Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy
23 sierpnia 2022
Obecny protokół opisuje procedurę radiologii interwencyjnej ustaloną dla iniekcji dograsiczych u myszy, aby uniknąć ryzyka otwartej operacji i poprawić dokładność ślepych iniekcji przezskórnych.
Protokół zapewnia dokładną, bezpieczną i wydajną niechirurgiczną alternatywę dla tradycyjnych metod chirurgicznych i ślepych iniekcji. Jest to również najdokładniejsza technika wstrzykiwania grzybicy atroficznej u myszy w wieku lub z niedoborem odporności. Kluczową zaletą jest minimalnie stresująca procedura iniekcji, która jest bardzo bezpieczna i precyzyjna, ale także szybka, umożliwiając w ten sposób eksperymenty na dużą skalę bez uszczerbku dla danych spowodowanych immunosupresją związaną ze stresem chirurgicznym.
Utrzymanie wyrównania igły i przetwornika podczas przesuwania go przez ścianę klatki piersiowej wymaga pewnej praktyki. Dlatego zalecamy współpracę z doświadczonym radiologiem interwencyjnym w celu wykonania iniekcji lub przeprowadzenia szkolenia. W zademonstrowaniu procedury pomoże Shaina Anuncio, technik z mojego laboratorium.
Na początek nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na przednią część klatki piersiowej myszy na mniej niż minutę, aby usunąć sierść. Użyj mokrego ręcznika papierowego, aby usunąć krem i luźną sierść. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, nie reagując na uszczypnięcie tylnej łapy.
Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Umieszczaj jedną mysz na raz w pozycji leżącej na plecach na podgrzewanej platformie stacji do obrazowania ultrasonograficznego dla małych zwierząt z założonym stożkiem nosowym. Przymocuj mysz do sceny za pomocą medycznej taśmy klejącej na tylnych i przednich kończynach.
Zdezynfekuj pozbawioną sierści skórę górnej części klatki piersiowej za pomocą aplikatora glukonianu chlorheksydyny. Aktywuj sondę liniową o najwyższej dostępnej częstotliwości. Zazwyczaj sonda o najwyższej rozdzielczości przestrzennej w stosunku do wielkości obrazowanego zwierzęcia.
Aktywuj sondę, dotykając odpowiedniego przycisku po ekranie startowym. Aby zoptymalizować ustawienia ultrasonograficzne do obrazowania i wstrzykiwania, dostosuj głębię pola widzenia do rozmiaru odpowiedniego dla docelowego zwierzęcia, regulując pionowo zorientowane suwaki po prawej stronie ekranu. Dostosuj wzmocnienie skali szarości, przesuwając przycisk wzdłuż poziomego paska u dołu ekranu.
Następnie dostosuj strefę ogniskową do przewidywanego poziomu grasicy. Nałóż około jednego mililitra żelu ultradźwiękowego na powierzchnię przetwornika, gdy jest on ustawiony pionowo, spoczywając w uchwycie aparatu ultrasonograficznego lub w rękach asystenta. Aby przygotować małe sterylne pole obok podgrzewanej platformy, opróżnij sterylną osłonę sondy, gumkę, sterylne rękawiczki i sterylny żel ultradźwiękowy na sterylne pole.
Następnie załóż sterylne rękawiczki. Ostrożnie umieść sterylną osłonę sondy na przetworniku ultradźwiękowym i żelu. Aby zachować sterylność, dotykaj tylko sterylnej pokrywy.
Nasuń sterylną gumową opaskę na osłonę sondy, aby utrzymać ją na miejscu. Umieść dwa do trzech mililitrów sterylnego żelu ultradźwiękowego na głowicy. Umieść sondę ultradźwiękową z żelem pionowo na zdezynfekowanej części przedniej ściany klatki piersiowej myszy w celu wstępnego obrazowania, zachowując sterylność.
Przeglądaj i optymalizuj obraz ultrasonograficzny, jak pokazano wcześniej. Aby zeskanować przednią część klatki piersiowej myszy w płaszczyźnie poprzecznej, trzymaj przetwornik pionowo i przesuwaj go w górę iw dół od szyi do brzucha ruchem przypominającym pędzel lub zamaszystym. Z sercem wyśrodkowanym w polu view, przesuń przetwornik lekko w kierunku szyi.
