Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Liczenie jednostek tworzących kolonie lub CFU jest standardową techniką w mikrobiologii, ale jest powolne i wymaga wielu płytek agarowych. Nasza technika zapewnia stukrotną przewagę nad tradycyjnymi metodami liczenia CFU w obu płytkach agarowych. Zastosowaliśmy tę metodologię do pomiaru mikrobiomu jelitowego małych modeli zwierzęcych, w szczególności muszek owocowych.

Protokół ten jest prostym, szybkim i zautomatyzowanym sposobem ilościowego oznaczania CFU u muszek gnotobiotycznych. Protokół ten zapewnia przepływ pracy z oprzyrządowaniem wyprodukowanym przez DIY do fotografowania CFU i niestandardowym oprogramowaniem do automatyzacji ich liczenia. Protokół ten może być stosowany w każdym eksperymencie mikrobiologicznym, w którym przydatne mogą być bardziej wydajne metody powlekania i liczenia CFU.

Sprawne posługiwanie się muchami i dostrzeganie talerzy wymaga zręczności manualnej, dlatego należy to ćwiczyć. Korzystanie z oprogramowania do automatycznego liczenia wymaga oceny progu, dlatego paragony należy porównać z liczeniami ręcznymi, aby określić najlepsze parametry eksperymentu. Procedurę zademonstruje Ren Dodge, badacz z mojego laboratorium, który opracował tę technikę. Na początek wlej szklane koraliki o grubości 0,5 mikrona na tackę do pomiaru kulek.

Rozłóż koraliki na tacy, aby wszystkie studzienki były pełne i wyrównane. Następnie zetrzyj nadmiar koralików do stożkowej tuby. Teraz umieść płytkę PCR z półspódniczką do góry nogami na tacy pomiarowej i wyrównaj ją z dołkami, dopasowując ją do wgłębienia na tacy miarowej.

Następnie szybko odwróć go, aby przenieść koraliki. Usuń nadmiar koralików z powierzchni płytki PCR. Upewnij się, że wszystkie studzienki zawierają koraliki.

W razie potrzeby użyj miarki do ważenia, aby dodać koraliki do jednego dołka. Następnie przykryj płytkę folią aluminiową i autoklaw. Przed użyciem płytki dodaj 100 mikrolitrów PBS do każdej studzienki bezpośrednio przed dodaniem much za pomocą 96-kanałowego pipetera.

W celu sterylizacji powierzchniowej znieczulonych muszek przenieś muchy z fiolki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej za pomocą małego lejka. Natychmiast rozpyl jeden mililitr 70% etanolu do probówki, zamknij tubkę i mieszaj przez odwrócenie przez 10 sekund. Następnie odessać etanol za pomocą pipety P-1000, unikając zasysania much.

Po ostatecznym umyciu PBS zamknij rurkę i kilkakrotnie mocno postukaj nią o ławkę nakrętką do dołu, aby muchy weszły do nasadki. Po otwarciu probówki wlej muchy do studzienek za pomocą kleszczy i umieść jedną muchę w każdej studzience. Utrzymuj muchy w znieczuleniu, trzymając talerz na lodzie podczas ładowania.

Usuń zabłąkane kulki w pobliżu studzienek, ponieważ mogą one zerwać uszczelkę foliową i spowodować wyciek. Upewnij się, że matowa strona folii uszczelniającej jest skierowana w dół na płycie, a błyszcząca strona jest skierowana do góry w kierunku zgrzewarki. Mocno dociśnij zgrzewarkę przez pięć sekund i wypoleruj aplikatorem ręcznym, aby zabezpieczyć folię.

Homogenizuj muchy przez pięć minut. Upewnij się, że muchy są całkowicie homogenizowane, a roztwór zmienia kolor na kolorowy. Aby usunąć płyn z folii uszczelniającej, obracaj płytkę koralika przez 30 sekund w mini wirówce do płytek o sile 350 G. Zdejmij folię, trzymając płytkę, aby uniknąć rozpryskiwania kropelek homogenatu muchowego.

