Name: Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji lipopolisacharydu do mózgu larw Danio rerio w celu badania neurozapalenia i neurotoksyczności. Ta technika umożliwia ocenę potencjalnych leków przeciwzapalnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Funduszu Rozwoju Nauki i Technologii (FDCT) Specjalnego Regionu Administracyjnego Makao (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 i 0016/2019/AKP), Komitet Badawczy Uniwersytetu w Makau (MYRG2020-00183-ICMS i CPG2022-00023-ICMS) oraz Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81803398).

AB linii danio pręgowanego dzikiego typu i transgenicznego danio pręgowanego elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP i mpo:EGFP zostały uzyskane z Instytutu Chińskich Nauk Medycznych (ICMS). Aprobata etyczna (UMARE-030-2017) dla eksperymentów na zwierzętach została przyznana przez Komitet Etyki Badań na Zwierzętach Uniwersytetu w Makau, a protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Hodowla zarodków i larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Generuj zarodki danio pręgowanego (200-300 zarodków na krycie) poprzez naturalne krycie parami, jak wcześniej zgłoszono28.</li>
	<li>Przygotować pożywkę z wodą jajeczną (E3) (60×), rozpuszczając 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2·2H2Oi 9,78 g MgCl2·6H2O w ddH2O do końcowej objętości 2 L i dostosować pH do 7,2 za pomocą NaOH i HCl. Aby przygotować stężenie robocze pożywki E3 (1×, należy rozcieńczyć bulion 60 razy w ddH2O. Przechowywać w temperaturze 28,5 °C, gdy nie jest używany.</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść zarodki danio pręgowanego do naczynia zawierającego pożywkę E3. Hodować zarodki w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze i monitorować ich rozwój i zdrowie. Codziennie usuwaj martwe zarodki i zastępuj nieczyste podłoże E3 świeżą pożywką.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów obrazowania danio pręgowanego użyj plastikowej pipety transferowej, aby zebrać zarodki 0-2 godziny po zapłodnieniu (hpf) (około 200 jaj) w około 15 ml pożywki 1× E3 zawierającej 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU). 
	UWAGA: PTU może hamować powstawanie melanoforów podczas embriogenezy29. Leczenie zarodków PTU podczas embriogenezy może poprawić wykrywanie sygnałów w mikroskopii lub ekspresję fluorescencji30.</li>
	<li>Utrzymuj zarodki danio pręgowanego w powyższych warunkach, aż zarodki osiągną pożądane stadium rozwojowe.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Przygotować się do wstrzyknięcia, pobierając szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z pięcioetapowym protokołem pobierania szklanej rurki kapilarnej (Tabela 1).</li>
	<li>Otwórz końcówkę igły (cienkościenne szklane kapilary [3,5 cala] z żarnikiem, średnica zewnętrzna 1,14 mm) do odpowiedniego rozmiaru pod kątem za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Napełnij igłę 0,1 ml oleju mineralnego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Zdjąć nakrętkę ze stalowej igły aparatu do mikroiniekcji. Dopasuj szklany otwór na igłę do stalowej igły, a następnie dokręć nakrętkę. Zamontować załadowany aparat do mikroiniekcji igłowej w mikromanipulatorze (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Dostosuj położenie aparatu do mikroiniekcji tak, aby mikromanipulator mógł elastycznie przesuwać aparat pod mikroskopem. Wypuścić pewną objętość oleju parafinowego, aby stalowa igła weszła do szklanej rurki kapilarnej.</li>
	<li>Upuść roztwór do wstrzykiwań (taki jak 1× PBS lub 5 mg/ml LPS) na szkiełko wysterylizowane 70% etanolem i wyreguluj aparat do mikroiniekcji tak, aby końcówka została włożona do kropli cieczy. Do igły wsypać ~2 μl roztworu do wstrzykiwań.</li>
	<li>Ustaw mikromanipulator (precyzyjne ustawienia regulacji: góra, dół, lewo i prawo) tak, aby końcówka igły aparatu do mikroiniekcji znajdowała się w tym samym polu widzenia, co larwy w dużym powiększeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
</ol>
3. Montaż danio pręgowanego do mikroiniekcji
UWAGA: Rozwój mózgu danio pręgowanego następuje w ciągu 3 dpf i dojrzewa przy 5 dpf z dobrze rozwiniętym ośrodkowym układem nerwowym31,32. Dlatego 5 larw dpf nadaje się już do badania uszkodzeń neuronów za pośrednictwem LPS, a także reakcji behawioralnych i zapalnych.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć larwy danio pręgowanego w ciągu około 30 minut od osiągnięcia etapu zainteresowania, aby utrzymać stały czas wstrzyknięcia.</li>
