Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty
26 maja 2023
Celem jest tutaj nakreślenie protokołu do badania mechanizmów dysbiozy w chorobach sercowo-naczyniowych. W artykule omówiono, jak aseptycznie pobierać i przeszczepiać próbki kału myszy, izolować jelita i stosować metodę "Swiss-roll", a następnie techniki barwienia immunologicznego w celu zbadania zmian w przewodzie pokarmowym.
W tym miejscu opisaliśmy protokół, który ma pomóc innym w badaniu mechanizmów dysbiozy w chorobie, od pobierania próbek kału po stosowanie metody szwajcarskiej bułki do badania zmian w jelitach. Na początek spryskaj klatkę piersiową i boki uśpionej myszy 70% etanolem i ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy. Odizoluj jelito ślepe i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć je na pół.
Krótko odsłoń jelito ślepe i odetnij 0,5 centymetra proksymalnie od jelita krętego i 0,5 centymetra dystalnie na jego styku z okrężnicą. Przenieś wyizolowane jelito ślepe na sterylną szalkę Petriego. Użyj sterylnej szpatułki, aby przenieść zawartość jelita ślepego do sterylnych probówek i przechowuj porcje w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Ponownie zawiesić świeże lub wcześniej zamrożone granulki kału w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w proporcji od 1 do 20 i wirować aż do homogenizacji. Przepuść homogenat przez nylonowy filtr o porach 30 mikrometrów, aby usunąć duże cząstki stałe. Wirować w temperaturze 79G przez pięć minut i zebrać supernatant do użycia do przeszczepu.
Doustne zgłębnik 100 mikrolitrów gnojowicy na wolną od zarazków mysz biorcę przez trzy kolejne dni, a następnie zgłębnik co trzy dni przez dwa tygodnie. Delikatnie umieść mysz w pasach na rozgrzanym uchwycie myszy i pozostaw ogon na zewnątrz. Ostrożnie przyklej górną część, nie ściskając jej, aby nie obciążać myszy.
Pozwól myszy odpocząć w uchwycie i umieść ją na platformie mankietu ogonowego na trzy do pięciu minut, przykrytej prześcieradłem, aby się zaaklimatyzować. Zbierz co najmniej trzy rundy pomiarów ciśnienia skurczowego za pomocą pletyzmografii mankietu ogonowego i uśrednij pomiary ze wszystkich rund, aby uzyskać średnie ciśnienie skurczowe dla każdego zwierzęcia. W aseptyce zbierz zawartość jelita ślepego od myszy poddanej eutanazji.
Aby pobrać jelita i inne tkanki, zlokalizuj tkankę myszy i wytnij ją nożyczkami, aby zbadać rolę mikrobioty jelitowej w zdrowiu kardiometabolicznym. Pierwszego dnia przeprowadź sekcję jelita myszy od strony odbytu do strony żołądka. I umieść cały odizolowany przewód pokarmowy na szalce Petriego zawierającej PBS.
Delikatnie pociągnij proksymalny koniec od końca brzucha i ręcznie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną. Odizoluj jelito cienkie i wykonaj zygzak typu Z z każdą długością. Następnie wytnij, aby uzyskać dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte.
Odizoluj okrężnicę, przecinając odcinek jelita poniżej jelita ślepego. Przetnij dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte i okrężnicę. Użyj strzykawki i igły z końcówką kulkową, aby ostrożnie przepłukać i umyć jelito w środku za pomocą PBS bez rozrywania jelita.
Umieść jelito na bibule filtracyjnej i oznacz bibułę nazwą sekcji, a następnie P w lewym górnym rogu dla proksymalnego lub D dla dystalnego w lewym dolnym rogu. Przetnij jelito wzdłuż nożyczkami z końcówką kulkową. Otwórz jelito na bibule filtracyjnej i w razie potrzeby przemyj je większą ilością PBS.
Umieść jelito między dwiema bibułami filtracyjnymi i zszyj bibuły filtracyjne w czterech punktach lub rogach w pobliżu jelita. Namocz w 10% neutralnym roztworze buforowym formaliny i wstrząśnij za pomocą kołyski platformowej z prędkością pięciu obrotów na minutę przez noc w temperaturze pokojowej. Drugiego dnia podgrzej przygotowaną 2% agarozę w wodzie destylowanej z mieszadłem w zlewce pokrytej folią aluminiową.
