęć płytek o jednolitym natężeniu światła, co minimalizuje odblaski na powierzchni agaru. Dodatkowo konstrukcja jest w stanie selektywnie fotografować kolonie fluorescencyjne za pomocą jednokolorowych diod LED i kolorowych filtrów fotograficznych (ryc. 3A). Konstrukcja zestawu takiego jak FluoroBox, z kontrolowanym oświetleniem i ustawieniami kamery, może znacznie zwiększyć powtarzalność obrazów CFU, co jest ważne dla automatycznej analizy. Morfologie kolonii, intensywność fluorescencji oraz wpływ czasu lub gęstości na wzrost kolonii to tylko niektóre z właściwości, które można analizować za pomocą zdjęć. Pudełko na zdjęcia można zbudować bez kolorowych filtrów i jednokolorowych świateł, jeśli nie są używane bakterie fluorescencyjne, co zmniejsza koszty i złożoność. Inne lampki wzbudzenia i filtry emisyjne mogą być zastąpione tymi zalecanymi tutaj, jeśli laboratorium używa innego fluoroforu. Aparat, który jest połączony z tabletem przez Wi-Fi za pomocą aplikacji, jest przydatny zarówno ze względu na funkcję automatycznej migawki, aby zapobiec drganiom, jak i ułatwić przesyłanie danych. Obrazy można przesyłać do tabletu, a następnie do laptopa za pomocą oprogramowania do bezprzewodowego przesyłania plików. Zalecane kamery z tymi możliwościami są wskazane w Tabeli materiałów.
Count-On-It to wtyczka napisana w ImageJ. Zautomatyzowane oprogramowanie do liczenia CFU dzieli obraz płytki na jednolitą 96-dołkową siatkę, zlicza kolonie w każdej komórce siatki i grupuje wyniki w prostym arkuszu kalkulacyjnym. Ponieważ zawsze występują różnice w położeniu siatki punktowej na płycie i na zdjęciu, użytkownik musi ręcznie dostosować siatkę do zdjęcia za pomocą wtyczki Croptacular. Pomaga to również wykluczyć obszary w pobliżu krawędzi płyty, które są odblaskami. Ustawienie progu jest kluczem do uzyskania najdokładniejszej liczby CFU na obrazie. Jeśli próg zostanie ustawiony zbyt wysoko, kolonie połączą się; Jeśli próg zostanie ustawiony zbyt nisko, rodziny zostaną wykluczone. Po ustawieniu progu makro stosuje rozmycie gaussowskie w celu zmiękczenia krawędzi i zmniejszenia aliasingu, filtr zlewiska dzieli nakładające się kolonie, a plamy są zliczane przy użyciu analizowania cząstek. 
Czasami zagęszczenie kolonii jest zbyt duże w danym miejscu. Count-On-It zapewnia sposób na poradzenie sobie z tym. Aby oszacować liczbę kolonii w komórce siatki z częściowo połączonymi koloniami, najpierw przyjmuje się średnią powierzchnię okrągłej plamy z całej płytki jako średnią C. Następnie obszar plamy A1 jest dzielony przez średnią powierzchnię okrągłej plamy A1/Cśredniej. Ta liczba jest zaokrąglana do najbliższej liczby całkowitej i jest to szacunkowa liczba kolonii w plamie. Ta funkcja jest jednym z powodów, dla których próg może mieć wpływ na wyniki zliczania: względna średnia powierzchnia kolonii w porównaniu z scalonym obszarem blob będzie się różnić w zależności od tego, jak próg wpłynął na scalone plamy.
Przedstawione metody mają kilka ograniczeń. Należą do nich m.in. konieczność posiadania sprzętu do dokładnego dozowania płynnych mediów z płytek 96-dołkowych. To wyposażenie, zarówno 96-kanałowy pipetor, jak i narzędzie do replikatora z rowkiem, może kosztować tysiące dolarów. Istnieją tańsze alternatywy, ale są mniej dokładne. Automatyczne liczenie za pomocą Count-On-It również wiąże się z pewnymi ograniczeniami. Na przykład, jeśli dwa typy kolonii w populacji mieszanej zostały rozdzielone na podstawie samego rozmiaru, zliczanie kropelek nie byłoby w stanie przypisać kolonii do odpowiedniego typu. W takim przypadku miejsca z plamami musiałyby zostać wyeliminowane z liczenia. Dalsze różnicowanie kolonii na podstawie morfologii byłoby cennym rozszerzeniem metody, która nie jest obecnie stosowana. Stosowanie selektywnych pożywek, w tym specyficznych dla szczepu składników odżywczych i antybiotyków, upraszcza potrzebę złożonej analizy obrazu.
Utrzymywanie eksperymentów z muszkami owocowymi na 96-dołkowych płytkach zwielokrotnia liczbę próbek i warunków, które można przetestować w jednym eksperymencie, i może ułatwić wysokoprzepustowe badania przesiewowe w fenotypach asocjacji bakterii Drosophila. Przewidujemy, że metodę tę można rozszerzyć o zastosowanie selektywnych pożywek do różnicowania wielu szczepów bakterii w złożonych mieszaninach. Metoda nie ogranicza się do badania mikrobiomu much. Kwantyfikacja CFU jest powszechna w wielu zastosowaniach mikrobiologii, od liczby bakterii z grupy coli w wodzie pitnej po identyfikację patogenów. Przedstawiony tutaj system powlekania CFU umożliwia przeprowadzanie przesiewów o wysokiej przepustowości, a także zautomatyzowane pozyskiwanie, przetwarzanie, przechowywanie i dostarczanie wyników.