	<li>Aby znieczulić larwy danio pręgowanego, połącz tricainę z czystą wodą w akwarium (końcowe stężenie 0,02% w/v tricainy).</li>
	<li>Rozpuść roztwór 2% agarozy w ddH2O za pomocą kuchenki mikrofalowej. Wlej stopioną agarozę do plastikowego naczynia. Naczynie z tworzywa sztucznego pokrytego 2% agarozą można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować znieczulone larwy do środka plastikowego naczynia pokrytego 2% agarozą. Ustaw zamontowane larwy stroną z mózgiem do góry, aby uzyskać dostęp do igły.</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie do komory mózgu
<ol>
	<li>Dostosuj powiększenie mikroskopu tak, aby struktura komorowa mózgu danio pręgowanego była wyraźnie widoczna w polu widzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Ostrożnie umieść igłę nad rdzeniem mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Powoli nakłuj skórę mózgu danio pręgowanego końcówką igły za pomocą mikromanipulatora.</li>
	<li>Naciśnij pedał nożny, aby wysunąć 1 nL 1x PBS lub różnych stężeń LPS (1.0, 2.5 i 5.0 mg/mL) (patrz Tabela materiałów). Udane obrazy wstrzyknięcia komory, w których do komory mózgu wstrzyknięto 1 nL 1% niebieskiego barwnika Evansa (rozcieńczonego w PBS), przedstawiono jako przykład (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D). Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść larwy na czyste podłoże E3. Po 24 godzinach zbierz larwy do obrazowania mikroskopowego, testu behawioralnego lokomotywy i określenia innych wskaźników.</li>
</ol>
5. Obrazowanie
<ol>
	<li>Przygotuj 1,5% niskotopliwy roztwór agarozy w podłożu E3 i podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać klarowny płyn.</li>
	<li>Użyj czystej plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować larwy do szklanego szkiełka i usunąć jak najwięcej wody.</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety transferowej, aby dodać kroplę 1,5% niskotopliwej agarozy do larw. 
	UWAGA: Ostudzić niskotopliwą agarozę w pipecie przez chwilę przed dodaniem, aby nie uszkodzić larw.</li>
	<li>Użyj igły do strzykawki o pojemności 1 ml, aby zorientować larwy. Poczekaj, aż agaroza ostygnie i stężeje przed rozpoczęciem obrazowania.</li>
	<li>Obserwuj i fotografuj obszar neuronów w całym mózgu danio pręgowanego Tg(ETvmat2:EGFP) i Tg(elavl3:mCherry), a także rekrutację neutrofili w mózgu danio pręgowanego Tg(mpo:EGFP) pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Ustawienia mikroskopu fluorescencyjnego używane do obrazowania są pokazane poniżej. Tg(ETvmat2:EGFP) mózg danio pręgowanego (długość fali wzbudzenia: 450-490 nm, długość fali emisji: 500-550 nm, powiększenie wizualne: 100x); Tg(elavl3:mCherry) mózg danio pręgowanego (długość fali wzbudzenia: 541-551 nm, długość fali emisji: 590 nm, powiększenie wizualne: 100x); Tg(mpo:EFGP) mózg danio pręgowanego (długość fali wzbudzenia: 450-490 nm, długość fali emisji: 500-550 nm, powiększenie wizualne: 63x).</li>
	<li>Zmierz i przeanalizuj intensywność i długość fluorescencji regionu neuronu Ra u danio pręgowanego Tg(ETvmat2:EGFP) oraz intensywność fluorescencji neuronów mózgowych danio pręgowanego Tg(elavl3:mCherry) za pomocą oprogramowania ImageJ. Ręcznie policz neutrofile w obszarze mózgu zebry pręgowanego.</li>
</ol>
6. Oznaczanie markerów ekspresji genów
<ol>
	<li>Po 24 godzinach od wstrzyknięcia LPS do komory mózgu należy przystąpić do oznaczania markerów ekspresji genów. W tym celu należy znieczulić larwy danio pręgowanego 0,02% trikainy (jak wspomniano w kroku 3.2).</li>
	<li>Użyj dwóch strzykawek o pojemności 1 ml, aby oddzielić części głowy larw (40 larw na grupę) bez obszaru oka i woreczka żółtkowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Ekstrahuj RNA z części głowy larwy.
	<ol>
		<li>W przypadku ekstrakcji RNA homogenizować część głowy za pomocą 200 μl odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) za pomocą młynka do tkanek (patrz tabela materiałów) z prędkością obrotową 11 000 obr./min przez 5 s.</li>
		<li>Przeprowadzić ekstrakcję RNA metodą chloroform-izopropanol. W tym celu należy dodać 40 μl chloroformu, energicznie wstrząsnąć probówkami i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść fazę wodną do świeżej probówki (około 100 μl) i dodać 100 μl izopropanolu. Inkubować przez 10 minut, a następnie odwirowywać przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodaj 200 μl 75% etanolu, aby przepłukać osad RNA. Próbki należy krótko zwirować, a następnie odwirować przy 7500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie przepłukać osad RNA.</li>
