Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Protokół ten pomoże naukowcom, którzy dopiero zaczynają pracować z aptamerami, w wykorzystaniu ich w swoich projektach, a także w zrozumieniu poszczególnych małych kroków, które są wymagane do ukończenia protokołu. Aptamery są bardzo wszechstronne, a ten protokół pokazuje, jak łatwe i proste są w teście immunofenotypowania. Aptamery mogą być stosowane zarówno w zastosowaniach diagnostycznych, jak i terapeutycznych.

Protokół ten jest pierwszym krokiem podjętym w celu potwierdzenia ich specyficzności i czułości. Podczas gdy ten konkretny test demonstruje barwienie jednego receptora na powierzchni komórki, aptamery mogą być bardzo łatwo stosowane do wieloparametrycznej cytometrii przepływowej, zapewniając wysoki poziom wiedzy fenotypowej. Ważnymi aspektami pracy z aptamerami jest upewnienie się, że są one prawidłowo złożone przed użyciem, a także, że warunki bufora i siły jonowej są takie same, jak w momencie ich wyboru.

Po zebraniu i wyrzuceniu pożywki do kolby, dodać trzy mililitry PBS i rozprowadzić go po komórkach. Po dodaniu jednego mililitra 0,25% trypsyny-EDTA do każdej kolby, inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wizualizować oderwanie komórek pod mikroskopem. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki do komórek i pipetuj komórki w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Odpipetować komórki do odpowiedniej probówki i odwirować przy 200 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej pożywki i policzyć komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym, rozcieńczając pewną objętość zawiesiny komórek błękitem trypanowym. Rozprowadzić około 15 mikrolitrów mieszaniny między hemocytometrem a szkłem nakrywkowym, aby policzyć komórki.

Zbierz wymaganą liczbę komórek, upewniając się, że w próbce testowej znajduje się sto tysięcy komórek. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby umożliwić stabilizację interesującego białka na błonie komórkowej po enzymatycznym oderwaniu. Po dwugodzinnej inkubacji odwirować komórki o sile 500 G przez pięć minut.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu blokującego. Inkubować komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut z przerywanym mieszaniem. Podczas tej 30-minutowej inkubacji należy przeprowadzić składanie aptamerów, przygotowując dwukrotne stężenia aptamerów opisane w manuskrypcie.

Następnie wymieszać i inkubować aptamery za pomocą termocyklera zgodnie z wymaganymi warunkami składania, zapewniając jednocześnie ochronę aptamerów przed światłem. Po 30-minutowej inkubacji odwirować komórki, jak pokazano wcześniej, i usunąć supernatant. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do przemywania i ponownie odwiruj komórki.

Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu wiążącego. Następnie odpipetuj 50 mikrolitrów zawieszonych komórek do każdej studzienki lodowatej czarnej płytki z 96 dołkami. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów aptamerów na komórki o objętości 50 mikrolitrów, wymieszać i inkubować w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, ostrożnie ponownie zawiesić osad w buforze do przemywania i ponownie odwirować przy 500 G przez pięć minut. Następnie ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach buforu do przemywania do analizy metodą cytometrii przepływowej, powtarzając dwukrotnie etap płukania. Najpierw włącz cytometr przepływowy, a następnie komputer.

Następnie otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej, zaloguj się do programu i pod zakładką cytometr uruchom uruchamianie płynu. Aby utworzyć nowy eksperyment, na karcie eksperymentu kliknij nowy folder i odpowiednio nazwij eksperyment z ukośnikiem folderu. Kliknij nowy folder, aby go podświetlić.

Następnie ponownie na karcie eksperymentu kliknij nowy eksperyment i odpowiednio nazwij eksperyment. Aby dodać pierwszą próbkę z ukośnikiem, na karcie eksperymentu kliknij nową próbkę i odpowiednio nazwij próbkę. Aby dodać próbkę probówki, zaznacz próbkę i na karcie eksperymentu kliknij nową probówkę.

Następnie dodaj odpowiednią liczbę rurek i nazwę. Aby przygotować wymagane wykresy, na karcie arkusza otwórz nowy arkusz. Gdy pojawi się nowe okno arkusza, przygotuj wykres punktowy z bocznym rozproszeniem w porównaniu z rozproszeniem do przodu, aby wybrać interesującą populację.

Przygotuj wykres punktowy o wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu, aby wybrać populację pojedynczych komórek. Następnie przygotuj histogram liczby zdarzeń na tle interesującego nas fluoroforu. Upewnij się, że pulpit nawigacyjny do kontroli pobierania próbki, inspektor i cytometr w celu dostosowania parametrów napięcia, a także arkusz roboczy ze wszystkimi wykresami są otwarte przed rozpoczęciem cytometrii przepływowej.