Związek między mikrobiotą jelitową a ich zwierzęcym gospodarzem jest coraz częściej na pierwszym planie badań biologicznych1, które pokazują, że skład szczepu mikrobiomu jest ważny dla fizjologii gospodarza2,3,4. Tempo odkrywania zostało ograniczone przez czynniki zakłócające, takie jak wysoka naturalna zmienność międzyosobnicza i duża różnorodność kolonizujących bakterii5,6,7. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, okazała się obiecującym modelem ze względu na naturalnie niski poziom mikrobiomu, łatwość obsługi i solidną genetykę gospodarza8,9,10,11. Muchy mogą być wolne od zarazków i ponownie powiązane ze zdefiniowaną mikrobiotą12, i wykazano, że flora wpływa na cechy fizjologiczne muchy13,14. Flora wrodzona składa się z ograniczonego zestawu bakterii, z których wszystkie są zdolne do hodowli, a ich bliscy krewni są również endogenni dla jelit ssaków, w tym pałeczki kwasu mlekowego, proteobakterie i enterokoki15.
Badanie wpływu mikrobiomu na cechy gospodarza wymaga ilościowego określenia mikrobiomu zarówno pod względem obecnych gatunków, jak i ich bezwzględnej liczebności16. Dominującymi sposobami analizy mikrobiomu muchy są liczba jednostek tworzących kolonie (CFU)17, sekwencjonowanie amplikonów genu 16S rRNA9 oraz qPCR genu 16S rRNA18. Liczbę CFU można uzyskać bez drogich odczynników, które potwierdzają żywotność komórek bakteryjnych19. Techniki 16S, w tym qPCR, mają tę zaletę, że tożsamość taksonomiczną drobnoustrojów można ustalić bez względu na ich wymagania dotyczące wzrostu lub morfologię kolonii20.
W przypadku, gdy eksperymenty wykorzystują muchy o zdefiniowanym mikrobiomie znanych bakterii (muchy gnotobiotyczne), zliczanie CFU ma szczególne zalety w porównaniu z sekwencjonowaniem21. Sekwencjonowanie jest kosztowne, wymaga ekstrakcji DNA, przygotowania biblioteki opartej na PCR i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu uzyskania względnej obfitości22. Ze względu na wysokie koszty, metody sekwencjonowania o wysokiej przepustowości zazwyczaj muszą być wykonywane zbiorczo, aby obniżyć cenę za próbkę23. Dalsze metody, takie jak qPCR, są wymagane do uzyskania bezwzględnych obfitości16. W przeciwieństwie do tego, liczenie CFU jest szybkie i tanie i daje bezwzględną liczbę żywotnych komórek. Drosophila8 i inne modele małych mikrobiomów24, w tym robak, Caenorhabditis elegans25,26, oraz larwa danio pręgowanego, Danio rerio, uprawiana gnotobiobiotycznie27, mają ograniczony zakres bakterii, które mają znane cechy wzrostu28. W takich przypadkach, szczególnie w przypadku zwierząt gnotobiotycznych, liczenie CFU może rozróżnić wszystkie gatunki bakterii w wielogatunkowych zbiorowiskach jelitowych21,27,29. Metody liczenia CFU o wyższej przepustowości jeszcze bardziej poprawiłyby opłacalność i szybkość pomiaru składu mikrobiomu i mogłyby być stosowane w wielu innych eksperymentach mikrobiologicznych.
Liczenie CFU poprzez seryjne rozcieńczanie zawiesiny bakteryjnej na pożywce na bazie agaru jest standardową metodą w całej dziedzinie mikrobiologii. Kolonie, które rosną na płytkach, są następnie liczone ręcznie. Rozcieńczenia pozwalają badaczowi wybrać gęstość kolonii, która jest policzalna (np. ~100 CFU na płytkę), co oznacza, że kolonie nie wrastają jedna w drugą i można je policzyć w rozsądnym czasie. Większość mikrobiologów stosuje zasadniczo tę samą metodę liczenia CFU, która została opracowana 140 lat temu w laboratorium Roberta Kocha i w przypadku wielu zastosowań metoda ta jest nadal odpowiednia. Problem pojawia się jednak w przypadku próby ilościowego określenia dużej liczby próbek. Pojedyncza próbka może wymagać posiewu od 1 do 10 seryjnych rozcieńczeń próbki w celu uzyskania policzalnych CFU, więc eksperymenty obejmujące więcej niż kilkadziesiąt próbek stają się męczące. Opracowano różne metody mające na celu zwiększenie efektywności liczenia CFU. Zautomatyzowane powlekanie spiralne eliminuje potrzebę seryjnego rozcieńczania30, dzięki czemu do liczenia CFU potrzebna jest tylko jedna płytka, ale wydłuża się czas na płytki próbki. Wykrywanie rozcieńczenia metodą pojedynczej płytki (SP-SDS) umożliwia oszacowanie CFU na podstawie mniejszej liczby płytek na próbkę31. Metody te stanowią ulepszenie w stosunku do tradycyjnej metody powlekania naprowadzanego, ale nadal wymagają obsługi i posiewu próbek bakteryjnych pojedynczo, a zatem nie są idealne dla dużej przepustowości. Manipulowanie próbkami na płytkach 96-dołkowych i punktowe powlekanie tych 96 próbek na prostokątnych płytkach agarowych znacznie poprawia przepustowość próbek19.
Mikrobiomy zazwyczaj składają się z wielu szczepów i gatunków. Podczas gdy gatunki często można rozróżnić na podstawie morfologii kolonii lub pożywki wzrostowej, fluorescencja może być wykorzystana do dalszego rozróżniania różnych typów bakterii i ich cech wzrostu32. Na przykład różne genotypy tego samego gatunku mogą być znakowane różnymi genetycznie kodowanymi białkami fluorescencyjnymi. Metody obrazowania płytek, które uwzględniają fluorescencję, pozwalają naukowcom wykorzystać te techniki genetyczne w testach opartych na CFU32. Włączenie fluorescencji do wysokoprzepustowych metod liczenia CFU jeszcze bardziej zwiększyłoby ich użyteczność.
Ręczne liczenie CFU staje się kłopotliwe, gdy jest duża liczba próbek. Automatyczne liczenie CFU można przeprowadzić, fotografując płytę i przetwarzając obraz za pomocą specjalistycznego oprogramowania33. Sieuwerts i in. połączyli zwiększoną wydajność powlekania punktowego z automatycznym zliczaniem kolonii przy użyciu konwencjonalnej fotografii cyfrowej i oprogramowania ImageJ19.
Wysokoprzepustowa metoda badania fenotypów określonych związków mikroorganizmów i gospodarzy pomogłaby w badaniach nad gromadzeniem się społeczności mikrobiomu i wpływem na zdrowie i kondycję gospodarza. Do badań nad mikrobiomem Drosophila wysokoprzepustowa platforma mikrobiologiczna obejmowałaby obsługę próbek much w formacie 96-dołkowej płytki, lizę much bez lizy bakteryjnej, skuteczność posiewu punktowego, możliwość stosowania fluorescencji i rozróżniania wielu fluoroforów, kontrolowane środowisko świetlne do odtwarzalnego obrazowania płytek CFU oraz niezawodne oprogramowanie do automatycznego liczenia kolonii. W tym artykule opisano metodę zoptymalizowaną pod kątem oznaczania CFU u muszek gnotobiotycznych, która jest prosta, szybka i zautomatyzowana. Protokół ten przedstawia nowatorski przepływ pracy łączący najlepsze z wcześniej opublikowanych metod i zoptymalizowany pod kątem badania mikrobiomu jelitowego u Drosophila.