		<li>Suszyć na powietrzu osad RNA przez 5-10 minut, a następnie dodać 30 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA. Sprawdzić czystość (stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm) i integralność RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA z RNA wyekstrahowanego w kroku 6.3, używając odwrotnej transkryptazy z losowymi starterami (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dodaj 1 μl losowych starterów, 1 μl dNTP, 1 μg RNA i wodę destylowaną (całkowita objętość do 12 μl) do probówki bez nukleaz. Podgrzej mieszaninę do 65 °C przez 5 minut i szybko schładzaj na lodzie.</li>
		<li>Dodać 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy, 4 μl 5× buforu pierwszej nici i 1 μl odwrotnej transkryptazy M-MLV (całkowita objętość: 20 μL) do probówki. Delikatnie wymieszać i inkubować probówkę w temperaturze 25 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 42 °C przez 50 minut. Dezaktywować reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w systemie qPCR (patrz Tabela materiałów) przy użyciu dostępnego na rynku zestawu RT-qPCR (patrz Tabela materiałów) w celu określenia ekspresji docelowych genów (IL-1β, IL-6 i TNF-α). Mieszanina reakcyjna (20 μL) zawierała 10 μL zieleni SYBR, 0,4 μL barwnika referencyjnego ROX, po 0,8 μl starterów do przodu i do tyłu, 6 μL ddH2O i 2 μL matrycy cDNA (1 μg). Przeprowadzić amplifikację PCR w warunkach: 95 °C przez 30 s, następnie 40 cykli po 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 34 s oraz z etapem dysocjacji 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 60 s i 95 °C przez 15 s.</li>
	<li>Znormalizuj poziomy mRNA docelowych genów do poziomu genu porządkowego, czynnika wydłużenia 1 α (Ef1α). Oblicz poziomy ekspresji dla każdego genu docelowego metodą 2−ΔΔCT 33. Sekwencje starterów każdego genu opisano w tabeli 2.</li>
	<li>W celu oznaczenia tlenku azotu homogenizować porcję głowy (otrzymaną w kroku 6.2) w 100 μl zimnego PBS za pomocą młynka do tkanek. Odwirować otrzymany PBS i zawiesinę części głowy przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać lizaty i przeprowadzić test stężenia azotynów34 przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (patrz Tabela Materiałów).</li>
</ol>
7. Test behawioralny lokomotywy danio pręgowanego
<ol>
	<li>Po 24 godzinach od wstrzyknięcia komory mózgowej LPS należy indywidualnie przenieść larwy dania pręgowanego do studzienek 96-dołkowej kwadratowej mikropłytki. Dodać 300 μl pożywki E3 do każdej studzienki, a następnie inkubować larwy przez 4 godziny, aby zaaklimatyzować się na płytce testowej.</li>
	<li>Przenieść mikropłytkę załadowaną larwami do pudełka do śledzenia danio pręgowanego (patrz tabela materiałów). Włącz źródło światła, a następnie wysiaduj larwy w pudełku testowym przez 30 minut, aby zaaklimatyzować się w środowisku.</li>
	<li>Monitoruj i rejestruj zachowanie danio pręgowanego za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo. Nagraj 12 sesji (każda po 5 minut, łącznie 1 godzina) dla każdego danio pręgowanego. Zdefiniuj całkowitą odległość (składa się z odległości nieaktywnych, małych i dużych) jako odległość (w mm), którą każda ryba przemieściła się w ciągu 60-minutowego okresu śledzenia.</li>
</ol>
8. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykonywanie analiz statystycznych przy użyciu standardowego oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przeprowadź analizę statystyczną różnic między dwiema grupami przy użyciu zwykłej jednokierunkowej analizy ANOVA. Oblicz współczynnik korelacji Pearsona, aby ocenić siłę korelacji. P < 0,05 uznano za istotne we wszystkich analizach.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Coraz więcej danych epidemiologicznych i eksperymentalnych wskazuje na przewlekłe infekcje bakteryjne i wirusowe jako możliwe czynniki ryzyka chorób neurodegeneracyjnych36. Infekcja wyzwala aktywację procesów zapalnych i odpowiedzi immunologicznej gospodarza37. Nawet jeśli odpowiedź działa jako mechanizm obronny, nadmiernie aktywowany stan zapalny jest szkodliwy dla neurogenezy, a środowisko zapalne nie pozwala na przeżycie nowo narodzonych neuronów38</sup...