Aby pobrać tkanki, zdejmij górną bibułę filtracyjną i zwiń jelito od strony proksymalnej, tak aby strona proksymalna weszła do środka jako pierwsza, i zwiń do wewnątrz, tak aby światło znalazło się również w środku na szkiełku. W razie potrzeby przypnij igłą o rozmiarze 30 lub dwoma. Odessać jeden mililitr agarozy za pomocą jednorazowych pipet z podziałką i wylać agarozę na zwinięty odcinek jelita na płaską powierzchnię, unikając pęcherzyków powietrza w tkankach.
Po ostygnięciu i zestaleniu się agarozy użyj żyletki, aby przyciąć dodatkową agarozę wokół części tkanki. Na koniec umieść skrawki jelit w kasetach do przetwarzania tkanek lub osadzania i namocz je w 70% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oszacowanie różnorodności biologicznej gatunków w zawartości jelita ślepego uzyskanego od myszy na normalnej diecie solnej i diecie wysokosolnej przedstawiono tutaj.
Zmiany w mikrobiocie jelitowej w odpowiedzi na wysoki poziom soli obejmowały zmniejszenie różnorodności biologicznej bakterii. Niemetryczne skalowanie wielowymiarowe pokazuje, że bakterie z myszy o normalnej diecie solnej i wysokosolnej tworzą oddzielne klastry. Wysoka zawartość soli wiąże się ze zwiększonym stosunkiem Firmicutes do Bacteroidetes.
Przeszczep mikrobioty kałowej od myszy karmionych solą predysponuje myszy wolne od zarazków do nadciśnienia wywołanego angiotensyną II. Przenoszenie dysbiotycznej mikrobioty jelitowej wywołanej wysoką zawartością soli wiązało się ze znacznie zwiększonym ciśnieniem skurczowym u myszy wolnych od zarazków w porównaniu z myszami, które otrzymały normalną mikrobiotę jelitową opartą na soli. Reprezentatywne obrazy pokazują barwienie apolipoproteiny A-I w biodrze uzyskane od myszy, które miały hiperlipidemię bez białkomoczu lub z białkomoczem.
Protokół ten dostosowuje kroki prowadzące do osiągnięcia udanego FMT w kluczowych kwestiach eksperymentalnych zarówno dla dawców ludzi, jak i gryzoni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania mechanizmów dysbiozy w chorobach układu sercowo-naczyniowego. Szczegółowo opisano w nim aseptyczne pobieranie próbek kału od myszy oraz zastosowanie metody „swiss-roll” do badania zmian w przewodzie pokarmowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Badania nad układem sercowo-naczyniowym
Wprowadzenie
- Dysbioza odnosi się do zaburzenia równowagi mikrobiologicznej w jelitach.
- Jest ona powiązana z różnymi schorzeniami, w tym z chorobami układu sercowo-naczyniowego.
- Zrozumienie roli mikrobioty jelitowej może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Protokoły badania dysbiozy są niezbędne dla rozwoju badań naukowych.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowego protokołu pobierania próbek kału.
- Zademonstrowanie metody „Swiss-roll” w analizie jelit.
- Ułatwienie badań nad dysbiozą w chorobach układu krążenia.
Zastosowane metody
- Aseptycznie pobrać próbki kału myszy.
- Wyizolować trakt pokarmowy, koncentrując się na kątnicy.
- Zastosować metodę "swiss-roll" do analizy tkanki.
- Wykorzystać techniki barwienia immunocytochemicznego w celu zaobserwowania zmian.
Główne wyniki
- Pomyślne pobranie i utrwalenie próbek kału.
- Skuteczna izolacja kątniczki do analizy.
- Zastosowanie metody szwajcarskiej rolki (Swiss-roll) pozwoliło na uzyskanie cennych danych.
- Immunobarwienie ujawniło istotne zmiany w morfologii jelit.
