Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Nowatorska szczepionka nanoemulsyjna ma ogromne zalety w terapii taktycznej chorób. Te efekty zestawu są zminimalizowane przez takie właściwości, jak unikalny chopizm guza, identyfikacja określonych taktyk i niska toksyczność ogólnoustrojowa. Przewidujemy, że protokół dostarczy technicznych i teoretycznych wskazówek dla przyszłego rozwoju nowych szczepionek błony śluzowej z ektypem ekotypu T.

Zacznij od zmieszania jednego miligrama monofosforolu lipidowego A ze 100 mikrolitrami DMSO. Wiruj przez pięć minut i pozostaw do rozpuszczenia na cztery godziny w temperaturze pokojowej. Ilościowo dodaj TWEEN 80 i I-OVA.

Wymieszaj składniki i dodaj skwalen. Następnie do przygotowanej mieszaniny dodaj 100 mikrolitrów roztworu MPLA. Aby przygotować szczepionkę nanoemulsyjną, należy dodać zmieszany roztwór do kropelek wody w ilości około 70% całkowitej objętości i delikatnie wymieszać, aby uzyskać przezroczystą i łatwo płynącą mieszaninę.

W przypadku testów in vitro zacznij od ożywienia komórek nabłonka BEAS2B. Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Szybko rozmrozić zamrożone fiolki z komórkami w łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu szybko odpipetuj komórki do 15-mililitrowej sterylnej probówki wirówkowej i dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki wzrostowej. Odwirować probówkę o stężeniu 129 G przez pięć minut. Usuń supinatant i ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej.

Po ponownym odwirowaniu komórek usuń supiniant i dodaj sześć mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej w celu ponownego zawieszenia komórek. Następnie przenieś komórki do kolby hodowlanej T25 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy gęstość komórek osiągnie 80% do 90%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i umyj komórki dwukrotnie dwoma mililitrami PBS.

Dodaj jeden mililitr 0,25% tripsin, aby trawić komórki przez jedną do dwóch minut. Gdy zaobserwuje się zaokrąglenie komórek, natychmiast dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki wzrostowej, aby zneutralizować trypsynę. Wymieszaj i odessaj próbki w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować próbki o stężeniu 129 G przez pięć minut. Usuń supinatant i ponownie zawieś ogniwa w jednym mililitrze kompletnego podłoża RPMI 1640. Użyj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do liczenia komórek i rozcieńcz komórki do 10 do 5 komórek na mililitr.

Następnie poszczepić komórki BEAS2B o gęstości od jednego razy 10 do czwartej komórki na basenie na 96-dołkowych płytkach w 100 mikrolitrach kompletnej pożywki RPMI 1640 i wstępnie inkubować płytki przez 24 godziny, jak pokazano wcześniej. Pod koniec inkubacji wyrzucić supinatant i dodać 100 mikrolitrów RPMI 1640 do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Dodać po 100 mikrolitrów nano emulsji I-OVA, I-OVA zmieszanej z BNE i I-OVA wstępnie rozcieńczonej kompletną pożywką wzrostową w różnych końcowych stężeniach z BNE jako kontrolą i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu inkubacji usuń pożywkę i przenieś płytkę w ciemne miejsce. Dodaj 90 mikrolitrów kompletnego podłoża wzrostowego i 10 mikrolitrów roztworu CCK8 do każdego dołka płytki. Inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Zmierz absorbancję każdej studzienki przy 450 nanometrach za pomocą znakowanego enzymem czytnika płytek. Użyj końcówek do pipet o pojemności 10 mikrolitrów, aby przeprowadzić immunizację donosową myszy za pomocą I-OVA, I-OVA plus BNE i I-OVA NE przez trzy dni. Użyj BNE i PBA jako kontroli eksperymentalnej.

Następnie wytnij nożyczkami próbki tkanek nosa o grubości około trzech milimetrów i umieść je w 4% paraformaldehydzie. Usuń tkanki płucne i utrwal nosa i całe tkanki płucne w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny. TEM i AFM stosuje się do oceny podstawowych cech powierzchniowego potencjału zeta i wielkości cząstek nanoszczepionki.

Przedstawiono wielkości cząstek, wskaźniki polidyspersyjności, potencjały zeta i ruchliwość elektroforetyczną I-OVA NE w analizach stabilności musyny. Względna żywotność komórek BEAS2B wynosi ponad 80% w hodowlach wystawionych na różne stężenia peptydów I-OVA, BNE+I-OVA i I-OVA NE przez 24 godziny. Grupa I-OVA EN nie miała oczywistej toksyczności błony śluzowej, uszkodzenia tkanek, krwawienia lub naciekania komórek zapalnych.

Nabłonkowe komórki BEAS2B wychwyciły więcej I-OVA NE znakowanych FITC niż w roztworze wodnym. Efekt przedłużonego uwalniania I-OVA NE in vitro analizowano przy użyciu systemu IV-IS. Szczepionka I-OVA NE miała efekt przedłużonego uwalniania w porównaniu z wodnym roztworem I-OVA.

W grupie I-OVA NE procentowy czas przeżycia jest wyższy w porównaniu z innymi grupami, a objętość guza była znacznie mniejsza, co sugeruje, że ma on lepszy efekt ochrony zapobiegawczej niż inne grupy. W modelu terapeutycznym mediana czasu przeżycia była istotnie różna między różnymi grupami. Objętość guza w grupie I-OVA NE była znacznie mniejsza niż w grupie I-OVA.

W tej procedurze ważne jest równomierne mieszanie mieszaniny. W przeciwnym razie zmniejszy to skuteczność nanoszczepionek.