Zapalenie układu nerwowego zostało opisane jako kluczowy czynnik antyneurogenny zaangażowany w patogenezę kilku chorób neurodegeneracyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN)1. W następstwie patologicznych urazów, zapalenie układu nerwowego może skutkować różnymi niekorzystnymi konsekwencjami, w tym zahamowaniem neurogenezy i indukcją śmierci komórek neuronalnych2,3. W procesie leżącym u podstaw odpowiedzi na indukcję stanu zapalnego wiele cytokin zapalnych (takich jak TNF-α, IL-1β i IL-6) jest wydzielanych do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i działa jako kluczowe składniki w śmierci neuronów i tłumieniu neurogenezy4,5,6.
Mikroiniekcja mediatorów stanu zapalnego (takich jak IL-1β, L-arginina i endotoksyny) do mózgu może spowodować redukcję komórek neuronalnych i zapalenie nerwów7,8,9. Lipopolisacharyd (LPS, <silna klasa="xfig">Rysunek 1), patogenna endotoksyna obecna w ścianie komórkowej bakterii Gram-ujemnych, może wywoływać zapalenie nerwów, nasilać neurodegenerację i zmniejszać neurogenezę u zwierząt10. Wstrzyknięcie LPS bezpośrednio do OUN mózgu myszy zwiększyło poziom tlenku azotu, cytokin prozapalnych i innych regulatorów11. Co więcej, stereotaktyczne wstrzyknięcie LPS do lokalnego środowiska mózgu może wywołać nadmierną produkcję cząsteczek neurotoksycznych, co skutkuje upośledzeniem funkcji neuronów, a następnie rozwojem chorób neurodegeneracyjnych10,12,13,14,15. W dziedzinie neurobiologii obserwacje mikroskopowe procesów komórkowych i biologicznych zachodzących w organizmach żywych na żywo i w czasie mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy i działania farmakologicznego16. Jednak obrazowanie na żywo mysich modeli zapalenia układu nerwowego i neurotoksyczności jest zasadniczo ograniczone przez ograniczoną głębokość penetracji optycznej mikroskopii, co wyklucza obrazowanie funkcjonalne i obserwację procesów rozwojowych na żywo17,18,19. W związku z tym opracowanie alternatywnych modeli zapalenia układu nerwowego jest bardzo interesujące, aby ułatwić badanie patologicznego rozwoju oraz mechanizmu leżącego u podstaw zapalenia nerwów i neurodegeneracji poprzez obrazowanie na żywo.
Danio pręgowany (Danio rerio) okazał się obiecującym modelem do badania zapalenia nerwów i neurodegeneracji ze względu na ewolucyjnie zachowany wrodzony układ odpornościowy, przejrzystość optyczną, duży rozmiar lęgu zarodka, podatność genetyczną i przydatność do obrazowania in vivo19,20,21,22,23. Poprzednie protokoły albo bezpośrednio wstrzykiwały LPS do żółtka i tylnej komory mózgowia larw danio pręgowanego bez oceny mechanistycznej, albo po prostu dodawały LPS do wody dla ryb (pożywki hodowlanej) w celu wywołania śmiertelnej ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej24,25,26,27. W tym celu opracowaliśmy protokół mikroiniekcji LPS do komór mózgu, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną lub neurotoksyczność w ciągu 5 dni po zapłodnieniu (dpf) larw danio pręgowanego. O tej odpowiedzi świadczy utrata komórek neuronalnych, deficyt zachowań lokomotorycznych, zwiększone uwalnianie tlenku azotynów, aktywacja ekspresji genów zapalnych i rekrutacja neutrofili w mózgu danio pręgowanego po 24 godzinach od wstrzyknięcia.