Name: Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj test wiązania aptamerów do receptorów powierzchniowych komórek nowotworowych przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta metoda pozwala ocenić swoistość i selektywność aptamerów w zastosowaniach diagnostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za dofinansowanie SEED Instytutu Zdrowia Psychicznego i Fizycznego oraz Tłumaczeń Klinicznych (IMPACT), program "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" na Uniwersytecie Deakin oraz stypendium "Australian Government Research Training Program".

<ol><li>Cancer. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022).</li>
<li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress%2C+remaining+challenges+and+future+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li>
<li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+PD-1%2FPD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019(2022).</li>
<li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain%3A+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120(2020).</li>
<li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322(2015).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571(2021).</li>
<li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis%3A+an+update+on+druggable+targets%2C+current+clinical+trials%2C+and+future+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li>
<li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li>
<li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li>
<li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX%3A+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28(2021).</li>
<li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-specific+aptamers%3A+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070(2017).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079(2016).</li>
<li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis%3A+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613(2013).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+EpCAM+%28CD326%29+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo%2Fradioresistance+via+the+PI3K%2FAkt%2FmTOR+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcKeague%2C+M+%22Tissue+Culture%22">Tissue Culture</a>. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+aptamer+publication+standards+%28MAPS+guidelines%29+for+de+novo+aptamer+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Aptamers%22%5BJournal%5D)">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li>
<li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271(2018).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+cell+viability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Frontiers%22%5BJournal%5D)">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li>
<li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+binding+aptamers%3A+Selection+strategies%2C+characterization%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14(2016).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li>
<li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Aptamers%22%5BJournal%5D)">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores%3A+the+base-quenched+probe+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887(2016).</li>
<li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li>
<li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li>
<li>Yu, X. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer%2C+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym wyzwaniem związanym z opracowywaniem nowych aptamerów jest brak standardowych wytycznych, które miałyby zastosowanie do różnych etapów tego procesu. McKeague i in. wykazali ostatnio niektóre z powiązanych wyzwań, które prowadzą do niejasnych prezentacji danych w publikacjach i niemożności powtórzenia badań. Zaproponowali oni podstawowe wytyczne niezbędne do rozważenia przy charakterystyce aptamerów19. Test wiązania aptamerów jest krytycznym krokiem w badaniach przesiewowych i/lub charakt...

