Name: Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji kału myszy i przeszczepu mikrobioty jelitowej w badaniach dysbiozy związanej z chorobami układu krążenia. Protokół obejmuje aseptyczną kolekcję próbek i technikę Swiss-roll.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (do A.K.) z National Center for Advancing Translational Sciences; Grant Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego POST903428 (dla J.A.I.); oraz Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi przyznaje granty K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (dla AK) oraz grant NIH 1P01HL116263 (dla V.K.). Rysunek 1 został stworzony przy użyciu Biorenderu.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Vanderbilt zatwierdził wszystkie procedury opisane w tym manuskrypcie. Samce myszy C57B1/6 w wieku 3 miesięcy, zakupione w The Jackson Laboratory, były trzymane i pielęgnowane zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.
1. Pobieranie, przechowywanie i przetwarzanie próbek kału ludzkiego
<ol>
	<li>Pobrać próbkę kału za pomocą sterylnego pojemnika, jeśli pacjent znajduje się w klinice. Próbki kału należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C w ciągu 36 godzin od pobrania, aż będą gotowe do przetworzenia. Alternatywnie, należy pobrać próbki kału za pomocą dostępnego na rynku narzędzia, aby uzyskać łatwą i przedłużoną stabilność DNA w temperaturze otoczenia, szczególnie do użytku domowego.</li>
	<li>Zdezynfekuj wyciąg o poziomie bezpieczeństwa biologicznego za pomocą 10% roztworu wybielacza lub innego środka dezynfekującego zatwierdzonego przez Agencję Ochrony Środowiska.</li>
	<li>Wyjmij stolec z chłodnego miejsca i włóż do dygestorium; użyj jednorazowej szpatułki, aby przygotować porcje ~1 g i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż będzie całkowicie gotowy do przetworzenia.</li>
	<li>Wyrzuć wszystkie jednorazowe przedmioty do kosza na zagrożenia biologiczne. Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie (kaptur i wszelkie powierzchnie dotykane przez procesor) oraz przedmioty wyjmowane z okapu.</li>
</ol>
2. Aseptyczne pobieranie próbek kału myszy
UWAGA: Używaj technik aseptycznych, w tym wysterylizowanych narzędzi.
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 . Spryskaj klatkę piersiową i boki myszy 70% etanolem i ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy.</li>
	<li>Odizoluj jelito ślepe i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć je na pół. Na krótko odsłoń jelito ślepe i odetnij 0,5 cm proksymalnie od jelita krętego i 0,5 cm dystalnie na jego styku z okrężnicą. Przenieś wyizolowane jelito ślepe na sterylną szalkę Petriego.</li>
	<li>Użyj sterylnej szpatułki, aby przenieść zawartość jelita ślepego do sterylnych probówek i przechowywać porcje w zamrażarce o temperaturze -80 °C19. 
	UWAGA: Ponieważ większość bakterii w jelitach to bakterie beztlenowce, wystawienie na działanie tlenu może uszkodzić lub zabić organizmy podczas procedury izolacji w atmosferze pomieszczenia. Dlatego próbki kału należy izolować w komorach beztlenowych, aby utrzymać żywotność bakterii.</li>
</ol>
3. Przeszczep kału
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić świeże lub wcześniej zamrożone granulki kału w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w proporcji 1:20 (w:v) i wirować aż do homogenizacji.</li>
	<li>Przepuść homogenat przez nylonowy filtr porowy o średnicy 30 μm, aby usunąć duże cząstki stałe. Odwirować przy sile 79 × g przez 5 minut i zebrać supernatant do użycia do przeszczepu.</li>
	<li>Doustne podawanie 100 μl gnojowicy na wolną od zarazków mysz biorcę przez 3 kolejne dni, a następnie zgłębnik co 3 dni przez 2 tygodnie. Do zbadania mechanizmów mikrobioty jelitowej należy wykorzystać konwencjonalne myszy, jeśli najpierw były one leczone antybiotykami w celu wyeliminowania endemicznej mikrobioty biorcy. Na przykład, podawaj ceftriakson (400 mg/kg) codziennie myszom biorcom przez 5 kolejnych dni przez zgłębnik doustny przed zgłębnikowaniem gnojowicy kałowej. 
	UWAGA: Badania sugerują, że co najmniej 2 tygodnie tej kuracji są niezbędne do wywołania zmian sercowo-naczyniowych, w tym ciśnienia krwi20.</li>
	<li>Upewnij się, że wolne od zarazków myszy biorcze są trzymane pojedynczo w izolatorach gnotobiotycznych i karmione sterylnym jedzeniem i wodą.</li>
</ol>
4. Pomiary skurczowego ciśnienia krwi
UWAGA: Myszy gnotobiotyczne, które otrzymały FMT od 3-miesięcznych myszy C57Bl/6 hodowanych konwencjonalnie, miały wszczepione minipompy osmotyczne (Alzet, model 2002) do infuzji niskiej dawki angiotensyny II (140 ng/kg/min) przez 2 tygodnie. Ciśnienie krwi monitorowano co tydzień za pomocą mankietu ogonowego. Protokół wszczepiania minipomp osmotycznych został już wcześniej opisany21. Mankiet na ogon został wykonany, jak pokrótce podsumowano poniżej. Nieinwazyjna metoda pomiaru ciśnienia krwi, taka jak mankiet ogonowy, jest odpowiednia do badań FMT na myszach gnotobiotycznych. Szczegółowe kroki, jak wykonać mankiet ogonowy, zostały opisane wcześniej22.
