Name: Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną technikę wstrzykiwania dograsicznego u myszy z wykorzystaniem ultrasonografii. Ta metoda zapewnia precyzję i bezpieczeństwo przy badaniach immunologicznych na dużą skalę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Raymondowi H. Thorntonowi za jego wnikliwą i wszechstronną wczesną pracę nad tą techniką. Badanie to zostało sfinansowane z grantu National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children's Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine oraz HUMC Foundation/Tackle Kids Cancer.

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami w Centrum Odkryć i Innowacji (protokół IACUC 290). W niniejszym badaniu myszy C57BL / 6 (samica, 4-6 tygodni), myszy C57BL / 6 (samica, 6 miesięcy), samice myszy J: NU, samice myszy NOD scid gamma (NSG) i B6; Myszy CAG-luc, -GFP wykorzystano odpowiednio jako model młodej myszy, model myszy w podeszłym wieku, model nago atymicznym, model z niedoborem odporności i źródło komórek bioluminescencyjnych. Myszy uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Ta procedura zazwyczaj wymaga dwóch osób (jedna do zachowania bezpłodności podczas wykonywania zastrzyków, a druga do obsługi myszy).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie u myszy za pomocą 3%-4% gazu izofluranu i utrzymać znieczulenie za pomocą 1%-3% gazu izofluranu podawanego przez stożek nosowy i precyzyjnie skalibrowany parownik (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Potwierdź odpowiednią głębokość/utratę przytomności przez brak reakcji na uszczypnięcie tylnej łapy.</li>
	<li>Usuń sierść z przedniej części klatki piersiowej myszy, nakładając cienką warstwę kremu do depilacji na mniej niż 1 minutę. Użyj mokrego ręcznika papierowego, aby całkowicie usunąć krem wraz z luźną sierścią. 
	UWAGA: Nałożenie zbyt dużej ilości kremu spowoduje stan zapalny skóry w okolicy klatki piersiowej.</li>
	<li>Umieszczaj jedną mysz na raz, leżąc na wznak, na podgrzewanej platformie stacji do obrazowania ultrasonograficznego dla małych zwierząt (patrz Tabela Materiałów) z umieszczonym stożkiem nosowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Przymocuj mysz do sceny za pomocą medycznej taśmy klejącej na tylnych i przednich kończynach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Zdezynfekuj pozbawioną sierści górną część klatki piersiowej za pomocą aplikatora glukonianu chlorheksydyny (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Przygotowanie ultrasonografu i sterylnego pola
<ol>
	<li>Aktywuj sondę liniową o najwyższej dostępnej częstotliwości, zazwyczaj sondę o najwyższej rozdzielczości przestrzennej w stosunku do wielkości obrazowanego zwierzęcia. Aktywuj sondę, dotykając odpowiedniego przycisku po ekranie startowym. 
	UWAGA: Do tego zastosowania z myszami używana sonda jest zaprojektowana specjalnie do użytku z myszami i małymi szczurami (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zoptymalizuj ustawienia ultrasonograficzne do obrazowania i wstrzykiwania, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Dostosuj głębię pola widzenia do odpowiedniego rozmiaru dla docelowego zwierzęcia, dostosowując pionowo zorientowane suwaki po prawej stronie ekranu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Maksymalne ustawienie głębokości wynosi zwykle około 6-8 mm dla młodych myszy.</li>
		<li>Dostosuj wzmocnienie skali szarości, przesuwając przycisk wzdłuż poziomego paska u dołu ekranu (Rysunek 2). Celem jest rozpoczęcie od obrazu, który jest tylko nieco ciemniejszy niż typowy "szary" wygląd.</li>
		<li>Dostosuj strefę ogniskowania (niebieska strzałka po prawej stronie ekranu, <silna klasa="xfig">Rysunek 2) do przewidywanego poziomu grasicy. W przypadku młodych myszy będzie to głębokość około 4 mm.</li>