Rak jest nadal jedną z głównych przyczyn śmiertelności na całym świecie1. Pomimo znacznej poprawy w leczeniu nowotworów w ostatnich dziesięcioleciach, opracowywanie leków przeciwnowotworowych jest nadal przedmiotem wielu dyskusji. Dzieje się tak dlatego, że chemioterapii, jako podstawa leczenia raka, towarzyszą poważne skutki uboczne, które ograniczają przestrzeganie zaleceń przez pacjenta. Co więcej, oporność nowotworów na leczenie wywołana chemioterapią ograniczyła jej zastosowanie jako jedynego wyboru interwencji medycznej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) wprowadziło wzmocnioną odpowiedź na leczenie raka2. Uzasadnieniem stosowania przeciwciał monoklonalnych była poprawa skuteczności chemioterapeutyków i zminimalizowanie ich działań niepożądanych. Jednak podawanie przeciwciał monoklonalnych również stało się wyzwaniem. Wynikało to nie tylko z reakcji immunologicznych wywołanych przez mAb, ale także z powodu zależnych od zwierząt i wysokich kosztów produkcji oraz trudnych warunków przechowywania3. Wprowadzenie aptamerów w latach dziewięćdziesiątych XX wieku4 wzbudziło nowe nadzieje w leczeniu raka, ponieważ zastosowanie aptamerów może rozwiązać problemy związane z mAb.
Aptamery to krótkie sekwencje kwasów nukleinowych, które są specjalnie produkowane dla określonego celu. Systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest powszechną metodą w produkcji aptamerów. W SELEX interesujące białko jest inkubowane z biblioteką losowych sekwencji nukleotydowych, a następnie poprzez serię cykli iteracyjnych aptamer specyficzny dla tego białka jest oczyszczany. Aptamery mają podobną selektywność docelową i swoistość jak mAb, dlatego rozwój leków w tej dziedzinie daje obiecujące przyszłe zastosowania. Aptamery specyficzne dla biomarkerów nowotworowych mogą być stosowane jako pojedyncze leki i narzędzia diagnostyczne raka5,6,7. Ze względu na swoją nanorozmiarową strukturę, aptamery te mogą również działać jako nośniki leków, dostarczając czynniki cytotoksyczne specyficznie do nowotworu8. Zwiększyłoby to skuteczność celowanego dostarczania leków i zmniejszyłoby liczbę niepożądanych reakcji związanych z chemioterapią, niezamierzonych. Co więcej, te nanoleki charakteryzują się wysoką penetracją tkanek, co czyni je pożądanym kandydatem do dostarczania i leczenia leków w głębokich nowotworach. Aptamery mogą być również zaprojektowane tak, aby celowały w transportery ulegające ekspresji na barierze krew-mózg (BBB) w celu poprawy dostarczania leków do guzów mózgu9. Dobrym przykładem takiego aptameru są dwufunkcyjne aptamery, ukierunkowane na receptor transferyny (TfR)10 w celu zwiększenia dostarczania leku przez barierę krew-mózg i dostarczające ładunek leku cytotoksycznego do komórek nowotworowych11.
Pomimo wszystkich zalet aptamerów, rozwój leków w tej dziedzinie nie przyniósł jeszcze wprowadzonego na rynek, skutecznego leku przeciwnowotworowego. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy może być brak standardowych i powtarzalnych metod, które mogłyby być stosowane na całym świecie przez badaczy w tej dziedzinie. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół wiązania aptameru z natywnym białkiem ulegającym ekspresji na powierzchni komórki. Protokół ten jest niezbędnym krokiem w przedklinicznej ocenie aptamerów przeciwnowotworowych. Test przeprowadza się w celu wykazania selektywności i swoistości oczyszczonego aptameru pobranego z SELEX lub opublikowanej sekwencji aptamerów w celu potwierdzenia selektywności i swoistości. Ten test oparty na cytometrii przepływowej jest szybkim, wiarygodnym i czułym testem, który dokładnie pokazuje selektywność i swoistość aptameru, w którym aptamer jest testowany na białkach na powierzchni komórki12,13,14. Metoda ta została zademonstrowana przy użyciu powiązania aptameru specyficznego dla EpCAM pokazanego w tym artykule15. EpCAM, jako glikoproteina transbłonowa, odgrywa rolę w sygnalizacji komórek nowotworowych, progresji, migracji i przerzutach16,17. Aby wykazać selektywność i swoistość tego aptameru, wykorzystano komórki nowotworowe EpCAM-dodatnie i -ujemne. Wcześniej opracowany aptamer specyficzny dla EpCAM, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) oraz aptamer kontroli ujemnej, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), były używane odpowiednio jako aptamery wiążące i niewiążące EpCAM10. 3' koniec zarówno TEPP, jak i TENN zostały oznaczone fluoroforem TYE665.