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6361</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Programowalny wtryskiwacz nanolitrów Drummond Nanoject III</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne mikroskopy stereoskopowe</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>Ver. 7.04</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3024</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator ręczny</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P system qPCR</td><td>Agilent Technologies</td><td>Mx3005P</td><td></td></tr><tr><td>Nanovue plus spektrofotometr</td><td>Biochrom</td><td>80-2140-46</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania stężenia azotynów</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0021M</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Programowalny ściągacz do pipet poziomych</td><td>World Precision Instruments</td><td>PMP-102</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-fenylotiomocznik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Losowe startery</td><td>Takara</td><td>3802</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II zestaw</td><td>Dokładna biologia</td><td>AG11701</td><td></td></tr><tr><td>Tgrinder 3. generacji</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary (4") z żarnikiem, OD 1,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>TRNzol Uniwersalny odczynnik</td><td>Tiangen</td><td>DP424</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka do śledzenia danio pręgowanego</td><td>ViewPoint Behavior Technology</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Zapalenie układu nerwowego jest kluczowym czynnikiem w różnych zaburzeniach neurologicznych, w tym chorobach neurodegeneracyjnych. Dlatego bardzo interesujące jest badanie i opracowywanie alternatywnych modeli zapalenia nerwów in vivo, aby zrozumieć rolę zapalenia nerwów w neurodegeneracji. W tym badaniu opracowano i zwalidowano model zapalenia układu nerwowego u larw danio pręgowanego, w którym pośredniczy mikroiniekcja lipopolisacharydu (LPS) w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej i neurotoksyczności. Transgeniczne linie danio pręgowanego elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP i mpo:EGFP wykorzystano do ilościowego określenia w czasie rzeczywistym żywotności neuronów mózgowych za pomocą obrazowania fluorescencyjnego na żywo zintegrowanego z analizą intensywności fluorescencji. Zachowanie lokomotoryczne larw danio pręgowanego rejestrowano automatycznie za pomocą rejestratora wideo. Zbadano zawartość tlenku azotu (NO) i poziomy ekspresji mRNA cytokin zapalnych, w tym interleukiny-6 (IL-6), interleukiny-1β (IL-1β) i ludzkiego czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α) w celu oceny odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez LPS w głowie larwy danio pręgowanego. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia LPS do komory mózgu u larw danio pręgowanego obserwowano utratę neuronów i zaburzenia lokomocji. Ponadto zapalenie nerwów wywołane LPS zwiększyło uwalnianie NO i ekspresję mRNA IL-6, IL-1β i TNF-α w głowie larw danio pręgowanego 6 dni po zapłodnieniu (dpf) i spowodowało rekrutację neutrofili w mózgu danio pręgowanego. W tym badaniu wstrzyknięcie danio pręgowanego z LPS w stężeniu 2,5-5 mg / ml przy 5 dpf określono jako optymalny stan dla tego farmakologicznego testu zapalenia nerwów. Protokół ten przedstawia nową, szybką i skuteczną metodologię mikroiniekcji LPS do komór mózgowych w celu wywołania zapalenia nerwów i neurotoksyczności za pośrednictwem LPS u larwy danio pręgowanego, co jest przydatne do badania zapalenia nerwów i może być również stosowane jako wysokoprzepustowy test przesiewowy leków in vivo.