		<li>Jeśli wymagane jest przechwycenie obrazu, przetestuj funkcjonalność przycisków store image i store clip, aby upewnić się, że obrazy mogą być odpowiednio zapisywane podczas całej procedury. Aby to zrobić, dotknij przycisku Zapisz klip w prawym dolnym rogu ekranu lub stukając przycisku Zablokuj, a następnie stukając Zapisz obraz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż niewielką ilość (~1 ml) żelu ultradźwiękowego na powierzchnię przetwornika (patrz Tabela materiałów), gdy jest on ustawiony pionowo, spoczywając w uchwycie aparatu ultrasonograficznego lub w rękach asystenta.</li>
	<li>Przygotuj małe sterylne pole obok podgrzewanej platformy. Optymalna pozycja do tego celu znajduje się zwykle między platformą a aparatem ultrasonograficznym.
	<ol>
		<li>Opróżnij te przedmioty na sterylne pole: sterylną osłonę sondy, gumową opaskę, sterylne rękawiczki i sterylny żel do ultradźwięków (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Po ustawieniu sterylnego pola i umieszczeniu przedmiotów na miejscu, załóż sterylne rękawice.</li>
		<li>Ostrożnie umieść sterylną osłonę sondy na przetworniku ultradźwiękowym (a także na żelu, który został początkowo umieszczony na sondzie). Zachowaj sterylność i dotykaj tylko sterylnej osłony, niczego więcej. Nasuń sterylną gumową opaskę na sterylną osłonę sondy, aby utrzymać ją na miejscu. 
		UWAGA: Ogniska powietrzne, niezależnie od wielkości, mogą zakłócać obrazowanie ultradźwiękowe. Dlatego konieczne jest nałożenie żelu ultradźwiękowego między przetwornikiem a sterylną osłoną sondy oraz na wierzch osłony sondy, aby zapewnić wolny od powietrza interfejs między sondą ultradźwiękową a zwierzęciem. </li>
		<li>Umieść umiarkowaną ilość (2-3 ml) sterylnego żelu ultradźwiękowego na przetworniku. 
		UWAGA: Użytkownik jest teraz gotowy do zobrazowania znieczulonej myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie i lokalizacja grasicy
<ol>
	<li>Zachowując sterylność, umieść sondę ultradźwiękową z żelem pionowo na zdezynfekowanej części przedniej ściany klatki piersiowej myszy w celu wstępnego obrazowania.
	<ol>
		<li>Poświęć chwilę, aby spojrzeć na obraz ultrasonograficzny i jeszcze bardziej go zoptymalizować. Wróć do kroku 2.2 i dostosuj, aby uzyskać wygląd podobny do tego z Rysunek 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zeskanuj przednią klatkę piersiową myszy w płaszczyźnie poprzecznej. Wykonaj to, trzymając przetwornik pionowo i przesuwając go w górę iw dół od szyi do brzucha ruchem przypominającym pędzel lub "zamaszystym". 
	UWAGA: Serce będzie najbardziej rozpoznawalną strukturą w klatce piersiowej ze względu na jego szybki ruch i "komorowy" wygląd. Gdy serce zostanie zlokalizowane, można to wykorzystać jako punkt odniesienia do uzyskania obrazu grasicy.</li>
	<li>Z sercem wyśrodkowanym w polu view, przesuń przetwornik lekko w kierunku szyi. Zwykle spotyka się grasicę znajdującą się nad sercem.</li>
	<li>Wyobraź sobie grasicę jako dwupłatkową, piramidalną, hipoechogeniczną ("ciemną" lub "czarną" pojawiającą się na ekranie) strukturę, która jest wyśrodkowana w linii środkowej, przed aortą i za mostkiem (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3A).</li>
	<li>Zanotuj dwie okrągłe, sparowane czarne (tj. "hipoechogeniczne") struktury po obu stronach górnej części klatki piersiowej. 
	UWAGA: Są to obustronne żyły główne. Aorta jest podobną krzywoliniową hipoechoicznej strukturą w linii środkowej między dwiema żyłami głównymi. Są one łatwo rozpoznawalne po ich pulsacyjnym ruchu.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie grasicy
<ol>
	<li>W razie potrzeby nałóż więcej (2-3 ml) sterylnego żelu ultradźwiękowego na przetwornik. 