<ol>
	<li>Krótko mówiąc, wyjmij myszy z izolatorów gnotobiotycznych i podgrzej platformę maszyny do mankietów ogonowych i uchwyt na mysz.</li>
	<li>Umieść przytomne myszy w pasach bezpieczeństwa na podgrzewanej platformie i zbierz co najmniej trzy rundy pomiarów ciśnienia skurczowego za pomocą pletyzmografii mankietu ogonowego. Wykonaj poniższe czynności przez 3 kolejne dni przed właściwymi dniami pomiaru, aby nauczyć myszy krępowania w celu zmniejszenia stresu.
	<ol>
		<li>Delikatnie umieść mysz w nagrzanym uchwycie i pozostaw ogon na zewnątrz. Ostrożnie przyklej górną część, nie ściskając jej, aby nie obciążać myszy.</li>
		<li>Pozwól myszy odpocząć w uchwycie; umieść na platformie na 3-5 minut przykrytej prześcieradłem, aby się zaaklimatyzować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uśrednij pomiary ze wszystkich rund, aby uzyskać średnie ciśnienie skurczowe dla każdego zwierzęcia.</li>
</ol>
5. Ocena FMT dla zmian sercowo-naczyniowych
<ol>
	<li>Po pomiarze ciśnienia krwi należy poddać myszy eutanazji i aseptycznie pobrać zawartość jelita ślepego, jak opisano w punkcie 2 .</li>
	<li>Pobranie jelit i innych tkanek, w tym serca, aorty, wątroby, tętnic krezkowych i nerek, aby zbadać rolę mikrobioty jelitowej w zdrowiu kardiometabolicznym. Aby pobrać tkanki, zlokalizuj tkankę u myszy i użyj nożyczek, aby je wyciąć.</li>
	<li>Przeprowadź analizę sekwencjonowania metagenomicznego na próbkach kału/treści jelita ślepego pobranych od myszy dawcy i biorcy, aby potwierdzić wszczepienie mikrobioty jelitowej po FMT23. Pierwszym dowodem na udaną kolonizację mikrobioty jest potwierdzenie, że mikrobiota dawcy i biorcy jest podobna.</li>
	<li>Na pobranej tkance jelitowej należy zastosować technikę szwajcarskiej bułki (patrz punkt 6), w połączeniu z barwieniem immunologicznym i histologią, aby zbadać zmiany morfologiczne i ekspresję komórkową24.</li>
</ol>
6. Robienie szwajcarskich bułeczek z jelit
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>U prawidłowo uśpionej myszy spryskanej 70% etanolem należy wyciąć jelito myszy od strony odbytu (umocowanej w zaotrzewnej) do strony żołądka. Umieścić cały odizolowany przewód pokarmowy na szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Delikatnie przytrzymaj proksymalny koniec od końca brzucha i ręcznie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną.</li>
		<li>Odizoluj jelito cienkie (głowow od wyrostka robaczkowego) i wykonaj zygzak typu Z na każdej długości. Następnie wytnij, aby uzyskać kolejno dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte, jak opisano wcześniej25. Odizoluj okrężnicę, przecinając odcinek jelita poniżej jelita ślepego.</li>
		<li>Przetnij dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte i okrężnicę.</li>
		<li>Przepłukać i umyć jelito w środku za pomocą PBS za pomocą strzykawki i igły z końcówką kulkową, aby nie rozerwać jelita.</li>
		<li>Połóż jelito na bibule filtracyjnej. Oznacz papier nazwą sekcji (np. dwunastnicy), a następnie "P" w prawym górnym rogu dla proksymalnej lub "D" dla dystalnej w prawym dolnym rogu.</li>
		<li>Przetnij jelito wzdłuż nożyczkami z końcówką kulkową. Otwórz jelito na bibule filtracyjnej. W razie potrzeby umyj większą ilością PBS.</li>
		<li>Umieść jelito między dwiema bibułami filtracyjnymi. Zszyj bibułę filtracyjną w czterech punktach/rogach w pobliżu jelita.</li>
		<li>Namoczyć w 10% neutralnym roztworze buforowym formaliny (4,0 g fosforanu sodu, monozasadowego, 6,5 g fosforanu sodu, dwuzasadowego, 100 ml 37% formaldehydu, 900 ml wody destylowanej). Wstrząsnąć za pomocą kołyski platformy przy 5 obr./min w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Przygotować 2% agarozy w wodzie destylowanej i podgrzać z mieszadłem w zlewce pokrytej folią aluminiową.</li>
		<li>Pobrać chusteczki higieniczne, zdjąć górną bibułę filtracyjną. Zwiń jelito od strony proksymalnej tak, aby strona proksymalna weszła do środka jako pierwsza, i przetocz do wewnątrz, tak aby światło znajdowało się również w środku na szkiełku. Przypnij igłą 30 G lub dwoma, w razie potrzeby.</li>
		<li>Odessać 1 ml agarozy za pomocą jednorazowych pipet z podziałką i wylać agarozę na zwinięty wycinek jelita na płaską powierzchnię, unikając pęcherzyków powietrza w tkankach.</li>
		<li>Pozwól agarozie ostygnąć i stężeć. Użyj żyletki, aby przyciąć dodatkową agarozę wokół sekcji tkanki.</li>
		<li>Umieść skrawki jelit w kasetach do przetwarzania/osadzania tkanek (większych niż zwykłe, aby dostosować się do zwiększonej wysokości spowodowanej agarozą). Namoczyć w 70% etanolu w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj szkiełka tkankowe zatopione w parafinie i przystąp do barwienia immunologicznego, jak opisano poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Barwienie immunologiczne przewodu pokarmowego
<ol>
	<li>Deparafinizacja
	<ol>
		<li>Przechodzić przez następujące kąpiele ze szkiełkami w stojaku: ksylen przez 3 min, ponownie świeży ksylen przez 3 min, ksylen ze 100% etanolem (1:1) przez 3 min, 95% etanolem przez 3 min, 70% etanolem przez 3 min i 50% etanolem przez 3 min.</li>