Opisany tutaj schemat przedstawia nową, szybką i wydajną metodologię indukowania neuroinflamacji i neurotoksyczności zależnej od LPS u larw ryb danioy. W opisanym protokole ryby danioy w 5 dpf otrzymały wstrzyknięcia LPS (Rycina 1) do komór mózgu przy użyciu mikroinjektora (Rycina 2A-C). Prawidłowe wstrzyknięcie do obszaru komór mózgu zweryfikowano za pomocą 1% barwnika błękitu Evansa (Rycina 2D). G...

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Zapalenie nerwów odgrywa kluczową rolę w różnych zaburzeniach neurologicznych. W związku z tym bardzo interesujące jest badanie i opracowywanie alternatywnych modeli zapalenia nerwów in vivo, aby ułatwić badania nad rozwojem patologicznym. Opisana tutaj technika jest doskonałym narzędziem do lepszego zrozumienia patologicznych zmian w mózgu poprzez obrazowanie in vivo oraz do szybkiej i skutecznej oceny możliwych leków przeciwneurozapalnych.Przygotuj się do wstrzyknięcia, pobierając szklane naczynia włosowate za pomocą ściągacza do mikropipet, postępując zgodnie z pięcioetapowym protokołem pobierania szklanej rurki kapilarnej. Otwórz końcówkę igły do odpowiedniego rozmiaru pod kątem za pomocą kleszczy. Napełnij igłę 0,1 mililitra oleju mineralnego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków.Zdjąć nakrętkę ze stalowej igły aparatu do mikroiniekcji. Dopasuj szklany otwór na igłę do stalowej igły, a następnie dokręć nakrętkę. Zamontować załadowany aparat do mikroiniekcji igłowych w mikromanipulatorze.Dostosuj położenie aparatu do mikroiniekcji tak, aby mikromanipulator mógł elastycznie przesuwać aparat pod mikroskopem. Wypuścić odpowiednią ilość oleju parafinowego potrzebną do tego, aby stalowa igła weszła do szklanej rurki kapilarnej. Upuść roztwór do wstrzykiwań składający się z PBS lub lipopolisacharydu na szkiełko podstawowe wysterylizowane 70% etanolem i wyreguluj aparat do mikroiniekcji tak, aby końcówka została włożona do kropli cieczy.Do igły należy wlać około dwóch mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań. Ustawić mikromanipulator tak, aby końcówka igły aparatu do mikroiniekcji znajdowała się w tym samym polu widzenia, co larwy w dużym powiększeniu. Rozpuść roztwór 2% agarozy w podwójnie destylowanej wodzie za pomocą kuchenki mikrofalowej.Wlej stopioną agarozę do plastikowego naczynia. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować znieczulone larwy do środka plastikowego naczynia pokrytego 2% agarozą. Ustaw zamontowane larwy stroną z mózgiem do góry, aby uzyskać dostęp do igły.Dostosuj powiększenie mikroskopu tak, aby struktura komory mózgowej danio pręgowanego była wyraźnie widoczna w polu widzenia. Ostrożnie umieść igłę nad tektum mózgu. Oczyść obszar mózgu 70% etanolem i powoli nakłuj skórę mózgu danio pręgowanego końcówką igły za pomocą mikromanipulatora.Naciśnij pedał nożny, aby wyrzucić jeden nanolitr 1X PBS lub różne stężenia lipopolisacharydu. Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść larwy do czystego podłoża E3. Po 24 godzinach zbierz larwy do obrazowania mikroskopowego, testu behawioralnego lokomotywy i określenia innych wskaźników.Przygotuj 1,5% niskotopliwy roztwór agarozy w podłożu E3 i podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać klarowny płyn. Użyj czystej plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować larwy do szklanego szkiełka i usunąć jak najwięcej wody. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby dodać kroplę 1,5% niskotopliwej agarozy do larw.Użyj mililitrowej igły strzykawki, aby zorientować larwy. Poczekaj, aż agaroza ostygnie i stężeje przed rozpoczęciem obrazowania. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia lipopolisacharydu do komory mózgu należy przystąpić do określania markerów ekspresji genów.Użyj dwóch jednomililitrowych strzykawek, aby oddzielić części głowy larw bez obszaru oka i woreczka żółtkowego. Homogenizować część głowy za pomocą 200 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji RNA za pomocą młynka do tkanek z prędkością 11 000 obrotów na minutę przez pięć sekund, a następnie przeprowadzić ekstrakcję RNA metodą izopropanolu chloroformu. Wysuszyć na powietrzu granulkę RNA przez pięć do 10 minut, a następnie dodać 30 mikrolitrów wody wolnej od RNAzy, aby rozpuścić osad RNA.Zsyntetyzuj cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy z losowymi starterami, jak opisano w rękopisie tekstowym. Następnie wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w systemie qPCR przy użyciu dostępnego na rynku zestawu RT-qPCR, aby określić ekspresję docelowych genów. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia lipopolisacharydu do komory mózgu należy indywidualnie przenieść larwy danio pręgowanego do studzienek 96-dołkowej kwadratowej mikropłytki.Dodaj 300 mikrolitrów pożywki E3 do każdej studzienki, a następnie inkubuj larwy przez cztery godziny, aby zaaklimatyzować się na płytce testowej. Przenieś mikropłytkę załadowaną larwami do pudełka do śledzenia danio pręgowanego. Włącz źródło światła i wysiaduj larwy w pudełku testowym przez 30 minut, aby zaaklimatyzować się do środowiska.Monitoruj i rejestruj zachowanie danio pręgowanego za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo. Nagraj 12 sesji po pięć minut każda dla poszczególnych larw danio pręgowanego i określ całkowitą odległość zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po leczeniu przez 24 godziny, jeden do pięciu miligramów na mililitr lipopolisacharydu komorowego wstrzyknięcia do mózgu spowodował znaczną utratę neuronów RZS w mózgu larwy danio pręgowanego TgEtvmat2:GFP w porównaniu z grupami kontrolnymi i pozorowanymi.Transgeniczna linia elavl3: mCherry zebrany wykazał znaczące zmiany w gęstości zintegrowanej z fluorescencją neuronów mózgowych larw po wstrzyknięciu od 2,5 do pięciu miligramów na mililitr lipopolisacharydu, podczas gdy wstrzyknięcie lipopolisacharydu o wartości jednego miligrama na mililitr nie wykazało żadnego efektu. Co więcej, pięć miligramów na mililitr lipopolisacharydu wywołało niedobór lokomocji i zmniejszyło całkowitą odległość ruchu danio pręgowanego w ciągu 60-minutowego okresu śledzenia. Produkcja podtlenku azotu i ekspresja mRNA cytokin prozapalnych w głowie larw danio pręgowanego zwiększyła się po podaniu lipopolisacharydów od 2,5 do pięciu miligramów na mililitr w porównaniu z ekspresją w grupie kontrolnej i pozorowanej.Wstrzyknięcie od jednego do pięciu miligramów na mililitr lipopolisacharydu wykazało rekrutację neutrofili do mózgu larw danio pręgowanego, co spowodowało znaczny wzrost liczby neutrofili w regionie mózgu danio pręgowanego Tgmpo:eGFP. Rozmiar otworu igieł i siła iniekcji do mikroiniekcji wraz z oddzieleniem głowy od oczu i ciała danio pręgowanego ma kluczowe znaczenie dla tej procedury.