	UWAGA: Stosunkowo duża ilość sterylnego żelu na głowicy (w porównaniu z rozmiarem klatki piersiowej myszy) będzie działać jak "podkładka żelowa" wokół ściany klatki piersiowej myszy. Zmniejszy to liczbę artefaktów ultradźwiękowych wytwarzanych przez powietrze w polu widzenia.</li>
	<li>Za pomocą sondy ultradźwiękowej zlokalizuj najszerszą część grasicy, która jest zwykle idealnym miejscem docelowym do wstrzyknięcia. Przewiduj poziomą trajektorię igły w wybranym miejscu.
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę, gdzie znajdują się główne naczynia krwionośne (SVC i aorta) w tym miejscu. Należy unikać tych objawów podczas wstrzykiwania.</li>
		<li>Naczynia krwionośne będą hipoechogenicznymi, pulsacyjnymi strukturami, jak opisano w kroku 3.7. Jeśli nie masz pewności, użyj trybu kolorowego Dopplera, aby sprawdzić przepływ w naczyniach (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4A). Aktywuj tryb kolorowego Dopplera, dotykając przycisku Kolor na ekranie.</li>
		<li>Jeśli przewiduje się, że jedno z głównych naczyń krwionośnych (lub serce) znajdzie się wzdłuż oczekiwanej trajektorii igły, wybierz nowy obszar docelowy lub znajdź inne podejście/trajektorię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymać przetwornik w jednej ręce, a igłę do insuliny 30 G (patrz tabela materiałów) z 10 μl wstrzyknięcia w drugiej. 
	UWAGA: Wstrzykiwanie będzie się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego. W niniejszym badaniu wykorzystano sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, błękit trypanowy lub D-lucyferynę (0,1 μg/10 μL).</li>
	<li>Aby rozpocząć proces wstrzykiwania, należy przesunąć głowicę na bok, tak aby grasica znajdowała się poza środkiem w polu widzenia ultrasonograficznego. Upewnij się, że druga strona pola widzenia składa się głównie z żelu do ultradźwięków i nic więcej.</li>
	<li>Umieść końcówkę igły w żelu pod głowicą i powoli przesuwaj igłę, aż zostanie uwidoczniona w sąsiedztwie powierzchni skóry (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B).</li>
	<li>Wykonując ciągłe obrazowanie igły pod kątem ultradźwięków, wprowadź igłę do grasicy trajektorią przezskórną, z dala od naczyń krwionośnych.
	<ol>
		<li>Użyj poziomej trajektorii "poprzecznej grasicy", aby umieścić końcówkę igły w płacie grasicy po przeciwnej stronie do miejsca wprowadzenia. Odpowiada to za potencjalny wyciek wzdłuż przewodu igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy końcówka igły znajdzie się w żądanej części grasicy, szybko wstrzyknij zawartość (np. 10 μl błękitu trypanowego lub D-lucyferyny, 0,1 μg/10 μl) ze strzykawki 30 G, korzystając z wizualizacji ultrasonograficznej.
	<ol>
		<li>Aby ustabilizować strzykawkę podczas wprowadzania igły i wstrzykiwania, należy trzymać strzykawkę między kciukiem a trzecim palcem i kontrolować tłok strzykawki palcem wskazującym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć igłę po zdeponowaniu całej zawartości.</li>
</ol>
5. Monitorowanie zwierząt po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Przenieść zwierzę do pustej klatki i obserwować, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. 
	UWAGA: Oczekuje się, że pełne wyzdrowienie ze znieczulenia nastąpi w ciągu 2 minut.</li>
	<li>Monitoruj zwierzę przez dodatkowe 10 minut pod kątem oznak niepokoju, trudności w oddychaniu lub krwawienia. 
	UWAGA: Nie oczekuje się bólu po wstrzyknięciu i zazwyczaj nie ma potrzeby stosowania znieczulenia po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Po całkowitym wyzdrowieniu i po spokojnym okresie obserwacji po wstrzyknięciu, zwierzę, któremu wstrzyknięto wstrzyknięcie, należy zwrócić je do towarzystwa innych zwierząt.</li>
</ol>