Wnioski
- Opisany protokół stanowi cenne narzędzie do badania dysbiozy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia stanu zdrowia jelit w chorobach układu sercowo-naczyniowego.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu uzyskania głębszego wglądu.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Protokoły transplantacji mikrobioty kałowej (FMT) u myszy umożliwiają mechanistyczną analizę wpływu mikrobiomu jelitowego na choroby kardiometaboliczne, wspierając walidację celów terapeutycznych oraz odkrywanie translacyjnych biomarkerów. Ustandaryzowane procedury pobierania, przetwarzania i transplantacji ograniczają niejednoznaczność biologiczną i ułatwiają odtwarzalne modelowanie przedkliniczne patofizjologii napędzanej przez dysbiozę. Możliwości te są kluczowe dla ograniczania ryzyka we wczesnych fazach weryfikacji hipotez terapeutycznych oraz dla podejmowania decyzji dotyczących rozwoju portfolio w procesie odkrywania leków celowanych w mikrobiom.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie mechanizmów chorób indukowanych przez mikrobiotę w kontrolowanych modelach mysich.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów mikrobiomu jelitowego powiązanych z zaburzeniami kardiometabolicznymi.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez izolację wpływu konkretnych społeczności mikrobiologicznych.
- Zapewnia platformę do weryfikacji hipotez dotyczących oddziaływań między gospodarzem a mikrobiomem.
Przesiewy i opracowanie testów
- Standaryzuje przygotowanie systemów dawcy i biorcy w celu zapewnienia powtarzalności badań FMT.
- Umożliwia ilościową ocenę punktów końcowych fizjologicznych, takich jak skurczowe ciśnienie krwi.
- Wspiera opracowanie testów do oceny fenotypowych zmian indukowanych przez mikrobiotę.
- Ułatwia późniejszy screening interwencji modulujących mikrobiom.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dostosowanie modeli przedklinicznych do zmian mikrobioty jelitowej związanych z chorobą, obserwowanych u ludzi.
- Pozwala na ocenę biomarkerów translacyjnych, takich jak morfologia jelit oraz wyniki barwienia immunohistochemicznego.
- Zapewnia ciągłość między wynikami uzyskanymi na etapie odkrywania a przedkliniczną walidacją terapii celowanych w mikrobiom.
- Dostarcza danych skorygowanych o ryzyko w celu wprowadzenia interwencji w mikrobiomie do fazy oceny klinicznej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz ilościowe fenotypowanie modeli chorób napędzanych przez mikrobiom.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotezy zerowej dotyczącej wpływu mikrobioty na fenotypy chorobowe.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe punkty końcowe do porównywania efektów mikrobioty od dawców.
- Analityka: Dostarcza wyników statystycznych, takich jak wskaźniki różnorodności biologicznej i pomiary ciśnienia krwi.
- Badania translacyjne: Pozwala na powiązanie morfologii jelit i danych z barwienia immunocytochemicznego z mechanizmami chorobowymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia ustandaryzowany, skalowalny proces dla programów B+R ukierunkowanych na mikrobiom.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w określaniu powiązań między mikrobiomem a chorobami oraz w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację w badaniach przedklinicznych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go dla aktywów ukierunkowanych na mikrobiom i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów terapeutycznych opartych na mikrobiomie z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi myszy, technik aseptycznych oraz analityki mikrobiomu.
- Wymagany jest dostęp do sterylnych narzędzi chirurgicznych, kontrolowanego środowiska oraz aparatury analitycznej do oceny punktów końcowych fizjologicznych i morfologicznych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów wyboru dawcy, przetwarzania i transplantacji pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych gatunków dawców lub modeli chorób w zależności od celów translacyjnych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmienność międzygatunkową oraz konieczność rygorystycznej analizy statystycznej wyników.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Aseptic Collection of Mouse Fecal Samples
1:21
Fecal Matter Transplantation (FMT)
2:06
Systolic Blood Pressure Measurements
2:47
Assessment of FMT to Cardiovascular Changes and Making Gut Intestine Swiss-Rolls
5:46
Results: Effects of High and Low-Salt Diet, Fecal Microbiota Transplantation from High-Salt Fed Mice, and Immunohistochemistry on the Ileum
7:07
Conclusion