TEPP to dwufunkcyjny aptamer, który z jednej strony atakuje EpCAM, a z drugiej TfR. To sprawiło, że TEPP stał się odpowiednim kandydatem do podawania leków na guzy mózgu EpCAM+. Wykorzystując swój specyficzny dla TfR koniec, TEPP przenika przez barierę krew-mózg, a za pomocą końca specyficznego dla EpCAM znajduje guz i dostarcza swój ładunek (np. leki cytotoksyczne) do guza. TENN ma podobną długość i strukturę 2D jak TEPP, ale nie ma powinowactwa do EpCAM lub TfR, a zatem jest odpowiednim aptamerem kontroli ujemnej. W artykule przedstawiono testowanie wiązania aptameru z białkiem docelowym za pomocą TEPP i TENN za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten ma zastosowanie do opracowywania aptamerów specyficznych dla komórek. Ma to również zastosowanie do dalszych analiz uzupełniających i potwierdzających sekwencji aptamerowych dostępnych w literaturze. Protokół może być również używany przez osoby nowe w dziedzinie aptamerów, które rozważają wykorzystanie wcześniej opublikowanego aptameru do celów badawczo-rozwojowych (R&D). W niniejszej pracy przeanalizowano dwie dostępne w literaturze sekwencje aptamerowe.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml z dołączoną pokrywką</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6649</td><td></td></tr><tr><td>15 mL CellStar niebieska nakrętka, stożkowa dolna probówka</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipety serologiczne</td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Flow Cytometr Becton Dickinson</td><td>Becton Dickinson N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva V9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), liofilizowany proszek</td><td>Sigma-AldrichTM</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr jasnej linii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) Technologie życia w proszku o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21300025</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo, LLC 10.8.1</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>ACS-4500</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Heracell 150i CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Megafuge 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, PS, 96 dołków, F-bottom (studnia kominowa), Black</td><td>Greiner Bio One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda bez pirogenów i RNaz</td> Kolba do hodowli komórkowych <td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>Cellstar</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TENN</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td></tr><tr><td>TEPP</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&prime;</td></tr><tr><td>Transfer RNA (tRNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8508-5X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Kluczowym wyzwaniem w opracowaniu aptameru przeciwnowotworowego jest efektywne określenie selektywności i swoistości opracowanego aptameru w stosunku do docelowego białka. Ze względu na kilka zalet w porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi, rozwój aptamerów zyskał ogromną popularność wśród badaczy nowotworów. Systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest najpowszechniejszą metodą opracowywania aptamerów specyficznych dla białek będących przedmiotem zainteresowania. Po badaniu SELEX szybki i skuteczny test wiązania przyspiesza proces identyfikacji, potwierdzając selektywność i swoistość aptameru. 
Ten artykuł wyjaśnia krok po kroku test wiązania oparty na cytometrii przepływowej aptamera specyficznego dla cząsteczki adhezji komórkowej nabłonka (EpCAM). Transbłonowa glikoproteina EpCAM ulega nadekspresji w większości nowotworów i odgrywa rolę w inicjacji, progresji i przerzutach raka. Dlatego jest cennym kandydatem do celowanego dostarczania leków do nowotworów. Aby ocenić selektywność i swoistość aptameru w stosunku do EpCAM związanego z błoną, wymagane są komórki EpCAM dodatnie i ujemne. Dodatkowo wymagany jest niewiążący aptamer EpCAM o podobnej długości i strukturze 2-wymiarowej (2D) do aptameru wiążącego EpCAM. Test wiązania obejmuje różne (bufor blokujący, bufor myjący, bufor inkubacyjny i bufor FACS) i etapy inkubacji. 
Aptamer jest inkubowany z liniami komórkowymi. Po etapach inkubacji i mycia komórki zostaną ocenione za pomocą czułego testu cytometrii przepływowej. Analiza wyników wskazuje na wiązanie aptameru specyficznego dla EpCAM z komórkami EpCAM-dodatnimi, a nie z komórkami EpCAM-ujemnymi. W komórkach EpCAM-dodatnich jest to przedstawiane jako przesunięcie pasma w wiązaniu aptameru EpCAM w prawo w porównaniu z kontrolą aptamera niewiążącego. W komórkach EpCAM-ujemnych odpowiednie pasma aptamerów wiążących i niewiążących EpCAM nakładają się na siebie. Świadczy to o selektywności i swoistości aptamiru EpCAM. Chociaż ten protokół koncentruje się na aptamie EpCAM, protokół ma zastosowanie do innych opublikowanych aptamerów.