Najpierw uruchom nieleczone komórki. Upewnij się, że strzałka wskazująca rurkę jest zielona. Jeśli ta strzałka nie jest zielona, kliknij strzałkę, aby zmienić ją na zieloną.

Za pomocą pipety przenieś każdą próbkę z czarnej płytki 96-dołkowej do probówki do cytometrii przepływowej. Na pulpicie nawigacyjnym pobierania wybierz odpowiednią liczbę zdarzeń do zarejestrowania, zmień natężenie przepływu na niskie i kliknij przycisk Pobierz dane. Dostosuj napięcie dla parametrów FSC i SCC, upewniając się, że populacja komórek jest scentralizowana na wykresie kropkowym i że żadne komórki nie stykają się z żadną osią wykresu, aby uniknąć utraty interesujących komórek.

Zdefiniuj pierwszą bramkę, identyfikując i wybierając populację będącą przedmiotem zainteresowania na wykresie zagęszczenia rozproszonego do przodu i z boku, z wyłączeniem szczątków, które stanowią populację o najniższym sygnale rozproszenia do przodu. Zdefiniuj drugą bramkę, wykluczając populacje komórek dubletowych, ponieważ komórki dubletowe znacząco wpływają na wyniki i wnioski. Zwiększ szybkość akwizycji do średniej lub wysokiej, aby szybciej analizować próbki, ale nie przekraczaj więcej niż 200 do 300 zdarzeń na sekundę.

Następnie kliknij przycisk nagraj dane. Po dostosowaniu napięcia i bramkowaniu oraz zarejestrowaniu danych, wyjmij próbkę i kliknij Next Tube. Wstawić następną próbkę i powtórzyć zapis danych dla wszystkich próbek kontrolnych i testowych.

Po zebraniu wszystkich danych umyj cytometr przepływowy, uruchamiając trzy probówki z 50% wybielaczem, FACSRinse i ultraczystą wodą, każda przez pięć minut przy wysokim natężeniu przepływu. Następnie z menu rozwijanego cytometru kliknij opcję Fluidics shut down. Wyeksportuj wynik jako pliki fsc na dysk USB w celu przesłania.

Przeanalizuj je za pomocą oprogramowania do analizy, naciskając nowy przycisk, aby utworzyć nowy dokument i okno do obsługi analizy, a następnie przeciągnij przykładowe pliki do nowego okna. Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć niezabarwioną próbkę. Aby bramkować populację pojedynczych komórek, wybierz populację P1 i kliknij dwukrotnie populację P1, aby utworzyć wykres FSCH i FSCA.

Kliknij dwukrotnie bramkowane pojedyncze komórki, aby utworzyć histogram zdarzeń względem użytego fluorochromu. W oryginalnym oknie wybierz P1 i pojedyncze komórki, a następnie przeciągnij je do wszystkich próbek, tak aby wszystkie próbki zawierały teraz to samo bramkowanie. Następnie kliknij przycisk edytora układów, aby otworzyć okno układów i przeciągnij dwie próbki na siebie, aby utworzyć histogram nakładki.

W komórkach MDA-MB-231 z dodatnim wynikiem EpCAM nałożenie histogramów reprezentujących komórki leczone TEPP i TENN pokazuje, że komórki poddane działaniu TEPP są przesunięte w prawo, w porównaniu z komórkami poddanymi działaniu TENN, co pokazuje, że wiązanie aptameru TEPP następuje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W kontroli ujemnej komórki HEK 293T nakładające się na histogramy TEPP i TENN nie odzwierciedlają żadnego przesunięcia wskazującego, że w komórkach wykazujących ekspresję EpCAM TEPP jest aptamerem EpCAM przyłączonym do swojego receptora. Co więcej, nie zaobserwowano wiązania w komórkach ujemnych EpCAM, co potwierdza selektywność i swoistość opracowanego aptameru.

Upewnij się, że aptamery są chronione przed światłem, aptamery i komórki są zmieszane na płytce, a na cytometrze przepływowym ustawiono prawidłowe napięcia. Jest to w dużym stopniu uzależnione od przyszłych zastosowań aptamerów. Na przykład koncentrujemy się na dostarczaniu leków.

Następnym krokiem będzie więc ocena, czy aptamery są internalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten pokazał, jak łatwo aptamery mogą zastąpić przeciwciała monoklonalne i poliklonalne w testach immunofenotypowych.