<table><tbody><tr><td><mocne>Ubijanie i powlekanie punktowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Fiolki</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>autoklawowalne</td></tr><tr><td>Korki do fiolek Genesee</td><td></td><td>59-201</td><td>autoklawowalny</td></tr><tr><td>aplikator ręczny</td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater Koraliki do szkła młynkowego, 0,5 mm</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Półautomatyczny pipeter Rainin BenchSmart 96</td><td>30296705</td><td>Mettler Toledo</td> Dostępne <td>są tańsze opcje, w tym szczelinowe narzędzie do szpilek 96-dołkowych firmy VP Scientific</td></tr><tr><td>TempPlate 96-dołkowa płytka do PCR z półspódniczką, prosta spódnica, naturalna</td><td>USA scientific</td><td>1402-9220</td><td>Musi być polipropylenowy do zgrzewarki</td></tr><tr><td>Folia termozgrzewalna Thermal Bond</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td><td>Utrzymuj sterylną</td></tr><tr><td>tacę Płyta, 128 x 85 mm, Polistyren, Sterylne</td><td>SPL Life Sciences</td><td>31001</td><td>Do wykonywania prostokątnych płytek agarowych</td></tr> <tr><td>< mocny>Konstrukcja Photoboxa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac14; "-20 X &frac12; &rdquo; (X2)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>Aby przymocować wspornik kamery. Marka nie jest ważna. Każda śruba 1/4 "-20 1/2" działa.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac12; &rdquo; Nakrętka łącznika&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>UPC: 799862376780</td><td>nakrętka kołpakowa lub śruba łącząca. Służy do mocowania gumek recepturek na uchwycie talerza. Marka nie jest ważna.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac34; &rdquo; (X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>Do uchwytu na talerz. Marka nie jest ważna.</td></tr><tr><td>1/8" x &frac12; &rdquo; podkładka</td><td>Amazon</td><td>UPC: 611982484599</td><td>Podkładka do nakrętek kołpakowych na zewnątrz pudełka. Marka nie jest ważna. Przed przymocowaniem pomaluj farbą w sprayu, aby stopić ją z akrylem.</td></tr><tr><td><mocny>18 Gauge Wire</mocny> - Dwużyłowy przewód zasilający - <mocny>18 AWG Przewód zasilający &ndash; 10ft</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG Czerwona nakrętka drutu - WN-R2210 &ndash; <mocny>Ilość 4</mocny></td><td>Superbrightleds.com</td><td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16 cala żeńskie złącze wciskane - 22-18 AWG &ndash; <mocny>Ilość 3</mocny></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>4-calowe bezlutowe złącze zworkowe zaciskowe - 8mm Jednokolorowe taśmy LED - <mocne>Ilość 3</mocne></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2 4-calowy</td><td></td></tr><tr><td>adapter pigtailowy bez - 8mm jednokolorowe taśmy LED &ndash; <silny>Ilość 3</mocny></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt szuflady 6"</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>Każdy uchwyt szuflady powinien działać.</td></tr><tr><td>6" Prowadnice do szuflad</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>Przyciąć gumowe korki z cichym domykaniem na suwakach szuflady.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12; &rdquo; Nakrętki kołpakowe (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>Mocuje prowadnicy szuflady na zewnątrz pudełka. Marka nie jest ważna. Nylon nie uszkodzi akrylu. Przed przymocowaniem pomaluj farbą w sprayu, aby stopić ją z akrylem.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12; &rdquo; nylonowe (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>Do mocowania prowadnic szuflad. Marka nie jest ważna. Każda śruba lub śruba maszynowa spełniająca specyfikacje działa. Nylon nie uszkodzi akrylu i pozwala przeciąć równo z nakrętką. Przed przymocowaniem pomaluj farbą w sprayu, aby stopić ją z akrylem.