Zwróć uwagę na dwie okrągłe, sparowane czarne struktury po obu stronach górnej części klatki piersiowej. Za pomocą sondy ultradźwiękowej zlokalizuj najszerszą część grasicy, która jest zwykle idealnym miejscem docelowym do wstrzyknięcia. Przewiduj poziomą trajektorię igły w wybranym miejscu i zwróć uwagę, gdzie znajdują się główne naczynia krwionośne w tym miejscu.
Podczas wstrzykiwania należy unikać tych naczyń. Naczynia krwionośne będą hipoechogenicznymi strukturami pulsacyjnymi. Jeśli nie masz pewności, aktywuj tryb kolorowego Dopplera, dotykając przycisku koloru na ekranie, aby sprawdzić przepływ w naczyniach.
Trzymaj przetwornik w jednej ręce, a igłę insuliny o rozmiarze 30 z 10 mikrolitrami wstrzyknięcia w drugiej. Aby rozpocząć proces wstrzykiwania, należy przesunąć głowicę na bok, tak aby grasica znajdowała się poza środkiem w polu widzenia ultrasonograficznego. Upewnij się, że druga strona pola widzenia składa się głównie z żelu do ultradźwięków i nic więcej.
Umieść końcówkę igły w żelu pod przetwornikiem i powoli przesuwaj igłę, aż zostanie uwidoczniona w pobliżu powierzchni skóry. Wykonując ciągłe obrazowanie igły pod wpływem ultradźwięków, wprowadź igłę do grasicy trajektorią przezskórną z dala od naczyń krwionośnych. Użyj poprzecznej trajektorii poziomej grasicy, aby umieścić końcówkę igły w płacie grasicy po przeciwnej stronie do miejsca wprowadzenia.
Gdy końcówka igły znajdzie się w żądanej części grasicy, szybko wstrzyknij zawartość ze strzykawki o rozmiarze 30, korzystając z wizualizacji ultrasonograficznej. Aby ustabilizować strzykawkę podczas wprowadzania igły i wstrzykiwania, należy trzymać strzykawkę między kciukiem a trzecim palcem i kontrolować tłok strzykawki palcem wskazującym. Wyjąć igłę po zdeponowaniu całej zawartości.
U młodych myszy identyfikacja grasicy była prosta ze względu na duży rozmiar gruczołu. Było to trudniejsze u myszy starszych lub z niedoborem odporności. Jednak nadal było to bardzo wykonalne przy użyciu nowoczesnego sprzętu ultrasonograficznego.
Udane wstrzyknięcie obserwowano, gdy igła nie przechodziła przez krytyczne struktury, takie jak serce, aorta lub jedna z żył głównych dolnych. Końcówkę igły uwidoczniono w miejscu docelowym podczas iniekcji, potwierdzając osadzanie się w grasicy. Lokalizacja wstrzyknięcia w obrębie grasicy została potwierdzona przy użyciu lucyferyny jako zastrzyku dla transgenicznych myszy lucyferazy.
Zostały one natychmiast ocenione za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, potwierdzając prawidłowe miejsce wstrzyknięcia bez poświęcania zwierzęcia. Alternatywnie, błękit trypanowy wstrzyknięto jako wizualny marker miejsca wstrzyknięcia i dokładności wstrzyknięcia przy użyciu ex vivo z sekcją zwłok. Nasza grupa używała tej techniki w kilku dużych badaniach, w tym w badaniach nad immunoterapią nowotworów, opartą na wstrzykiwaniu genetycznie zmodyfikowanych komórek progenitorowych oraz w celu poprawy funkcji grasicy u myszy z niedoborem odporności.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje niechirurgiczną metodę iniekcji wewnątrzgrasiczkowej u myszy, która zwiększa precyzję i bezpieczeństwo w porównaniu z tradycyjnymi technikami. Jest ona szczególnie korzystna w przypadku zanikłych grasic u myszy w starszym wieku lub z niedoborami odporności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Radiologia interwencyjna
- Modele zwierzęce
- Techniki wstrzykiwania
Wstęp
- Tradycyjne metody chirurgiczne wiążą się z ryzykiem i występowaniem powikłań.
- Iniekcje „na ślepo” mogą prowadzić do niedokładności oraz stresu u badanych osobników.
- W przypadku eksperymentów na dużą skalę konieczne są alternatywy niechirurgiczne.
- Współpraca z doświadczonymi specjalistami może zwiększyć precyzję techniki.