<ol><li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li>
<li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%2C+leptin%2C+and+stress-induced+thymic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li>
<li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+dirty+mice%2C+and+men%3A+Using+mice+to+understand+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li>
<li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+animal+models+in+biomedical+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals+Research%22%5BJournal%5D)">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18(2022).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+What+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li>
<li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li>
<li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li>
<li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li>
<li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li>
<li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li>
<li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li>
<li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109(2017).</li>
<li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+induced+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Surgeon%22%5BJournal%5D)">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li>
<li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li>
<li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li>
<li>Küker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191(2018).</li>
<li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4%3ACD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Iniekcja z wolnej ręki pod kontrolą USG jest bardzo dokładną techniką dostarczania materiałów badawczych do grasicy w sposób wydajny i aseptyczny. Po wstępnej sterylizacji skóry w miejscu wstrzyknięcia, podczas zabiegu zostaje zachowana sterylność dzięki zastosowaniu sterylnych rękawiczek, sterylnych osłon sond ultradźwiękowych oraz sterylnego żelu do ultradźwięków. W przeciwieństwie do ślepego dostępu przezskórnego 10,17 lub polegającego na nacięciach chirurgicznych w celu bezpośrednie...

Grasica odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju limfocytów T i odporności. Niedobór limfocytów T, który może być spowodowany między innymi inwolucją grasicy, zaburzeniami genetycznymi, infekcjami i leczeniem raka, prowadzi do wysokiej śmiertelności i zachorowalności1,2. Modele mysie są niezbędne zarówno w podstawowych, jak i translacyjnych badaniach immunologicznych i są wykorzystywane od dziesięcioleci do badania biologii grasicy i rozwoju komórek T, a także do opracowywania metod leczenia osób cierpiących na dysfunkcję grasicy i niedobór limfocytów T3,4,5.
Centralną częścią badań grasicy było dograwicze wstrzykiwanie materiałów biologicznych, takich jak komórki, geny lub białka w modelach mysich6,7,8,9,10,11,12. Konwencjonalne metody iniekcji dograsiczastej obejmują torakotomię, a następnie wstrzyknięcie dograszicowe pod bezpośrednią wizualizacją lub "ślepe" przezskórne wstrzyknięcie do śródpiersia. Podejście chirurgiczne znacznie zwiększa m.in. ryzyko wystąpienia odmy opłucnowej. Co więcej, podwyższony stres podczas tej operacji powoduje immunosupresję, co potencjalnie zagraża danym immunologicznym13. Doświadczeni badacze, po pewnym nabraniu wprawy, mogą wykonać technikę wstrzykiwania na ślepo, ale to podejście jest mniej dokładne i dlatego ogranicza uczestników eksperymentu do młodych myszy z dużą grasicą.
Wykorzystanie wskazówek ultrasonograficznych zostało wprowadzone jako precyzyjna i minimalnie inwazyjna alternatywa dla tradycyjnych metod iniekcji dograsiowych14. Procedura ta jest jednak bardzo czasochłonna w przypadku korzystania ze zintegrowanego systemu szynowego zamiast techniki wolnej ręki. Wykonywanie iniekcji za pomocą mocowania iniekcyjnego wymaga starannej optymalizacji obrazowania i pozycjonowania przetwornika za pomocą różnych przystawek, takich jak podstawka i mocowanie przetwornika, system pozycjonowania X, Y i Z, a także sprawna obsługa elementów sterujących mikromanipulacją i przedłużeń systemu szynowego. Prosta technika alternatywna, iniekcja grasicy pod kontrolą USG, jest tutaj przedstawiona przez radiologa przy użyciu podejścia z wolnej ręki15, która jest zarówno szybką, jak i dokładną minimalnie inwazyjną alternatywą dla wyżej opisanych metod. Co ważne, obecne podejście można wykonać za pomocą dowolnego systemu obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości bez konieczności stosowania mocowania do iniekcji i zintegrowanego systemu szynowego. Jest to szczególnie przydatne w badaniach wymagających wstrzyknięcia dużej liczby myszy11, do eksperymentów obejmujących wstrzyknięcie obu płatów grasicy lub do dokładnego wstrzykiwania małych grzybic u myszy w podeszłym wieku, napromieniowanych lub z obniżoną odpornością12.