</td></tr><tr><td>Klej akrylowy</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean: 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On #4 Klej, pint i przyspawana butelka z aplikatorem z igłą</td></tr><tr><td>Czarne opaski kablowe - 10 sztuk - 4 cale długości&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt L do aparatu</td><td>WLPREOE, Vikerer, Niemarkowy</td><td>ASIN: B09X46YKQZ</td><td>Wspornik powinien być "odwrócony" od zamierzonej konfiguracji, tak aby kamera znajdowała się "na zewnątrz" L. Niektóre wsporniki są dwuczęściowe i pozwalają na tę alternatywną konfigurację, niektóre nie, będziesz potrzebować takiego, który można obrócić. Powinien również mieć otwory 1/4" do mocowania. WLPREOE, Vikerer, niemarkowy. Jako przykład podano numer identyfikacyjny seryjny Amazon.</td></tr><tr><td>Aparat z serii Canon T do opcji tetheringu LUB</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon itp.</td><td>1894C002</td><td>Dobrym rozwiązaniem są aparaty z serii Canon Ti, które można podłączyć do komputera. Do użytku ze standardowym obiektywem kitowym 18-55 mm. Używane opcje są zalecane od Canon T5 do T7 (obecny model).</td></tr><tr><td>Jednokolorowa taśma LED o niestandardowej długości - Taśma świetlna z serii Eco - 24 V - IP20 - 250 lm / ft - Niebieska - 2 metry</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Jednokolorowa taśma LED o niestandardowej długości - Taśma świetlna z serii Eco - 24 V - IP20 - 250 lm / stopę - Zielony &ndash; 2 metry</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Jednokolorowa taśma LED o niestandardowej długości - Taśma świetlna z serii Eco - 24 V - IP20 - 250 lm / ft - Naturalna biel 4000K &ndash; 2 metry&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka z &frac14; ", 1/8" Wiertła Black</td><td>& Decker</td><td>&lrm; BDCDD12PK</td><td>Marka nie jest ważna.</td></tr><tr><td>Płaska farba w sprayu,&nbsp; 2X Ultra-Matte</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>Pomaluj wnętrze wszystkiego PŁASKIEGO na czarno. Marka nie jest ważna.</td></tr><tr><td>Laserowo wycinane ściany akrylowe</td><td>Big Blue Saw</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>Użyj załączonego pliku PDF, usuń wszystkie wycięcia w górnej części, z wyjątkiem żądanego otworu na aparat&nbsp;</td></tr><tr><td>Zasilacz impulsowy LED Mean Well - seria LPV Zasilacz LED z pojedynczym wyjściem 20-100 W - 24 V DC - 20 Watt&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100 do połączenia Wi-Fi z telefonem, tabletem lub komputerem</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon itp.</td><td>DMC-ZS100K Aparaty</td><td>Panasonic można bezprzewodowo podłączyć do komputera w celu przesyłania danych i opcji zdalnej migawki. Używane opcje są dobre.</td></tr><tr><td>Szybkozłączka</td><td>Neewer Aluminium 50mm Szybkozłączka QR Clamp 3/8 cala z 1/4 cala</td><td>ASIN: B07417F21D</td><td>Dodaj to do wspornika, aby aparat można było łatwo zdjąć w celu wymiany filtrów kolorów. Jako przykład podano numer identyfikacyjny seryjny Amazon.</td></tr><tr><td>Gumki, różne rozmiary</td><td>BAZIC Products</td><td>Alliance Rubber 26649</td><td>Gumki pasują do uchwytu na talerz. Marka nie jest ważna.</td></tr><tr><td>Podstawy montażowe do opasek kablowych przykręcanych/samoprzylepnych - podstawa 3/4 cala &ndash; <mocny>Ilość 4</mocny></td><td>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST Okrągły przełącznik kołyskowy - bez diody LED &ndash; <mocny>Ilość 3</mocny></td><td>Superbrightleds.com</td><td>RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Tiffen 29 (czerwony) 72 mm&nbsp;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Tiffen 58 (zielony) 72 mm</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>Nie dotyczy</td><td>bezpłatnie. Wystarczy zacytować: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &hellip; Cardona, A. (2012). Fidżi: platforma open source do analizy obrazów biologicznych. Metody natury, 9(7), 676&ndash;682. doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Posiada przydatną funkcję zmiany nazwy partii w Finderze, aby zmienić nazwę grupy zdjęć, aby ułatwić organizowanie i analizowanie w Count-on-it.</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>(wersja 64-bitowa) Windows (64-bitowa</td></tr>) <tr><td></td><td>Microsoft</td><td>N/A</td> (<td>wersja 64-bitowa</td></tr></tbody></table>)

szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu drosophila

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

Jelita zwierząt są kolonizowane przez mikroby komensalne, które wpływają na rozwój, zdrowie i zachowanie gospodarza. Precyzyjna kwantyfikacja kolonizacji jest niezbędna do badania złożonych interakcji między gospodarzem a drobnoustrojem, zarówno w celu walidacji składu mikrobiologicznego, jak i zbadania jego skutków. Drosophila melanogaster, która ma niską natywną różnorodność mikrobiologiczną i jest ekonomiczna w hodowli o określonym składzie mikrobiologicznym, pojawiła się jako organizm modelowy do badania mikrobiomu jelitowego. Analiza mikrobiomu pojedynczego organizmu wymaga określenia, które gatunki drobnoustrojów są obecne, i ilościowego określenia ich bezwzględnej liczebności. W artykule przedstawiono metodę analizy dużej liczby mikrobiomów poszczególnych much. Muchy są przygotowywane w 96-dołkowych płytkach, co umożliwia obsługę dużej liczby próbek jednocześnie. Liczebność drobnoustrojów określa się ilościowo, posiewając do 96 homogenatów całych much na jednej płytce agarowej w szeregu miejsc, a następnie zliczając jednostki tworzące kolonie (CFU), które rosną w każdym miejscu. Ten system powlekania jest połączony z automatyczną platformą kwantyfikacji CFU, która obejmuje fotografowanie płytek, różnicowanie kolonii fluorescencyjnych i automatyczne liczenie kolonii za pomocą wtyczki ImageJ. Zaletą jest to, że (i) metoda ta jest wystarczająco czuła, aby wykryć różnice między zabiegami, (ii) metoda powlekania punktowego jest tak samo dokładna jak tradycyjne metody powlekania oraz (iii) zautomatyzowany proces liczenia jest dokładny i szybszy niż liczenie ręczne. Przedstawiony tutaj przepływ pracy umożliwia wysokoprzepustową kwantyfikację CFU w dużej liczbie powtórzeń i może być stosowany w innych systemach badań mikrobiologicznych, w tym in vitro i innych modelach małych zwierząt.