		<li>Delikatnie spłucz zimną bieżącą wodą z kranu. Przechowywać w wannie z wodą z kranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie antygenu
	<ol>
		<li>Po odparafinowaniu gotować szkiełka w stojaku w kąpieli z buforem do odzyskiwania antygenu (0,01 M dwuwodnego cytrynianu trisodu o pH 6 i 0,05% Tween-20) w temperaturze 100 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Uruchom pod zimną wodą z kranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Wyjmij szkiełka z wanny i umieść chusteczkę stroną zadrukowaną do góry w pudełku na szkiełka z mokrymi chusteczkami laboratoryjnymi/ręcznikami papierowymi na dnie. Narysuj kontur wokół tkanki za pomocą hydrofobowego markera.</li>
		<li>Upuść sól fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) + 0,025% Triton X-100 na tkankę i inkubuj przez 5 minut. Powtórz ten krok.</li>
		<li>Blok z TBS + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Obróć szkiełka na bok i usuń bufor blokujący z wycieraczki laboratoryjnej.</li>
		<li>Dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc. Delikatnie przemyć TBS + 0,025% Triton X-100, delikatnie pipetując ~200 μl na sekcję.</li>
		<li>Dodać drugorzędowy roztwór przeciwciał i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka podstawowe 3 x 5 minut za pomocą TBS, spłukując je pipetą, jak w kroku 7.3.4.</li>
		<li>Montaż z podłożem montażowym i szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2021+update%3A+a+report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association.</a> Circulation. 143 (8), 254(2021).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+in+prediabetes+and+diabetes%3A+a+population-based+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study.</a> Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).</li>
<li>Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+the+gut+microbiota+of+adults+with+obesity%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review.</a> European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).</li>
<li>Avery, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome+in+hypertension%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives.</a> Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).</li>
<li>Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+fecal+transplantation+from+a+lean+state+potentiates+caloric+restriction+effects+on+body+weight+and+adiposity+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9388(2020).</li>
<li>Zoll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+from+high+caloric-fed+donors+alters+glucose+metabolism+in+recipient+mice%2C+independently+of+adiposity+or+exercise+status%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).</li>
<li>Hvas, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+is+superior+to+fidaxomicin+for+treatment+of+recurrent+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection.</a> Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).</li>
<li>Kootte, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+insulin+sensitivity+after+lean+donor+feces+in+metabolic+syndrome+is+driven+by+baseline+intestinal+microbiota+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+dysbiosis+contributes+to+the+development+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension.</a> Microbiome. 5 (1), 14(2017).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructuring+the+gut+microbiota+by+intermittent+fasting+lowers+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure.</a> Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).</li>
<li>Zhong, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Washed+microbiota+transplantation+lowers+blood+pressure+in+patients+with+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624(2021).</li>
<li>Ferguson, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dietary+salt-induced+dendritic+cell+activation+underlies+microbial+dysbiosis-associated+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension.</a> JCI Insight. 5 (13), 126241(2019).</li>
<li>Yu, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+for+the+improvement+of+metabolism+in+obesity%3A+The+FMT-TRIM+double-blind+placebo-controlled+pilot+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial.</a> PLoS Medicine. 17 (3), 1003051(2020).</li>
<li>Leong, K. S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fecal+microbiome+transfer+in+adolescents+with+obesity%3A+the+gut+bugs+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial.</a> JAMA Network Open. 3 (12), 2030415(2020).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+fecal+microbiota+transplantation+on+obesity+and+metabolic+syndrome-a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review.</a> Nutrients. 11 (10), 2291(2019).</li>