Ważnym aspektem odkrywania i opracowywania nowych leków jest zapewnienie selektywności i swoistości kandydata na lek. Oznacza to, że kandydat na lek powinien być w stanie odróżnić różne komórki i wpływać wyłącznie na interesującą nas populację komórek (selektywność). Selektywność bada się z wykorzystaniem linii komórkowych różniących się pod względem ekspresji badanego białka. W niniejszym badaniu linie komórkowe MDA-MB-231 oraz HEK 293T wybrano odpowiednio jako komórki EpCAM-dodatnie i -ujemne. Swoistość to kolejny para...

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Protokół ten pomoże naukowcom, którzy dopiero zaczynają pracować z aptamerami, w wykorzystaniu ich w swoich projektach, a także w zrozumieniu poszczególnych małych kroków, które są wymagane do ukończenia protokołu. Aptamery są bardzo wszechstronne, a ten protokół pokazuje, jak łatwe i proste są w teście immunofenotypowania. Aptamery mogą być stosowane zarówno w zastosowaniach diagnostycznych, jak i terapeutycznych.Protokół ten jest pierwszym krokiem podjętym w celu potwierdzenia ich specyficzności i czułości. Podczas gdy ten konkretny test demonstruje barwienie jednego receptora na powierzchni komórki, aptamery mogą być bardzo łatwo stosowane do wieloparametrycznej cytometrii przepływowej, zapewniając wysoki poziom wiedzy fenotypowej. Ważnymi aspektami pracy z aptamerami jest upewnienie się, że są one prawidłowo złożone przed użyciem, a także, że warunki bufora i siły jonowej są takie same, jak w momencie ich wyboru.Po zebraniu i wyrzuceniu pożywki do kolby, dodać trzy mililitry PBS i rozprowadzić go po komórkach. Po dodaniu jednego mililitra 0,25% trypsyny-EDTA do każdej kolby, inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wizualizować oderwanie komórek pod mikroskopem. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki do komórek i pipetuj komórki w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.Odpipetować komórki do odpowiedniej probówki i odwirować przy 200 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej pożywki i policzyć komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym, rozcieńczając pewną objętość zawiesiny komórek błękitem trypanowym. Rozprowadzić około 15 mikrolitrów mieszaniny między hemocytometrem a szkłem nakrywkowym, aby policzyć komórki.Zbierz wymaganą liczbę komórek, upewniając się, że w próbce testowej znajduje się sto tysięcy komórek. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby umożliwić stabilizację interesującego białka na błonie komórkowej po enzymatycznym oderwaniu. Po dwugodzinnej inkubacji odwirować komórki o sile 500 G przez pięć minut.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu blokującego. Inkubować komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut z przerywanym mieszaniem. Podczas tej 30-minutowej inkubacji należy przeprowadzić składanie aptamerów, przygotowując dwukrotne stężenia aptamerów opisane w manuskrypcie.Następnie wymieszać i inkubować aptamery za pomocą termocyklera zgodnie z wymaganymi warunkami składania, zapewniając jednocześnie ochronę aptamerów przed światłem. Po 30-minutowej inkubacji odwirować komórki, jak pokazano wcześniej, i usunąć supernatant. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do przemywania i ponownie odwiruj komórki.Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu wiążącego. Następnie odpipetuj 50 mikrolitrów zawieszonych komórek do każdej studzienki lodowatej czarnej płytki z 96 dołkami. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów aptamerów na komórki o objętości 50 mikrolitrów, wymieszać i inkubować w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, ostrożnie ponownie zawiesić osad w buforze do przemywania i ponownie odwirować przy 500 G przez pięć minut. Następnie ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach buforu do przemywania do analizy metodą cytometrii przepływowej, powtarzając dwukrotnie etap płukania. Najpierw włącz cytometr przepływowy, a następnie komputer.Następnie otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, zaloguj się do programu i pod zakładką cytometr uruchom uruchamianie płynu. Aby utworzyć nowy eksperyment, na karcie eksperymentu kliknij nowy folder i odpowiednio nazwij eksperyment z ukośnikiem folderu. Kliknij nowy folder, aby go podświetlić.Następnie ponownie na karcie eksperymentu kliknij nowy eksperyment i odpowiednio nazwij eksperyment. Aby dodać pierwszą próbkę z ukośnikiem, na karcie eksperymentu kliknij nową próbkę i odpowiednio nazwij próbkę. Aby dodać próbkę probówki, zaznacz próbkę i