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

Liczenie jednostek tworzących kolonie lub CFU jest standardową techniką w mikrobiologii, ale jest powolne i wymaga wielu płytek agarowych. Nasza technika zapewnia stukrotną przewagę nad tradycyjnymi metodami liczenia CFU w obu płytkach agarowych. Zastosowaliśmy tę metodologię do pomiaru mikrobiomu jelitowego małych modeli zwierzęcych, w szczególności muszek owocowych.Protokół ten jest prostym, szybkim i zautomatyzowanym sposobem ilościowego oznaczania CFU u muszek gnotobiotycznych. Protokół ten zapewnia przepływ pracy z oprzyrządowaniem wyprodukowanym przez DIY do fotografowania CFU i niestandardowym oprogramowaniem do automatyzacji ich liczenia. Protokół ten może być stosowany w każdym eksperymencie mikrobiologicznym, w którym przydatne mogą być bardziej wydajne metody powlekania i liczenia CFU.Sprawne posługiwanie się muchami i dostrzeganie talerzy wymaga zręczności manualnej, dlatego należy to ćwiczyć. Korzystanie z oprogramowania do automatycznego liczenia wymaga oceny progu, dlatego paragony należy porównać z liczeniami ręcznymi, aby określić najlepsze parametry eksperymentu. Procedurę zademonstruje Ren Dodge, badacz z mojego laboratorium, który opracował tę technikę. Na początek wlej szklane koraliki o grubości 0,5 mikrona na tackę do pomiaru kulek.Rozłóż koraliki na tacy, aby wszystkie studzienki były pełne i wyrównane. Następnie zetrzyj nadmiar koralików do stożkowej tuby. Teraz umieść płytkę PCR z półspódniczką do góry nogami na tacy pomiarowej i wyrównaj ją z dołkami, dopasowując ją do wgłębienia na tacy miarowej.Następnie szybko odwróć go, aby przenieść koraliki. Usuń nadmiar koralików z powierzchni płytki PCR. Upewnij się, że wszystkie studzienki zawierają koraliki.W razie potrzeby użyj miarki do ważenia, aby dodać koraliki do jednego dołka. Następnie przykryj płytkę folią aluminiową i autoklaw. Przed użyciem płytki dodaj 100 mikrolitrów PBS do każdej studzienki bezpośrednio przed dodaniem much za pomocą 96-kanałowego pipetera.W celu sterylizacji powierzchniowej znieczulonych muszek przenieś muchy z fiolki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej za pomocą małego lejka. Natychmiast rozpyl jeden mililitr 70% etanolu do probówki, zamknij tubkę i mieszaj przez odwrócenie przez 10 sekund. Następnie odessać etanol za pomocą pipety P-1000, unikając zasysania much.Po ostatecznym umyciu PBS zamknij rurkę i kilkakrotnie mocno postukaj nią o ławkę nakrętką do dołu, aby muchy weszły do nasadki. Po otwarciu probówki wlej muchy do studzienek za pomocą kleszczy i umieść jedną muchę w każdej studzience. Utrzymuj muchy w znieczuleniu, trzymając talerz na lodzie podczas ładowania.Usuń zabłąkane kulki w pobliżu studzienek, ponieważ mogą one zerwać uszczelkę foliową i spowodować wyciek. Upewnij się, że matowa strona folii uszczelniającej jest skierowana w dół na płycie, a błyszcząca strona jest skierowana do góry w kierunku zgrzewarki. Mocno dociśnij zgrzewarkę przez pięć sekund i wypoleruj aplikatorem ręcznym, aby zabezpieczyć folię.Homogenizuj muchy przez pięć minut. Upewnij się, że muchy są całkowicie homogenizowane, a roztwór zmienia kolor na kolorowy. Aby usunąć płyn z folii uszczelniającej, obracaj płytkę koralika przez 30 sekund w mini wirówce do płytek o sile 350 G. Zdejmij folię, trzymając płytkę, aby uniknąć rozpryskiwania kropelek homogenatu muchowego.Umieść trzy prostokątne płytki do wzrostu agaru MRS z otwartymi pokrywkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia przez co najmniej 10 minut. Przygotować dwie płytki rozcieńczające, dodając 100 mikrolitrów PBS do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki za pomocą 96-kanałowego pipetera. Załaduj stojak z końcówkami P-20 do 96-kanałowego pipetera.Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:10 przez zasysanie 11,1 mikrolitra homogenatu z płytki do pobierania próbek. Teraz dozuj go do pierwszej płytki rozcieńczającej zawierającej 100 mikrolitrów sterylnego PBS na studzienkę. Trzymać płytkę rozcieńczającą na wytrząsarce płytowej przez 10 sekund z prędkością 600 obr./min.Wymieszać ponownie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Przenieść 11,1 mikrolitra z pierwszej płytki rozcieńczającej na drugą płytkę rozcieńczającą i powtórzyć etapy mieszania w celu uzyskania dalszych rozcieńczeń. W przypadku płytek punktowych załaduj dwa mikrolitry z każdej studzienki do 96-kanałowego pipetera.Powoli opuść głowicę pipetera na płytkę, unikając wbijania się w agar, i upewnij się, że wszystkie plamki zostały dozowane. Następnie sprawdź, czy plamy płynu szybko wsiąkają w agar i nie spływają razem. Powtórzyć proces powlekania pozostałych płytek rozcieńczających zgodnie z opisem w manuskrypcie.Gdy płyn zostanie całkowicie wchłonięty przez agar, odwróć płytki i inkubuj je, aż kolonie osiągną optymalną wielkość. Uporządkuj tablice logicznie i utrzymuj je w określonej kolejności podczas fotografowania. Ustaw je tak, aby A1 znajdował się w lewym górnym rogu dla wszystkich tablic.Po zdjęciu