<li>Laubitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+gut+microbiota+recovery+after+antibiotic+exposure+in+young+and+old+mice+%28a+pilot+study%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study).</a> Microorganisms. 9 (3), 647(2021).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+feeding+rather+than+obesity+drives+taxonomical+and+functional+changes+in+the+gut+microbiota+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice.</a> Microbiome. 5 (1), 43(2017).</li>
<li>Brunt, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+gut+microbiome+ameliorates+age-related+arterial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice.</a> The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).</li>
<li>Choo, J. M., Rogers, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+transplantation+for+colonization+of+germ-free+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100610(2021).</li>
<li>Kim, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+transplant+from+resveratrol-fed+donors+improves+glycaemia+and+cardiovascular+features+of+the+metabolic+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+angiotensin+II+infusion+using+osmotic+pumps+induces+aortic+aneurysms+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53191(2015).</li>
<li>Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+blood+pressure+using+a+noninvasive+tail+cuff+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).</li>
<li>Ishimwe, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+and+short-chain+fatty+acids+profile+in+postural+orthostatic+tachycardia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome.</a> Frontiers in Physiology. 13, 879012(2022).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3BSwiss+roll%26%2334%3B%3A+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The &#34;Swiss roll&#34;: a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C3-Butanediol+attenuates+hypertension+and+suppresses+kidney+injury+in+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).</li>
<li>Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+fecal+microbiota+transplantation+in+murine+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055(2021).</li>
<li>Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+adoptive+transfer+of+high+salt+treated+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59124(2019).</li>
<li>Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+inflammatory+cells+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular inflammatory cells in hypertension.</a> Frontiers in Physiology. 3, 128(2012).</li>
<li>Sylvester, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenocyte+transfer+from+hypertensive+donors+eliminates+premenopausal+female+protection+from+ANG+II-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).</li>
<li>Reikvam, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+murine+intestinal+microbiota%3A+effects+on+gut+mucosa+and+epithelial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression.</a> PLoS One. 6 (3), 17996(2011).</li>
<li>Le Roy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+microbiota+engraftment+following+fecal+microbiota+transfer+in+mice+models%3A+age%2C+kinetic+and+microbial+status+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3289(2019).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+alleviated+Alzheimer%27s+disease-like+pathogenesis+in+APP%2FPS1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Translation+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice.</a> Translation Psychiatry. 9 (1), 189(2019).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+the+microbiota+in+CX%283%29CR1%28%2B%29+intestinal+mononuclear+phagocyte+regulation+of+intestinal+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses.</a> Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).</li>
<li>Hintze, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+scope+method+for+creating+humanized+animal+models+for+animal+health+and+disease+research+through+antibiotic+treatment+and+human+fecal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer.</a> Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).</li>
<li>Wilde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail-cuff+technique+and+its+influence+on+central+blood+pressure+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204(2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fiber+diet+mitigates+maternal+obesity-induced+cognitive+and+social+dysfunction+in+the+offspring+via+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis.</a> Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Cennym podejściem do badania przyczynowej roli mikrobioty jelitowej w chorobach sercowo-naczyniowych i metabolicznych jest przeniesienie całej mikrobioty lub wybranych gatunków zainteresowania do myszy wolnych od zarazków. W tym miejscu opisujemy protokoły pobierania próbek kału od ludzi i myszy trzymanych konwencjonalnie w myszach wolnych od zarazków w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w zaburzeniach nadciśnieniowych.
U myszy używamy aseptyko zebranej treści jelita ślepego przetworzonej...