na karcie eksperymentu kliknij nową probówkę.Następnie dodaj odpowiednią liczbę rurek i nazwę. Aby przygotować wymagane wykresy, na karcie arkusza otwórz nowy arkusz. Gdy pojawi się nowe okno arkusza, przygotuj wykres punktowy z bocznym rozproszeniem w porównaniu z rozproszeniem do przodu, aby wybrać interesującą populację.Przygotuj wykres punktowy o wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu, aby wybrać populację pojedynczych komórek. Następnie przygotuj histogram liczby zdarzeń na tle interesującego nas fluoroforu. Upewnij się, że pulpit nawigacyjny do kontroli pobierania próbki, inspektor i cytometr w celu dostosowania parametrów napięcia, a także arkusz roboczy ze wszystkimi wykresami są otwarte przed rozpoczęciem cytometrii przepływowej.Najpierw uruchom nieleczone komórki. Upewnij się, że strzałka wskazująca rurkę jest zielona. Jeśli ta strzałka nie jest zielona, kliknij strzałkę, aby zmienić ją na zieloną.Za pomocą pipety przenieś każdą próbkę z czarnej płytki 96-dołkowej do probówki do cytometrii przepływowej. Na pulpicie nawigacyjnym pobierania wybierz odpowiednią liczbę zdarzeń do zarejestrowania, zmień natężenie przepływu na niskie i kliknij przycisk Pobierz dane. Dostosuj napięcie dla parametrów FSC i SCC, upewniając się, że populacja komórek jest scentralizowana na wykresie kropkowym i że żadne komórki nie stykają się z żadną osią wykresu, aby uniknąć utraty interesujących komórek.Zdefiniuj pierwszą bramkę, identyfikując i wybierając populację będącą przedmiotem zainteresowania na wykresie zagęszczenia rozproszonego do przodu i z boku, z wyłączeniem szczątków, które stanowią populację o najniższym sygnale rozproszenia do przodu. Zdefiniuj drugą bramkę, wykluczając populacje komórek dubletowych, ponieważ komórki dubletowe znacząco wpływają na wyniki i wnioski. Zwiększ szybkość akwizycji do średniej lub wysokiej, aby szybciej analizować próbki, ale nie przekraczaj więcej niż 200 do 300 zdarzeń na sekundę.Następnie kliknij przycisk nagraj dane. Po dostosowaniu napięcia i bramkowaniu oraz zarejestrowaniu danych, wyjmij próbkę i kliknij Next Tube. Wstawić następną próbkę i powtórzyć zapis danych dla wszystkich próbek kontrolnych i testowych.Po zebraniu wszystkich danych umyj cytometr przepływowy, uruchamiając trzy probówki z 50% wybielaczem, FACSRinse i ultraczystą wodą, każda przez pięć minut przy wysokim natężeniu przepływu. Następnie z menu rozwijanego cytometru kliknij opcję Fluidics shut down. Wyeksportuj wynik jako pliki fsc na dysk USB w celu przesłania.Przeanalizuj je za pomocą oprogramowania do analizy, naciskając nowy przycisk, aby utworzyć nowy dokument i okno do obsługi analizy, a następnie przeciągnij przykładowe pliki do nowego okna. Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć niezabarwioną próbkę. Aby bramkować populację pojedynczych komórek, wybierz populację P1 i kliknij dwukrotnie populację P1, aby utworzyć wykres FSCH i FSCA.Kliknij dwukrotnie bramkowane pojedyncze komórki, aby utworzyć histogram zdarzeń względem użytego fluorochromu. W oryginalnym oknie wybierz P1 i pojedyncze komórki, a następnie przeciągnij je do wszystkich próbek, tak aby wszystkie próbki zawierały teraz to samo bramkowanie. Następnie kliknij przycisk edytora układów, aby otworzyć okno układów i przeciągnij dwie próbki na siebie, aby utworzyć histogram nakładki.W komórkach MDA-MB-231 z dodatnim wynikiem EpCAM nałożenie histogramów reprezentujących komórki leczone TEPP i TENN pokazuje, że komórki poddane działaniu TEPP są przesunięte w prawo, w porównaniu z komórkami poddanymi działaniu TENN, co pokazuje, że wiązanie aptameru TEPP następuje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W kontroli ujemnej komórki HEK 293T nakładające się na histogramy TEPP i TENN nie odzwierciedlają żadnego przesunięcia wskazującego, że w komórkach wykazujących ekspresję EpCAM TEPP jest aptamerem EpCAM przyłączonym do swojego receptora. Co więcej, nie zaobserwowano wiązania w komórkach ujemnych EpCAM, co potwierdza selektywność i swoistość opracowanego aptameru.Upewnij się, że aptamery są chronione przed światłem, aptamery i komórki są zmieszane na płytce, a na cytometrze przepływowym ustawiono prawidłowe napięcia. Jest to w dużym stopniu uzależnione od przyszłych zastosowań aptamerów. Na przykład koncentrujemy się na dostarczaniu leków.Następnym krokiem będzie więc ocena, czy aptamery są internalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten pokazał, jak łatwo aptamery mogą zastąpić przeciwciała monoklonalne i poliklonalne w testach immunofenotypowych.