<table><tbody><tr><td>Aquasonic 100 Żel do ultradźwięków</td><td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td><td>01-01</td><td>Sterylny żel do transmisji ultradźwięków</td></tr><tr><td>B6; CAG-luc, mysz -GFP</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>025854</td><td>Źródło komórek bioluminescencyjnych</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe BD z igłą</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>328431</td><td>Ultracienka igła - 12,7 mm, 30 G</td></tr><tr><td>Mysz C57BL/6 - w wieku starzejącym</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>000664</td><td>wiek 6 miesięcy; model w wieku</td></tr><tr><td>C57BL/6 mysz - młoda</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>000664</td><td>wieku 4-6 tygodni; młoda</td></tr><tr><td>modelka Chloraprep One-step 0,67 ml</td><td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td><td>260449</td><td>aplikator glukonianu chlorheksydyny</td></tr><tr><td>Curity Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td><td>A5000-2</td><td>Sterylny, 6"</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5</td><td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td><td>n/a</td><td>System obrazowania bioluminescencyjnego in vivo</td></tr><tr><td>Mysz J:NU</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>007850</td><td>Atymiczny nagi model</td></tr><tr><td>Kendall Hipoalergiczna taśma papierowa</td><td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td><td>1914C</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Chirurgiczne rękawice nitrylowe</td><td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td><td>56892</td><td>Sterylne rękawiczki</td></tr><tr><td>Balsam do usuwania włosów Nair</td><td>Church i Dwight (Trenton, NJ, USA)</td><td>n/a</td><td>Środek do depilacji</td></tr><tr><td>Mysz NOD scid gamma (NSG)</td><td>Laboratorium Jacksona (Bar Harbor, ME, USA)</td><td>005557</td><td>Model z niedoborem odporności</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>21-040- </td><td></td>CV</tr><tr><td>Puralube Vet Maść</td><td>Med Vet International</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td>Maść do oczu</td></tr><tr><td>Pochewki</td><td>Technologie poszycia (Morgan Hill, CA, USA)</td><td>10040</td><td>Sterylne osłony sond ultradźwiękowych</td></tr><tr><td>Komora indukcyjna Sure-Seal</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td><td>EZ-17 85</td><td>Komora indukcyjna anestezjologii</td></tr><tr><td>Przetwornik MX550D</td><td>FUJIFILM VisualSonics ( Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>Sonda obrazowania Vevo 3100 (25-55 MHz, transmisja środkowa: 40 MHz)</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, 0,4% roztwór w PBS</td><td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td><td>91691049</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Vevo 3100</td><td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>System obrazowania ultrasonograficznego</td></tr><tr><td>Vevo 3100 Lab Software</td><td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>Wersja 3.2.7 do obrazowania i analizy</td></tr><tr><td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td><td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>Stołowy aparat anestezjologiczny na bazie izofluranu</td></tr><tr><td>Stacja obrazowania Vevo</td><td>VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>Platforma proceduralna</td></tr></tbody></table>

minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Wstrzyknięcie dograszkowe w modelach mysich jest ważną techniką do badania funkcji grasicy i układu odpornościowego, w tym genetycznych i nabytych zaburzeń limfocytów T. Wymaga to metod bezpośredniego osadzania odczynników i/lub komórek w grasicy żywych myszy. Tradycyjne metody iniekcji dograsicowej obejmują chirurgię klatki piersiowej lub minimalnie inwazyjne przezskórne ślepe iniekcje, z których obie mają znaczne ograniczenia. Urządzenia do obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości umożliwiły myszom wstrzykiwanie przezskórne pod kontrolą obrazu, znacznie poprawiając dokładność iniekcji w podejściu do iniekcji przezskórnej i umożliwiając wstrzykiwanie mniejszych celów. Jednak iniekcje sterowane obrazem opierają się na wykorzystaniu zintegrowanego systemu szynowego, co sprawia, że jest to sztywna i czasochłonna procedura. Przedstawiono tutaj unikalną, bezpieczną i skuteczną metodę przezskórnych wstrzyknięć dograsiczych u myszy, eliminującą zależność od systemu szynowego do wstrzykiwań. Technika ta opiera się na użyciu mikroultrasonografu o wysokiej rozdzielczości do nieinwazyjnego obrazowania grasicy myszy. Korzystając z techniki wolnej ręki, radiolog może umieścić końcówkę igły bezpośrednio w grasicy myszy pod kontrolą ultrasonograficzną. Myszy są czyszczone i znieczulane przed obrazowaniem. Dla doświadczonego radiologa biegłego w procedurach pod kontrolą ultradźwięków okres nauki tej techniki jest dość krótki, zwykle w ciągu jednej sesji. Metoda ta charakteryzuje się niską zachorowalnością i śmiertelnością u myszy i jest znacznie szybsza niż obecne techniki wspomagania mechanicznego do wstrzykiwań przezskórnych. Pozwala badaczowi na sprawne wykonywanie precyzyjnych i niezawodnych przezskórnych iniekcji grasicy dowolnej wielkości (w tym bardzo małych narządów, takich jak grasica u myszy w podeszłym wieku lub z niedoborem odporności) przy minimalnym stresie dla zwierzęcia. Metoda ta umożliwia wstrzykiwanie pojedynczych płatów w razie potrzeby i ułatwia eksperymenty na dużą skalę ze względu na oszczędność czasu procedury.

Pomyślna implementacja tej techniki opiera się na przestrzeganiu kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, należy zapewnić wiarygodną identyfikację samego grasicy. U młodych myszy jest to proste ze względu na duży rozmiar gruczołu (Rysunek 3A). U myszy starszych lub immunodeficyjnych może to być bardziej wymagające; jest to jednak wciąż w pełni wykonalne przy użyciu nowoczesnego sprzętu do ultrasonografii (Rysunek 3B,C). Po drugie, krytycznie ważne ...

Obecny protokół opisuje procedurę radiologii interwencyjnej ustaloną dla iniekcji dograsiczych u myszy, aby uniknąć ryzyka otwartej operacji i poprawić dokładność ślepych iniekcji przezskórnych.

Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Protokół zapewnia dokładną, bezpieczną i wydajną niechirurgiczną alternatywę dla tradycyjnych metod chirurgicznych i ślepych iniekcji. Jest to również najdokładniejsza technika wstrzykiwania grzybicy atroficznej u myszy w wieku lub z niedoborem odporności. Kluczową zaletą jest minimalnie stresująca procedura iniekcji, która jest bardzo bezpieczna i precyzyjna, ale także szybka, umożliwiając w ten sposób eksperymenty na dużą skalę bez uszczerbku dla danych spowodowanych immunosupresją związaną ze stresem chirurgicznym.Utrzymanie wyrównania igły i przetwornika podczas przesuwania go przez ścianę klatki piersiowej wymaga pewnej praktyki. Dlatego zalecamy współpracę z doświadczonym radiologiem interwencyjnym w celu wykonania iniekcji lub przeprowadzenia szkolenia. W zademonstrowaniu procedury pomoże Shaina Anuncio, technik z mojego laboratorium.Na początek nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na przednią część klatki piersiowej myszy na mniej niż minutę, aby usunąć sierść. Użyj mokrego ręcznika papierowego, aby usunąć krem i luźną sierść. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, nie reagując na uszczypnięcie tylnej łapy.Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Umieszczaj jedną mysz na raz w pozycji leżącej na plecach na podgrzewanej platformie stacji do obrazowania ultrasonograficznego dla małych zwierząt z założonym stożkiem nosowym. Przymocuj mysz do sceny za pomocą medycznej taśmy klejącej na tylnych i przednich kończynach.Zdezynfekuj pozbawioną sierści skórę górnej części klatki piersiowej za pomocą aplikatora glukonianu chlorheksydyny. Aktywuj sondę liniową o najwyższej dostępnej częstotliwości. Zazwyczaj sonda o najwyższej rozdzielczości przestrzennej w stosunku do wielkości obrazowanego zwierzęcia.Aktywuj sondę, dotykając odpowiedniego przycisku po ekranie startowym. Aby zoptymalizować ustawienia ultrasonograficzne do obrazowania i wstrzykiwania, dostosuj głębię pola widzenia do rozmiaru odpowiedniego dla docelowego zwierzęcia, regulując pionowo zorientowane suwaki po prawej stronie ekranu. Dostosuj wzmocnienie skali szarości, przesuwając przycisk wzdłuż poziomego paska u dołu ekranu.Następnie dostosuj strefę ogniskową do przewidywanego poziomu grasicy. Nałóż około jednego mililitra żelu ultradźwiękowego na powierzchnię przetwornika, gdy jest on ustawiony pionowo, spoczywając w uchwycie aparatu ultrasonograficznego lub w rękach asystenta. Aby przygotować małe sterylne pole obok podgrzewanej platformy, opróżnij sterylną osłonę sondy, gumkę, sterylne rękawiczki i sterylny żel ultradźwiękowy na sterylne pole.Następnie załóż sterylne rękawiczki. Ostrożnie umieść sterylną osłonę sondy na przetworniku ultradźwiękowym i żelu. Aby zachować sterylność, dotykaj tylko sterylnej pokrywy.Nasuń sterylną gumową opaskę na osłonę sondy, aby utrzymać ją na miejscu. Umieść dwa do trzech mililitrów sterylnego żelu ultradźwiękowego na głowicy. Umieść sondę ultradźwiękową z żelem pionowo na zdezynfekowanej części przedniej ściany klatki piersiowej myszy w celu wstępnego obrazowania, zachowując sterylność.Przeglądaj i optymalizuj obraz ultrasonograficzny, jak pokazano wcześniej. Aby zeskanować przednią część klatki piersiowej myszy w płaszczyźnie poprzecznej, trzymaj przetwornik pionowo i przesuwaj go w górę iw dół od szyi do brzucha ruchem przypominającym pędzel lub zamaszystym. Z sercem wyśrodkowanym w polu view, przesuń przetwornik lekko w kierunku szyi.Zwróć uwagę na dwie okrągłe, sparowane czarne struktury po obu stronach górnej części klatki piersiowej. Za pomocą sondy ultradźwiękowej zlokalizuj najszerszą część grasicy, która jest zwykle idealnym miejscem docelowym do wstrzyknięcia. Przewiduj poziomą trajektorię igły w wybranym miejscu i zwróć uwagę, gdzie znajdują się główne