Cel badania
- Zapewnienie bezpieczniejszej i dokładniejszej metody wstrzykiwania.
- Ograniczenie immunosupresji związanej ze stresem u obiektów doświadczalnych.
- Umożliwienie prowadzenia badań na dużą skalę bez naruszania integralności danych.
Zastosowane metody
- Opracowanie protokołu iniekcji wewnątrzgrasiczkowej.
- Współpraca z radiologami zabiegowymi w celu przeszkolenia.
- Wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego do pozycjonowania igły.
- Ocena skuteczności iniekcji w różnych modelach mysich.
Główne wyniki
- Metoda jest dokładna i minimalizuje stres u myszy.
- Jest ona skuteczna w przypadku zanikniętego grasicy u myszy starych lub z niedoborami odporności.
- Szybkość wykonania pozwala na zastosowanie rozbudowanych układów eksperymentalnych.
- Szkolenie prowadzone przez doświadczony personel zwiększa niezawodność techniki.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi praktyczną alternatywę dla metod chirurgicznych.
- Zwiększa on dokładność iniekcji wewnątrzgrasiczych.
- Przyszłe badania mogą odnieść korzyści z zastosowania tego małoinwazyjnego podejścia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni, obrazowo sterowany wtrysk śródgrasiczkowy u myszy rozwiązuje krytyczny problem w badaniach nad immunologią i terapią komórkową, umożliwiając precyzyjne, małoinwazyjne dostarczanie substancji do grasicy. Technika ta ogranicza stres związany z zabiegiem oraz immunosupresję, wspierając wysokiej wierności badania rozwoju limfocytów T i modulacji odpornościowej. Jej efektywność i powtarzalność ułatwiają przeprowadzanie szerokich, kluczowych eksperymentów w przedklinicznych procesach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią manipulację mikrośrodowiskiem grasicy w celu prowadzenia badań mechanistycznych nad ontogenezą limfocytów T.
- Wspiera funkcjonalną walidację interwencji genetycznych lub komórkowych w kontekstach immunologicznych istotnych dla przebiegu chorób.
- Redukuje wpływ zmiennych zakłócających wynikających ze stresu chirurgicznego, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach ukierunkowanych na układ odpornościowy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli in vivo do dalszych analiz funkcji odpornościowych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację dostarczania komórek lub odczynników do grasicy.
- Umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe projekty eksperymentalne do screeningu modulacji odporności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera badania translacyjne nad rekonstytucją odporności i regeneracją grasicy w modelach starzejących się lub z niedoborem odporności.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po walidację przedkliniczną terapii komórkowych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez minimalizację immunosupresji wywołanej procedurami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda wstrzykiwania pod kontrolą USG integruje się z wczesnym etapem przejścia od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając skuteczną manipulację i analizę układu odpornościowego in vivo.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących interwencji w grasicy oraz modulacji szlaków odpornościowych.
- Przesiewanie: Zapewnia spójne, ilościowe dawkowanie in vivo niezbędne do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Pozwala na potwierdzenie dokładności wtryskiwania w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania oraz dzięki markerom walidacyjnym po wtryskiwaniu.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając interwencje w modelach immunodeficyjnych, starzejących się lub istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy ustandaryzowaną, skalowalną platformę do powtarzalnych badań ukierunkowanych na układ odpornościowy w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach ukierunkowanych na układ odpornościowy.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i wydajność badań immunologicznych in vivo.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka biologicznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów o działaniu immunomodulującym.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w iniekcjach pod kontrolą USG oraz dostępu do sprzętu obrazowego o wysokiej rozdzielczości.
- Wymaga przeszkolenia zespołów oraz standaryzacji w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Możliwość zastosowania w różnych modelach myszy, w tym w szczepach starzejących się i niedoborowych odporniowo.
- Minimalizuje zachorowalność i śmiertelność zwierząt w porównaniu z alternatywami chirurgicznymi.
- Zależność od biegłości operatora w celu zapewnienia optymalnej dokładności i efektywności.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Animal Preparation
1:47
Preparation of the Ultrasound Machine and Sterile Field
3:14
Imaging and Locating the Thymus
3:55
Injection of the Thymus
5:45
Results: An Ultrasound‐Guided Free‐Hand Intrathymic Injection in Mice
6:47
Conclusion