Umieść trzy prostokątne płytki do wzrostu agaru MRS z otwartymi pokrywkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia przez co najmniej 10 minut. Przygotować dwie płytki rozcieńczające, dodając 100 mikrolitrów PBS do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki za pomocą 96-kanałowego pipetera. Załaduj stojak z końcówkami P-20 do 96-kanałowego pipetera.

Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:10 przez zasysanie 11,1 mikrolitra homogenatu z płytki do pobierania próbek. Teraz dozuj go do pierwszej płytki rozcieńczającej zawierającej 100 mikrolitrów sterylnego PBS na studzienkę. Trzymać płytkę rozcieńczającą na wytrząsarce płytowej przez 10 sekund z prędkością 600 obr./min.

Wymieszać ponownie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Przenieść 11,1 mikrolitra z pierwszej płytki rozcieńczającej na drugą płytkę rozcieńczającą i powtórzyć etapy mieszania w celu uzyskania dalszych rozcieńczeń. W przypadku płytek punktowych załaduj dwa mikrolitry z każdej studzienki do 96-kanałowego pipetera.

Powoli opuść głowicę pipetera na płytkę, unikając wbijania się w agar, i upewnij się, że wszystkie plamki zostały dozowane. Następnie sprawdź, czy plamy płynu szybko wsiąkają w agar i nie spływają razem. Powtórzyć proces powlekania pozostałych płytek rozcieńczających zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Gdy płyn zostanie całkowicie wchłonięty przez agar, odwróć płytki i inkubuj je, aż kolonie osiągną optymalną wielkość. Uporządkuj tablice logicznie i utrzymuj je w określonej kolejności podczas fotografowania. Ustaw je tak, aby A1 znajdował się w lewym górnym rogu dla wszystkich tablic.

Po zdjęciu pokrywy płyty umieść płytkę na stoliku tak, aby A1 był ustawiony we właściwym rogu. Wyobraź sobie płyty. Przenieś obrazy do komputera i zmień ich nazwy, w tym nazwę eksperymentu, typ nośnika, współczynnik rozcieńczenia i inne istotne szczegóły.

Uporządkuj obrazy do przetworzenia w celu oceny ilościowej w folderze. Nazwy plików, które odróżniają tablice, stają się tytułami kolumn dla każdego zestawu zliczeń w wyjściowym arkuszu kalkulacyjnym. Utwórz w folderze podfoldery o nazwach Przycięte i Paragony.

Te foldery otrzymają pliki wyjściowe. Teraz uruchom wtyczkę Croptacular z ImageJ i kliknij OK, aby rozpocząć przycinanie. Pojawi się okno dialogowe wyboru folderu źródłowego.

Kliknij przycisk OK. Wybierz folder źródłowy i kliknij przycisk Otwórz. Następnie kliknij OK w oknie dialogowym, aby wybrać katalog docelowy. Wybierz folder docelowy i naciśnij Otwórz.

Jeśli obraz jest już prosty, po prostu naciśnij spację. W przeciwnym razie wyprostuj obraz, rysując linię wzdłuż krawędzi, która powinna stać się pozioma. Przerysuj linię tyle razy, ile to konieczne, jeśli obraz nie wydaje się prosty.

Następnie narysuj ramkę graniczną obszaru zliczania i dostosuj jego rozmiar i proporcje, aż wszystkie miejsca znajdą się w swoich komórkach. Przeciągnij kursor poza obwiednię, aby odświeżyć siatkę. Gdy siatka wygląda dobrze, naciśnij Spacja.

Ponieważ wtyczka zakłada, że wszystkie zdjęcia są wyrównane identycznie, upewnij się, że następny obraz automatycznie obraca się pod tym samym kątem, co pierwszy. Jeśli to prawda, naciśnij spację, aby kontynuować. W przeciwnym razie wyprostuj obraz jak poprzednio.