pokrywy płyty umieść płytkę na stoliku tak, aby A1 był ustawiony we właściwym rogu. Wyobraź sobie płyty. Przenieś obrazy do komputera i zmień ich nazwy, w tym nazwę eksperymentu, typ nośnika, współczynnik rozcieńczenia i inne istotne szczegóły.Uporządkuj obrazy do przetworzenia w celu oceny ilościowej w folderze. Nazwy plików, które odróżniają tablice, stają się tytułami kolumn dla każdego zestawu zliczeń w wyjściowym arkuszu kalkulacyjnym. Utwórz w folderze podfoldery o nazwach Przycięte i Paragony.Te foldery otrzymają pliki wyjściowe. Teraz uruchom wtyczkę Croptacular z ImageJ i kliknij OK, aby rozpocząć przycinanie. Pojawi się okno dialogowe wyboru folderu źródłowego.Kliknij przycisk OK. Wybierz folder źródłowy i kliknij przycisk Otwórz. Następnie kliknij OK w oknie dialogowym, aby wybrać katalog docelowy. Wybierz folder docelowy i naciśnij Otwórz.Jeśli obraz jest już prosty, po prostu naciśnij spację. W przeciwnym razie wyprostuj obraz, rysując linię wzdłuż krawędzi, która powinna stać się pozioma. Przerysuj linię tyle razy, ile to konieczne, jeśli obraz nie wydaje się prosty.Następnie narysuj ramkę graniczną obszaru zliczania i dostosuj jego rozmiar i proporcje, aż wszystkie miejsca znajdą się w swoich komórkach. Przeciągnij kursor poza obwiednię, aby odświeżyć siatkę. Gdy siatka wygląda dobrze, naciśnij Spacja.Ponieważ wtyczka zakłada, że wszystkie zdjęcia są wyrównane identycznie, upewnij się, że następny obraz automatycznie obraca się pod tym samym kątem, co pierwszy. Jeśli to prawda, naciśnij spację, aby kontynuować. W przeciwnym razie wyprostuj obraz jak poprzednio.Siatka również przywołuje to samo położenie, co na poprzednim obrazie. W razie potrzeby wyreguluj i naciśnij Spacja. Uruchom Count-On-It i wybierz Gridiron.Ustaw próg intensywności kolonii na podstawie górnej i dolnej wartości intensywności piksela. Ustaw próg tak rygorystycznie, jak to możliwe, jednocześnie wybierając wszystkie kolonie. Kliknij przycisk OK w oknie dialogowym Wymagane działanie, gdy próg jest zadowalający, a następnie kliknij przycisk OK, aby kontynuować.Na pierwszym obrazie dostępna jest opcja kontynuowania lub powrotu do menu ustawień. Aby kontynuować proces wsadowy, kliknij przycisk OK. Następnie wybierz folder, w którym chcesz przechowywać tabelę paragonów i wyników. Użyj utworzonego wcześniej folderu Paragony.Po pierwszym obrazie kolejne obrazy będą domyślnie ustawione na ten sam próg, co poprzednie ustawienia. Kliknij przycisk OK, aby użyć tych ustawień lub je dostosować. Przejrzyj paragony inwentaryzacyjne generowane przez oprogramowanie i ręcznie skoryguj wszelkie błędy liczenia.Wtyczka ImageJ jest statystycznie dokładna, ale zdarzają się błędy. Sprawdzaj paragony, aby badać wartości odstające i identyfikować błędy w liczeniu. Oprogramowanie zapisuje dane CFU jako plik CSV w tym samym folderze, w którym znajdują się paragony.W przypadku muszek skolonizowanych przez Lactobacillus plantarum nastąpił znaczny spadek liczby bakterii u much, które były codziennie przenoszone na sterylną żywność, przenoszone codziennie, trzymane na sterylnym pokarmie cztery godziny przed analizą lub przenoszone codziennie i trzymane na sterylnym agarze cztery godziny przed analizą w porównaniu z muchami, które nigdy nie zostały przeniesione do sterylnego pokarmu po inokulacji. Podobne wyniki zaobserwowano u much karmionych Acetobacter indonesiensis, gdzie muchy przeniesione, po przeniesieniu i oczyszczone wykazały znaczne zmniejszenie CFU, ale mycie nie miało mierzalnego efektu, co sugeruje, że zmniejszenie CFU było spowodowane usuwaniem bakterii z jelita, a nie z naskórka. Liczba CFU w miejscach z 2 do 25 koloniami na plamkę nie wykazała różnicy w porównaniu z metodą tradycyjną.Plamki liczące średnio 35 kolonii wykazywały niższe CFU niż kontrolne płytki rozsiewające. Zmniejszenie to może być spowodowane nakładaniem się kolonii w gęstych miejscach. Na zdjęciach płytowych intensywność kolonii była o 300% wyższa niż tło.Kolonie mCherry-dodatnie Lactobacillus plantarum wykazywały o 1 000% wyższą intensywność czerwieni niż kolonie mCherry-ujemne. Kolonie Acetobacter indonesiensis GFP-dodatnie wykazywały o 200% wyższą intensywność zieleni niż kolonie GFP-ujemne. Wtyczka Count-On-It dla ImageJ automatyzuje liczenie CFU na podstawie zdjęć na płycie.Kolonie są wykrywane dokładnie, a liczba jest porównywalna do liczenia ręcznego. Paragony za zliczanie mogą służyć do identyfikowania błędnych zliczeń. Zmiana progów wielkości i długości fal fluorescencyjnych pozwala na osobne liczenie różnych morfologii kolonii.Ważne jest, aby upewnić się, że płyta jest dobrze uszczelniona przed frezowaniem koralików. Ważne jest również, aby zaprojektować kontrole dodatnie w celu kalibracji pomiarów. Używamy tej techniki również do badania in vitro populacji bakterii na płytkach 96-dołkowych, co pozwala nam badać mieszane społeczności bakterii.Technika ta pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu pomiaru kolonizacji jelit, a także biologicznej zmienności kolonizacji.