brain-ventricular-microinjections-lipopolysaccharide-into-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Ten film demonstruje metodę ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego. Zarodniki grzybów są mikrowstrzykiwane do larwalnej komory tyłomózgowia, a larwy są inkubowane, aby umożliwić rozwój infekcji. Zakażone larwy są zbierane w określonych odstępach czasu, a postęp infekcji ocenia się poprzez wyliczenie jednostek tworzących kolonie.

Technika ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego

Wideo demonstruje technikę urządzenia do ranienia i uwięzienia danio pręgowanego do obserwacji fluorescencyjnie znakowanej infekcji patogenami grzybiczymi u larw danio pręgowanego. Początkowa infekcja przyciąga makrofagi, a gdy infekcja się utrzymuje, rekrutacja neutrofili postępuje w miejscu wstrzyknięcia.

Technika zWEDGI do wizualizacji larw danio pręgowanego zakażonych patogenami grzybiczymi

Film demonstruje mikrowstrzykiwanie lipopolisacharydów (LPS) do mózgów larw danio pręgowanego w celu wywołania zapalenia nerwów. Larwy umieszcza się na naczyniu wyłożonym agarozą, igłę wprowadza się do komór mózgu i wstrzykuje się LPS. Wstrzyknięty LPS wywołuje odpowiedź immunologiczną, która prowadzi do zapalenia nerwów.

Wywoływanie zapalenia nerwów u larw danio pręgowanego za pomocą wstrzyknięcia lipopolisacharydu

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Ten protokół opisuje syntezę, charakterystykę i wstrzykiwanie monomerycznych peptydów amyloidu-β42 do generowania toksyczności amyloidu u dorosłych ryb pręgowanego w celu stworzenia modelu choroby Alzheimera, a następnie analizy histologiczne i wykrywanie agregacji.

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół izolowania neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Po wyizolowaniu RNA jest ekstrahowane z tych komórek w celu analizy ich profilu ekspresji genów. Protokół ten pozwala na zbieranie wysokiej jakości RNA do przeprowadzania dalszych analiz, takich jak qPCR i transkryptomika.

Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określania uszkodzeń mózgu, deficytów lokomotorycznych i zapalenia nerwowego po krwawieniu do mózgu u larw danio pręgowanego, w kontekście ludzkiego krwotoku śródmózgowego (ICH).

Wykorzystanie larw danio pręgowanego do badania patologicznych konsekwencji udaru krwotocznego

Tutaj opisujemy syntezę liposomów naładowanych lekiem i ich mikroiniekcję larwom danio pręgowanego w celu ukierunkowania dostarczania leków do komórek z linii makrofagów.

Kierowanie leków na larwy makrofagów danio pręgowanego poprzez wstrzykiwanie liposomów zawierających leki

Aby zamodelować, jak sygnały zapalne wpływają na neurorozwój u organizmów genetycznie podatnych, przedstawiamy protokół mikroiniekcji IL-6 do przewodu Cuviera (żyła główna kardynałowa) larw rybki zebra, umożliwiając kontrolowane wywołanie stanu zapalnego i ocenę jego wpływu na rozwój w kontekście zespołu stwardnienia guzowatego (TSC).

Mikrowstrzyknięcie Interleukiny-6 do krwioobiegu larw ryb cebra TSC w celu badania zachowań przypominających zaburzenia neuropsychiatryczne

Poznaj metodę mikroiniekcji lipopolisacharydu do mózgu larw Danio rerio w celu badania neurozapalenia i neurotoksyczności. Ta technika umożliwia ocenę potencjalnych leków przeciwzapalnych w czasie rzeczywistym.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Przeglądaj więcej filmów