Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności
23 sierpnia 2022
Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.
Zapalenie nerwów odgrywa kluczową rolę w różnych zaburzeniach neurologicznych. W związku z tym bardzo interesujące jest badanie i opracowywanie alternatywnych modeli zapalenia nerwów in vivo, aby ułatwić badania nad rozwojem patologicznym. Opisana tutaj technika jest doskonałym narzędziem do lepszego zrozumienia patologicznych zmian w mózgu poprzez obrazowanie in vivo oraz do szybkiej i skutecznej oceny możliwych leków przeciwneurozapalnych.
Przygotuj się do wstrzyknięcia, pobierając szklane naczynia włosowate za pomocą ściągacza do mikropipet, postępując zgodnie z pięcioetapowym protokołem pobierania szklanej rurki kapilarnej. Otwórz końcówkę igły do odpowiedniego rozmiaru pod kątem za pomocą kleszczy. Napełnij igłę 0,1 mililitra oleju mineralnego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków.
Zdjąć nakrętkę ze stalowej igły aparatu do mikroiniekcji. Dopasuj szklany otwór na igłę do stalowej igły, a następnie dokręć nakrętkę. Zamontować załadowany aparat do mikroiniekcji igłowych w mikromanipulatorze.
Dostosuj położenie aparatu do mikroiniekcji tak, aby mikromanipulator mógł elastycznie przesuwać aparat pod mikroskopem. Wypuścić odpowiednią ilość oleju parafinowego potrzebną do tego, aby stalowa igła weszła do szklanej rurki kapilarnej. Upuść roztwór do wstrzykiwań składający się z PBS lub lipopolisacharydu na szkiełko podstawowe wysterylizowane 70% etanolem i wyreguluj aparat do mikroiniekcji tak, aby końcówka została włożona do kropli cieczy.
Do igły należy wlać około dwóch mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań. Ustawić mikromanipulator tak, aby końcówka igły aparatu do mikroiniekcji znajdowała się w tym samym polu widzenia, co larwy w dużym powiększeniu. Rozpuść roztwór 2% agarozy w podwójnie destylowanej wodzie za pomocą kuchenki mikrofalowej.
Wlej stopioną agarozę do plastikowego naczynia. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować znieczulone larwy do środka plastikowego naczynia pokrytego 2% agarozą. Ustaw zamontowane larwy stroną z mózgiem do góry, aby uzyskać dostęp do igły.
Dostosuj powiększenie mikroskopu tak, aby struktura komory mózgowej danio pręgowanego była wyraźnie widoczna w polu widzenia. Ostrożnie umieść igłę nad tektum mózgu. Oczyść obszar mózgu 70% etanolem i powoli nakłuj skórę mózgu danio pręgowanego końcówką igły za pomocą mikromanipulatora.
Naciśnij pedał nożny, aby wyrzucić jeden nanolitr 1X PBS lub różne stężenia lipopolisacharydu. Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść larwy do czystego podłoża E3. Po 24 godzinach zbierz larwy do obrazowania mikroskopowego, testu behawioralnego lokomotywy i określenia innych wskaźników.
Przygotuj 1,5% niskotopliwy roztwór agarozy w podłożu E3 i podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać klarowny płyn. Użyj czystej plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować larwy do szklanego szkiełka i usunąć jak najwięcej wody. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby dodać kroplę 1,5% niskotopliwej agarozy do larw.
Użyj mililitrowej igły strzykawki, aby zorientować larwy. Poczekaj, aż agaroza ostygnie i stężeje przed rozpoczęciem obrazowania. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia lipopolisacharydu do komory mózgu należy przystąpić do określania markerów ekspresji genów.
Użyj dwóch jednomililitrowych strzykawek, aby oddzielić części głowy larw bez obszaru oka i woreczka żółtkowego. Homogenizować część głowy za pomocą 200 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji RNA za pomocą młynka do tkanek z prędkością 11 000 obrotów na minutę przez pięć sekund, a następnie przeprowadzić ekstrakcję RNA metodą izopropanolu chloroformu. Wysuszyć na powietrzu granulkę RNA przez pięć do 10 minut, a następnie dodać 30 mikrolitrów wody wolnej od RNAzy, aby rozpuścić osad RNA.
Zsyntetyzuj cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy z losowymi starterami, jak opisano w rękopisie tekstowym. Następnie wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w systemie qPCR przy użyciu dostępnego na rynku zestawu RT-qPCR, aby określić ekspresję docelowych genów. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia lipopolisacharydu do komory mózgu należy indywidualnie przenieść larwy danio pręgowanego do studzienek 96-dołkowej kwadratowej mikropłytki.
Dodaj 300 mikrolitrów pożywki E3 do każdej studzienki, a następnie inkubuj larwy przez cztery godziny, aby zaaklimatyzować się na płytce testowej. Przenieś mikropłytkę załadowaną larwami do pudełka do śledzenia danio pręgowanego. Włącz źródło światła i wysiaduj larwy w pudełku testowym przez 30 minut, aby zaaklimatyzować się do środowiska.
Monitoruj i rejestruj zachowanie danio pręgowanego za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo. Nagraj 12 sesji po pięć minut każda dla poszczególnych larw danio pręgowanego i określ całkowitą odległość zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po leczeniu przez 24 godziny, jeden do pięciu miligramów na mililitr lipopolisacharydu komorowego wstrzyknięcia do mózgu spowodował znaczną utratę neuronów RZS w mózgu larwy danio pręgowanego TgEtvmat2:GFP w porównaniu z grupami kontrolnymi i pozorowanymi.