naczynia krwionośne w tym miejscu.Podczas wstrzykiwania należy unikać tych naczyń. Naczynia krwionośne będą hipoechogenicznymi strukturami pulsacyjnymi. Jeśli nie masz pewności, aktywuj tryb kolorowego Dopplera, dotykając przycisku koloru na ekranie, aby sprawdzić przepływ w naczyniach.Trzymaj przetwornik w jednej ręce, a igłę insuliny o rozmiarze 30 z 10 mikrolitrami wstrzyknięcia w drugiej. Aby rozpocząć proces wstrzykiwania, należy przesunąć głowicę na bok, tak aby grasica znajdowała się poza środkiem w polu widzenia ultrasonograficznego. Upewnij się, że druga strona pola widzenia składa się głównie z żelu do ultradźwięków i nic więcej.Umieść końcówkę igły w żelu pod przetwornikiem i powoli przesuwaj igłę, aż zostanie uwidoczniona w pobliżu powierzchni skóry. Wykonując ciągłe obrazowanie igły pod wpływem ultradźwięków, wprowadź igłę do grasicy trajektorią przezskórną z dala od naczyń krwionośnych. Użyj poprzecznej trajektorii poziomej grasicy, aby umieścić końcówkę igły w płacie grasicy po przeciwnej stronie do miejsca wprowadzenia.Gdy końcówka igły znajdzie się w żądanej części grasicy, szybko wstrzyknij zawartość ze strzykawki o rozmiarze 30, korzystając z wizualizacji ultrasonograficznej. Aby ustabilizować strzykawkę podczas wprowadzania igły i wstrzykiwania, należy trzymać strzykawkę między kciukiem a trzecim palcem i kontrolować tłok strzykawki palcem wskazującym. Wyjąć igłę po zdeponowaniu całej zawartości.U młodych myszy identyfikacja grasicy była prosta ze względu na duży rozmiar gruczołu. Było to trudniejsze u myszy starszych lub z niedoborem odporności. Jednak nadal było to bardzo wykonalne przy użyciu nowoczesnego sprzętu ultrasonograficznego.Udane wstrzyknięcie obserwowano, gdy igła nie przechodziła przez krytyczne struktury, takie jak serce, aorta lub jedna z żył głównych dolnych. Końcówkę igły uwidoczniono w miejscu docelowym podczas iniekcji, potwierdzając osadzanie się w grasicy. Lokalizacja wstrzyknięcia w obrębie grasicy została potwierdzona przy użyciu lucyferyny jako zastrzyku dla transgenicznych myszy lucyferazy.Zostały one natychmiast ocenione za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, potwierdzając prawidłowe miejsce wstrzyknięcia bez poświęcania zwierzęcia. Alternatywnie, błękit trypanowy wstrzyknięto jako wizualny marker miejsca wstrzyknięcia i dokładności wstrzyknięcia przy użyciu ex vivo z sekcją zwłok. Nasza grupa używała tej techniki w kilku dużych badaniach, w tym w badaniach nad immunoterapią nowotworów, opartą na wstrzykiwaniu genetycznie zmodyfikowanych komórek progenitorowych oraz w celu poprawy funkcji grasicy u myszy z niedoborem odporności.

a-minimally-invasive-accurate-efficient-technique-for-intrathymic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

W tym artykule omawiamy, jak stworzyć model raka piersi u samic myszy poprzez wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka. Przykładowy protokół demonstruje iniekcję ortotopową.

Wstrzyknięcie ortotopowe do poduszeczki tłuszczowej sutka: ustalenie raka piersi u myszy

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Wraz ze wzrostem zainteresowania immunoterapią wnętrznowrzodową, wybór modeli nowotworów, które są dostępne i praktyczne, jest niezbędny. Guzy podskórne są łatwe do ustanowienia, ale trudne do wizualizowania i manipulowania. W tym protokole opisujemy metody generowania guzów śródskórnych, które zapewniają lepszą widoczność i dostępność.

Wszczepienie nowotworu śródskórnego jako solidny model badań nad immunoterapią guzów mysich wewnątrzguzikowych

Poznaj minimalnie inwazyjną technikę wstrzykiwania dograsicznego u myszy z wykorzystaniem ultrasonografii. Ta metoda zapewnia precyzję i bezpieczeństwo przy badaniach immunologicznych na dużą skalę.

Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

Przeglądaj więcej filmów