a-flow-cytometry-based-cell-surface-protein-binding-assay-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

W tym filmie opisujemy test konkurencyjnego wiązania oparty na cytometrii przepływowej, który wykrywa interakcje między receptorem CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) a jego fluorescencyjnie znakowanym naturalnym ligandem CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na CXCR4. Inkubacja komórek wykazujących ekspresję CXCR4 o niższych stężeniach małych cząsteczek umożliwia wiązanie CXCR4-CXCL12 do pewnego stopnia, które stopniowo zmniejsza się wraz ze stopniowym...

Konkurencyjny test wiązania w celu identyfikacji związków zakłócających interakcje receptor-ligand

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Celem tego protokołu jest ocena specyficzności leków przeciwnowotworowych in vitro przy użyciu mieszanych kultur zawierających zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe.

Ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Prezentujemy dwa różne protokoły barwienia do wykrywania ligandów NKG2D (NKG2DL) w próbkach ludzkiej pierwotnej ostrej białaczki szpikowej (AML). Pierwsze podejście opiera się na białku fuzyjnym, zdolnym do rozpoznania wszystkich znanych i potencjalnie jeszcze nieznanych ligandów, podczas gdy drugi protokół opiera się na dodaniu wielu przeciwciał anty-NKG2DL.

Dwa podejścia cytometrii przepływowej do wykrywania powierzchni liganda NKG2D w celu odróżnienia komórek macierzystych od subpopulacji masowych w ostrej białaczce szpikowej

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Ten protokół opisuje test blokady dla inhibitorów PD-1/PD-L1 przy użyciu technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Wykorzystuje dwuetapową strategię unieruchomienia i dostosowany system buforowy do dokładnego pomiaru jednostek reakcji, ułatwiając ocenę wskaźników blokady dla związków lub leków biologicznych. Dodatkowo wspomaga wysokoprzepustową identyfikację inhibitorów PD-1/PD-L1.

Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Poznaj test wiązania aptamerów do receptorów powierzchniowych komórek nowotworowych przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta metoda pozwala ocenić swoistość i selektywność aptamerów w zastosowaniach diagnostycznych.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego (Wideo) | JoVE Journal

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Przeglądaj więcej filmów