Zaburzenia kardiometaboliczne, w tym choroby serca i udar mózgu, są głównymi globalnymi przyczynami zgonów1. Brak aktywności fizycznej, złe odżywianie, zaawansowany wiek i genetyka modulują patofizjologię tych zaburzeń. Coraz więcej dowodów potwierdza tezę, że mikrobiota jelitowa wpływa na zaburzenia sercowo-naczyniowe i metaboliczne, w tym cukrzycę typu 22, otyłość3 i nadciśnienie4, które mogą być kluczem do opracowania nowych podejść terapeutycznych dla tych chorób.
Dokładne mechanizmy, za pomocą których mikrobiota powoduje choroby, są nadal nieznane, a obecne badania są bardzo zmienne, częściowo z powodu różnic metodologicznych. Przeszczep mikrobioty kałowej (FMT) jest cennym podejściem do określenia bezpośredniej roli całej mikrobioty lub wyizolowanych gatunków w patofizjologii choroby. FMT jest szeroko stosowany w badaniach na zwierzętach w celu wywołania lub zahamowania fenotypu. Na przykład spożycie kalorii i metabolizm glukozy mogą być modulowane poprzez przenoszenie kału od chorego dawcy do zdrowego biorcy5,6. U ludzi wykazano, że FMT jest bezpieczną opcją leczenia u pacjentów z nawracającym zakażeniem Clostridium difficile7. Pojawiają się dowody potwierdzające jego stosowanie w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych; na przykład FMT u pacjentów z zespołem szczupłym do metabolicznego poprawia wrażliwość na insulinę8. Dysbioza jelitowa jest również związana z wysokim ciśnieniem krwi zarówno w badaniach na ludziach, jak i na gryzoniach9,10,11. FMT od myszy karmionych dietą bogatą w sól u myszy wolnych od zarazków predysponuje biorców do stanu zapalnego i nadciśnienia12.
Pomimo wysokiego wskaźnika sukcesu FMT u gryzoni, wyzwania translacyjne pozostają. Badania kliniczne z zastosowaniem FMT w leczeniu otyłości i zespołu metabolicznego wskazują na minimalny lub żaden wpływ na te zaburzenia13,14,15. W związku z tym potrzebne są dalsze badania, aby zidentyfikować dodatkowe możliwości terapeutyczne ukierunkowane na mikrobiotę jelitową w leczeniu zaburzeń kardiometabolicznych. Większość dostępnych dowodów dotyczących mikrobioty jelitowej i chorób układu krążenia ma charakter powiązany. Opisany protokół omawia, w jaki sposób wykorzystać kombinację FMT i techniki walcowania szwajcarskiego, aby pokazać zarówno związek między chorobą a mikrobiotą jelitową, jak i bezpośrednio ocenić integralność wszystkich części jelita grubego16,17,18.
Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie wskazówek do badania wpływu mikrobiomu jelitowego na eksperymentalne choroby sercowo-naczyniowe. Protokół ten zawiera więcej szczegółów i kluczowych rozważań w projekcie eksperymentalnym, aby promować fizjologiczną translację oraz zwiększyć rygor i odtwarzalność wyników.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Tyamid SuperBoost</td><td>ThermoFisher</td><td>B40932</td><td></td></tr><tr><td>Komora beztlenowa</td><td>COY</td><td>7150220</td><td></td></tr><tr><td>Apolipoproteina AI</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-52979</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki tętnicze - końcówka kulkowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wybielacza</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-412-53</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Fisher Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>CD3 przeciwciało</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 14-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD68</td><td>ThermoFisher</td><td>14-0681-82</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-221</td><td></td></tr><tr><td>Monitor o wysokiej przepustowości CODA</td><td>Kent Scientic Corporation</td><td>CODA-HT8</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety do przenoszenia z podziałką</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119AM</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA33361M1</td><td></td></tr><tr><td>Igła do karmienia</td><td>Fine Science Tools</td><td>18061-38</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz bibuły filtracyjnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-802</td><td></td></tr><tr><td>Formalina (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-581</td><td></td></tr><tr><td>Dieta wysokosolna</td><td>Teklad</td><td>TD.03142</td><td></td></tr><tr><td>OMNIgene.GUT</td><td>DNAgenotek</td><td>OM-200+ACP102</td><td></td></tr><tr><td>Minipompy osmotyczne</td><td>Alzet</td><td>&nbsp; MODEL 2002</td><td></td></tr><tr><td>PAP</td><td>Pen Millipore Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4050</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-18C</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Serile soli fizjologicznej buforowanej fosforanem</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61196AP</td><td></td></tr><tr><td>Inteligentna szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0133733</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do zbierania stolca</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-203-7255</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R017R.0000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td> 9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Regulator platformowy Varimix</td><td>Fisher Scientific</td><td>09047113Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikser wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-41</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>1330-20-7, 100-41-4</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation

Dysbioza mikrobioty jelitowej odgrywa rolę w patofizjologii zaburzeń sercowo-naczyniowych i metabolicznych, ale mechanizmy nie są dobrze poznane. Przeszczep mikrobioty kałowej (FMT) jest cennym podejściem do określenia bezpośredniej roli całej mikrobioty lub wyizolowanych gatunków w patofizjologii choroby. Jest to bezpieczna opcja leczenia dla pacjentów z nawracającym zakażeniem Clostridium difficile. Badania przedkliniczne pokazują, że manipulowanie mikrobiotą jelitową jest użytecznym narzędziem do badania mechanistycznego związku między dysbiozą a chorobą. Przeszczep mikrobioty kałowej może pomóc w opracowaniu nowych metod leczenia mikrobioty jelitowej w leczeniu chorób kardiometabolicznych. Pomimo wysokiego wskaźnika sukcesu u gryzoni, nadal występują zmiany translacyjne związane z przeszczepem. Celem jest dostarczenie wskazówek w badaniu wpływu mikrobiomu jelitowego na eksperymentalne choroby sercowo-naczyniowe. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół pobierania, obchodzenia się, przetwarzania i przeszczepiania mikrobioty kałowej w badaniach na myszach. Etapy pobierania i przetwarzania są opisane zarówno dla dawców ludzi, jak i gryzoni. Na koniec opisujemy zastosowanie kombinacji szwajcarskich technik walcowania i barwienia immunologicznego do oceny specyficznej dla jelit morfologii i zmian integralności w chorobach sercowo-naczyniowych i powiązanych mechanizmach mikrobioty jelitowej.