Siatka również przywołuje to samo położenie, co na poprzednim obrazie. W razie potrzeby wyreguluj i naciśnij Spacja. Uruchom Count-On-It i wybierz Gridiron.

Ustaw próg intensywności kolonii na podstawie górnej i dolnej wartości intensywności piksela. Ustaw próg tak rygorystycznie, jak to możliwe, jednocześnie wybierając wszystkie kolonie. Kliknij przycisk OK w oknie dialogowym Wymagane działanie, gdy próg jest zadowalający, a następnie kliknij przycisk OK, aby kontynuować.

Na pierwszym obrazie dostępna jest opcja kontynuowania lub powrotu do menu ustawień. Aby kontynuować proces wsadowy, kliknij przycisk OK. Następnie wybierz folder, w którym chcesz przechowywać tabelę paragonów i wyników. Użyj utworzonego wcześniej folderu Paragony.

Po pierwszym obrazie kolejne obrazy będą domyślnie ustawione na ten sam próg, co poprzednie ustawienia. Kliknij przycisk OK, aby użyć tych ustawień lub je dostosować. Przejrzyj paragony inwentaryzacyjne generowane przez oprogramowanie i ręcznie skoryguj wszelkie błędy liczenia.

Wtyczka ImageJ jest statystycznie dokładna, ale zdarzają się błędy. Sprawdzaj paragony, aby badać wartości odstające i identyfikować błędy w liczeniu. Oprogramowanie zapisuje dane CFU jako plik CSV w tym samym folderze, w którym znajdują się paragony.

W przypadku muszek skolonizowanych przez Lactobacillus plantarum nastąpił znaczny spadek liczby bakterii u much, które były codziennie przenoszone na sterylną żywność, przenoszone codziennie, trzymane na sterylnym pokarmie cztery godziny przed analizą lub przenoszone codziennie i trzymane na sterylnym agarze cztery godziny przed analizą w porównaniu z muchami, które nigdy nie zostały przeniesione do sterylnego pokarmu po inokulacji. Podobne wyniki zaobserwowano u much karmionych Acetobacter indonesiensis, gdzie muchy przeniesione, po przeniesieniu i oczyszczone wykazały znaczne zmniejszenie CFU, ale mycie nie miało mierzalnego efektu, co sugeruje, że zmniejszenie CFU było spowodowane usuwaniem bakterii z jelita, a nie z naskórka. Liczba CFU w miejscach z 2 do 25 koloniami na plamkę nie wykazała różnicy w porównaniu z metodą tradycyjną.

Plamki liczące średnio 35 kolonii wykazywały niższe CFU niż kontrolne płytki rozsiewające. Zmniejszenie to może być spowodowane nakładaniem się kolonii w gęstych miejscach. Na zdjęciach płytowych intensywność kolonii była o 300% wyższa niż tło.

Kolonie mCherry-dodatnie Lactobacillus plantarum wykazywały o 1 000% wyższą intensywność czerwieni niż kolonie mCherry-ujemne. Kolonie Acetobacter indonesiensis GFP-dodatnie wykazywały o 200% wyższą intensywność zieleni niż kolonie GFP-ujemne. Wtyczka Count-On-It dla ImageJ automatyzuje liczenie CFU na podstawie zdjęć na płycie.

Kolonie są wykrywane dokładnie, a liczba jest porównywalna do liczenia ręcznego. Paragony za zliczanie mogą służyć do identyfikowania błędnych zliczeń. Zmiana progów wielkości i długości fal fluorescencyjnych pozwala na osobne liczenie różnych morfologii kolonii.

Ważne jest, aby upewnić się, że płyta jest dobrze uszczelniona przed frezowaniem koralików. Ważne jest również, aby zaprojektować kontrole dodatnie w celu kalibracji pomiarów. Używamy tej techniki również do badania in vitro populacji bakterii na płytkach 96-dołkowych, co pozwala nam badać mieszane społeczności bakterii.

Technika ta pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu pomiaru kolonizacji jelit, a także biologicznej zmienności kolonizacji.