fast-colony-forming-unit-counting-96-well-plate-format-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Mikrobiota Drosophila wpływa na rozwój, odporność i fizjologię zwierzęcia. Ten film opisuje metodę ilościowego oznaczania bakterii u much poprzez określenie jednostek tworzących kolonie z preparatów dla całego ciała. Przedstawiony protokół demonstruje tę technikę na muchach, hodowanych w warunkach gnotobiotycznych przy użyciu czterech gatunków bakterii.

Liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU): Kwantyfikacja bakterii z ciał much

Źródło: Dodge, R., et al. Szybkie liczenie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowanej do mikrobiomu Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje ilościowe oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii związanych z jelitami u much Drosophila przy użyciu podejścia opartego na seryjnym rozcieńczaniu i posiewaniu. Homogenizowane próbki much zawierające bakterie jelitowe są seryjnie rozcieńczane, posiewane na agarze i inkubowane, aby umożliwić wzrost...

Kwantyfikacja jednostek tworzących kolonie bakterii związanych z jelitami u much Drosophila

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru obciążenia bakteriami E. coli po wstrzyknięciu E. coli do klatki piersiowej Drosophila melanogaster.

Pomiar obciążenia bakteryjnego E. coli u Drosophila melanogaster po zakażeniu E. coli

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Przedstawiono metodę hodowli Drosophila melanogaster w warunkach aksonicznych i gnotobiotycznych. Zarodki much są dechorionowane w podchlorynie sodu, przenoszone aseptycznie do jałowej diety i hodowane w zamkniętych pojemnikach. Zaszczepianie diety i zarodków bakteriami prowadzi do asocjacji gnotobiotycznych, a obecność bakterii potwierdza się poprzez posiew homogenatów Drosophila na całe ciało.

Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

Linie komórkowe są przydatne w badaniach nad organizmami wewnątrzkomórkowymi, które nie mogą być hodowane poza komórkami gospodarza. Chociaż linie zakażone Wolbachią umożliwiły wiele odkryć, niejednorodność w obrębie tych linii może prowadzić do zmiennych wyników eksperymentalnych. Przedstawiamy protokół generowania klonów jednokomórkowych i ciągłych hodowli z komórek JW18 zakażonych Wolbachią.

Generacja kultur monoklonalnych z linii komórkowej Drosophila melanogaster JW18 zakażonej Wolbachią

Naucz się szybkiego zliczania jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowanego do mikrobiomu Drosophila. Ta zautomatyzowana metoda oferuje stukrotną przewagę czasową nad tradycyjnymi technikami.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Przeglądaj więcej filmów