Kroki opisane powyżej zostały podsumowane na Rysunku 1. Zawartość kątnicy myszy lub kał ludzki resuspendsuje się w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w celu przygotowania zawiesiny, którą podaje się myszom wolnym od mikroorganizmów (100 µL) poprzez zgłębnik żołądkowy – najpierw przez 3 kolejne dni, a następnie raz na 3 dni. Po zakończeniu protokołu mierzy się ciśnienie krwi metodą mankietu ogonowego, uśpiewa się myszy, a następnie pobiera tkanki w celu oceny zmian w mikrobiocie jelitowe...

Celem jest tutaj nakreślenie protokołu do badania mechanizmów dysbiozy w chorobach sercowo-naczyniowych. W artykule omówiono, jak aseptycznie pobierać i przeszczepiać próbki kału myszy, izolować jelita i stosować metodę "Swiss-roll", a następnie techniki barwienia immunologicznego w celu zbadania zmian w przewodzie pokarmowym.

Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

Gut microbiota dysbiosis plays a role in the pathophysiology of cardiovascular and metabolic disorders, but the mechanisms are not well understood. Fecal ...

W tym miejscu opisaliśmy protokół, który ma pomóc innym w badaniu mechanizmów dysbiozy w chorobie, od pobierania próbek kału po stosowanie metody szwajcarskiej bułki do badania zmian w jelitach. Na początek spryskaj klatkę piersiową i boki uśpionej myszy 70% etanolem i ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy. Odizoluj jelito ślepe i użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć je na pół.Krótko odsłoń jelito ślepe i odetnij 0,5 centymetra proksymalnie od jelita krętego i 0,5 centymetra dystalnie na jego styku z okrężnicą. Przenieś wyizolowane jelito ślepe na sterylną szalkę Petriego. Użyj sterylnej szpatułki, aby przenieść zawartość jelita ślepego do sterylnych probówek i przechowuj porcje w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza.Ponownie zawiesić świeże lub wcześniej zamrożone granulki kału w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w proporcji od 1 do 20 i wirować aż do homogenizacji. Przepuść homogenat przez nylonowy filtr o porach 30 mikrometrów, aby usunąć duże cząstki stałe. Wirować w temperaturze 79G przez pięć minut i zebrać supernatant do użycia do przeszczepu.Doustne zgłębnik 100 mikrolitrów gnojowicy na wolną od zarazków mysz biorcę przez trzy kolejne dni, a następnie zgłębnik co trzy dni przez dwa tygodnie. Delikatnie umieść mysz w pasach na rozgrzanym uchwycie myszy i pozostaw ogon na zewnątrz. Ostrożnie przyklej górną część, nie ściskając jej, aby nie obciążać myszy.Pozwól myszy odpocząć w uchwycie i umieść ją na platformie mankietu ogonowego na trzy do pięciu minut, przykrytej prześcieradłem, aby się zaaklimatyzować. Zbierz co najmniej trzy rundy pomiarów ciśnienia skurczowego za pomocą pletyzmografii mankietu ogonowego i uśrednij pomiary ze wszystkich rund, aby uzyskać średnie ciśnienie skurczowe dla każdego zwierzęcia. W aseptyce zbierz zawartość jelita ślepego od myszy poddanej eutanazji.Aby pobrać jelita i inne tkanki, zlokalizuj tkankę myszy i wytnij ją nożyczkami, aby zbadać rolę mikrobioty jelitowej w zdrowiu kardiometabolicznym. Pierwszego dnia przeprowadź sekcję jelita myszy od strony odbytu do strony żołądka. I umieść cały odizolowany przewód pokarmowy na szalce Petriego zawierającej PBS.Delikatnie pociągnij proksymalny koniec od końca brzucha i ręcznie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną. Odizoluj jelito cienkie i wykonaj zygzak typu Z z każdą długością. Następnie wytnij, aby uzyskać dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte.Odizoluj okrężnicę, przecinając odcinek jelita poniżej jelita ślepego. Przetnij dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte i okrężnicę. Użyj strzykawki i igły z końcówką kulkową, aby ostrożnie przepłukać i umyć jelito w środku za pomocą PBS bez rozrywania jelita.Umieść jelito na bibule filtracyjnej i oznacz bibułę nazwą sekcji, a następnie P w lewym górnym rogu dla proksymalnego lub D dla dystalnego w lewym dolnym rogu. Przetnij jelito wzdłuż nożyczkami z końcówką kulkową. Otwórz jelito na bibule filtracyjnej i w razie potrzeby przemyj je większą ilością PBS.Umieść jelito między dwiema bibułami filtracyjnymi i zszyj bibuły filtracyjne w czterech punktach lub rogach w pobliżu jelita. Namocz w 10% neutralnym roztworze buforowym formaliny i wstrząśnij za pomocą kołyski platformowej z prędkością pięciu obrotów na minutę przez noc w temperaturze pokojowej. Drugiego dnia podgrzej przygotowaną 2% agarozę w wodzie destylowanej z mieszadłem w zlewce pokrytej folią aluminiową.Aby pobrać tkanki, zdejmij górną bibułę filtracyjną i zwiń jelito od strony proksymalnej, tak aby strona proksymalna weszła do środka jako pierwsza, i zwiń do wewnątrz, tak aby światło znalazło się również w środku na szkiełku. W razie potrzeby przypnij igłą o rozmiarze 30 lub dwoma. Odessać jeden mililitr agarozy za pomocą jednorazowych pipet z podziałką i wylać agarozę na zwinięty odcinek jelita na płaską powierzchnię, unikając pęcherzyków powietrza w tkankach.Po ostygnięciu i zestaleniu się agarozy użyj żyletki, aby przyciąć dodatkową agarozę wokół części tkanki. Na koniec umieść skrawki jelit w kasetach do przetwarzania tkanek lub osadzania i namocz je w 70% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oszacowanie różnorodności biologicznej gatunków w zawartości jelita ślepego uzyskanego od myszy na normalnej diecie solnej i diecie wysokosolnej przedstawiono tutaj.Zmiany w mikrobiocie jelitowej w odpowiedzi na wysoki poziom soli obejmowały zmniejszenie różnorodności biologicznej bakterii. Niemetryczne skalowanie wielowymiarowe pokazuje, że bakterie z myszy o normalnej diecie solnej i wysokosolnej tworzą oddzielne klastry. Wysoka zawartość soli wiąże się ze zwiększonym stosunkiem Firmicutes do Bacteroidetes.Przeszczep mikrobioty kałowej od myszy karmionych solą predysponuje myszy wolne od zarazków do nadciśnienia wywołanego angiotensyną II. Przenoszenie dysbiotycznej mikrobioty jelitowej wywołanej wysoką zawartością soli wiązało się ze znacznie zwiększonym ciśnieniem skurczowym u myszy wolnych od zarazków w porównaniu z myszami, które otrzymały normalną mikrobiotę jelitową opartą na soli. Reprezentatywne obrazy pokazują barwienie apolipoproteiny A-I w biodrze uzyskane od myszy, które miały hiperlipidemię bez białkomoczu lub z białkomoczem.Protokół ten dostosowuje kroki prowadzące do osiągnięcia udanego FMT w kluczowych kwestiach eksperymentalnych zarówno dla dawców ludzi, jak i gryzoni.

murine-fecal-isolation-and-microbiota-transplantation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model transplantacji jelita cienkiego myszy jest uznawany za istotne narzędzie do badania mechanizmów odrzutu immunologicznego oraz przesiewowego badania nowych leków immunosupresyjnych. Jednak zastosowanie tego modelu jest ograniczone, ponieważ techniki w nim wykorzystywane stanowią niezwykle trudne wyzwanie techniczne. W niniejszym materiale przedstawiamy zmodyfikowaną technikę.

Przeszczep jelita cienkiego u myszy

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanej myszy BLT (szpik, wątroba i grasica) z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym i stabilnym, wszczepionym ludzkim mikrobiomem jelitowym.

Generowanie podwójnie humanizowanego modelu myszy BLT (szpik kostny, wątroba, grasica)

Ten film pokazuje procedurę przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10 z zapaleniem jelita grubego. Skolonizowane drobnoustroje kałowe w jelitach uwalniają metabolity wtórne, wywołując uwalnianie cytokin przeciwzapalnych i zmniejszając stan zapalny jelita grubego.

Ocena skutków przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10

Przeszczep mikrobioty kałowej za pomocą kolonoskopii jest bezpiecznym i skutecznym sposobem leczenia nawracających i opornych na leczenie infekcji C.difficile. Systematyczne podejście do badań przesiewowych pacjenta i dawcy, przygotowania stolca i dostarczania stolca podczas kolonoskopii zmaksymalizuje sukces terapeutyczny.

Przeszczep mikrobioty kałowej za pomocą kolonoskopii w przypadku nawrotu zakażenia C. difficile

Opisujemy nowatorską metodę generowania podwójnie humanizowanych myszy BLT, które posiadają funkcjonalny ludzki układ odpornościowy i stabilny, wszczepiony ludzki mikrobiom jelitowy. Protokół ten może być stosowany bez konieczności stosowania myszy wolnych od zarazków lub urządzeń gnotobiotycznych.

Podwójnie humanizowany model myszy BLT ze stabilnym mikrobiomem jelitowym podobnym do ludzkiego i ludzkim układem odpornościowym

Interakcja genetycznej podatności, odporności błony śluzowej i mikroekologicznego środowiska jelitowego jest zaangażowana w patogenezę nieswoistego zapalenia jelit (IBD). W tym badaniu zastosowaliśmy przeszczep mikrobioty kałowej myszom z niedoborem IL-10 i zbadaliśmy jej wpływ na zapalenie okrężnicy i czynność serca.

Ocena terapeutyczna przeszczepu mikrobioty kałowej w mysim modelu z niedoborem interleukiny 10

Ten protokół opisuje najlepsze praktyki transferu myszy wolnych od zarazków do eksperymentalnych izolatorów jednoklatkowych (izoklatek) przy zachowaniu sterylnych warunków. Omówiono metody przeszczepu kału myszom wolnym od zarazków i pobierania żywych bakterii od tych "humanizowanych" myszy jelitowych w celu dalszych zastosowań.

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

To badanie opisuje skuteczną technikę izolowania i przetwarzania tkanek dziąseł z jamy ustnej myszy w celu wytworzenia hodowli jednokomórkowej. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane do analizy cytometrii przepływowej i badań molekularnych.

Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Poznaj metodę izolacji kału myszy i przeszczepu mikrobioty jelitowej w badaniach dysbiozy związanej z chorobami układu krążenia. Protokół obejmuje aseptyczną kolekcję próbek i technikę Swiss-roll.

Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

Przeglądaj więcej filmów