Transgeniczna linia elavl3: mCherry zebrany wykazał znaczące zmiany w gęstości zintegrowanej z fluorescencją neuronów mózgowych larw po wstrzyknięciu od 2,5 do pięciu miligramów na mililitr lipopolisacharydu, podczas gdy wstrzyknięcie lipopolisacharydu o wartości jednego miligrama na mililitr nie wykazało żadnego efektu. Co więcej, pięć miligramów na mililitr lipopolisacharydu wywołało niedobór lokomocji i zmniejszyło całkowitą odległość ruchu danio pręgowanego w ciągu 60-minutowego okresu śledzenia. Produkcja podtlenku azotu i ekspresja mRNA cytokin prozapalnych w głowie larw danio pręgowanego zwiększyła się po podaniu lipopolisacharydów od 2,5 do pięciu miligramów na mililitr w porównaniu z ekspresją w grupie kontrolnej i pozorowanej.
Wstrzyknięcie od jednego do pięciu miligramów na mililitr lipopolisacharydu wykazało rekrutację neutrofili do mózgu larw danio pręgowanego, co spowodowało znaczny wzrost liczby neutrofili w regionie mózgu danio pręgowanego Tgmpo:eGFP. Rozmiar otworu igieł i siła iniekcji do mikroiniekcji wraz z oddzieleniem głowy od oczu i ciała danio pręgowanego ma kluczowe znaczenie dla tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół mikrowstrzykiwania lipopolisacharydu do obszaru komór mózgowych larw rybek danio w celu zbadania odpowiedzi neurozapalnych oraz związanej z nimi neurotoksyczności. Model ten ma na celu zrozumienie zmian patologicznych w mózgu oraz ocenę potencjalnych leków przeciwzapalnych w obrębie układu nerwowego z wykorzystaniem technik obrazowania in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- neurozapalenie
- modele ryb danio-ostrobramkowych
Wstęp
- Neuroinflammation odgrywa kluczową rolę w różnych zaburzeniach neurologicznych.
- Celem badań jest opracowanie alternatywnych modeli in vivo do badania progresji choroby.
- Model rybki zebrafish oferuje korzyści w zakresie obrazowania mózgu w czasie rzeczywistym.
- Technika ta umożliwia szybką i skuteczną ocenę leków przeciwzapalnych ukierunkowanych na układ nerwowy.
Cel badania
- Ocena odpowiedzi neurozapalnej po wstrzyknięciu lipopolisacharydu.
- Badanie efektów neurotoksycznych wynikających z procesów zapalnych.
- Analiza skuteczności potencjalnych związków terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Badanie wykorzystuje mikroiniekcję roztworów do mózgów larw rybek daniozwojnych.
- Larwy rybek daniozwojnych poddawane są iniekcji lipopolisacharydu w celu oceny stanu zapalnego układu nerwowego.
- Do monitorowania odpowiedzi stosuje się testy behawioralne oraz reakcję PCR w czasie rzeczywistym.
- Kluczowe protokoły obejmują przygotowanie igieł, pozycjonowanie larw oraz techniki iniekcji.
- Do obserwacji wyników po iniekcji wykorzystuje się mikroskopię i analizę obrazu.
Główne wyniki
- Wstrzyknięcie lipopolisarydu spowodowało znaczące efekty neurotoksyczne, w tym utratę specyficznych neuronów.
- Zaobserwowano zwiększoną ekspresję cytokin prozapalnych oraz oznaki neurostanu zapalnego.
- Zmiany behawioralne wskazywały na deficyty lokomocyjne, korelujące z dawką podanego lipopolisarydu.
- Rekrutacja neutrofili do obszaru mózgu była wyraźnie zwiększona w odpowiedzi na zastosowane leczenie.
Wnioski
- Niniejsza praca ustanawia wiarygodną metodę badania neurostanów zapalnych u rybek zebrafish.
- Wskazuje ona na potencjał tego podejścia w testowaniu nowych leków przeciwzapalnych.
- Wyniki te przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw neurostanów zapalnych i związanych z nimi zaburzeń.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Solidne modele neurostanów zapalnych in vivo są niezbędne we wczesnych etapach odkrywania leków na schorzenia OUN, umożliwiając predykcyjną ocenę neurotoksyczności oraz utraty neuronów zapośredniczonej przez układ odpornościowy. Protokół mikroiniekcji LPS do komór mózgowych larw danio-ostrobramka stanowi szybki i skalowalny system do kwantyfikacji odpowiedzi neurozapalnych oraz przesiewania związków przeciwzapalnych. Model ten wspiera ciągłość translacyjną poprzez integrację obrazowania w czasie rzeczywistym, fenotypowania behawioralnego oraz analizy molekularnych biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków neurozapalnych i mechanistyczną ocenę ryzyka podczas walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wspiera funkcjonalną ocenę żywotności neuronów oraz rekrutacji komórek odpornościowych w żywym systemie kręgowców.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie angażowania celu i modulacji szlaków w portfelach badawczych dotyczących neurodegeneracji.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowaną, wysokoprzepustową platformę in vivo do przesiewowego badania związków przeciwzapalnych i neuroprotekcyjnych w obrębie układu nerwowego.
- Dostarcza ilościowych wyników za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, monitorowania behawioralnego oraz analizy mRNA cytokin.
- Umożliwia powtarzalne i skalowalne procesy analizy związków oraz identyfikacji wiodących kandydatów w programach badawczych nad OUN.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z mechanizmami neurozapalnymi istotnymi dla chorób obserwowanymi w zaburzeniach neurodegeneracyjnych.
- Wspiera opracowywanie translacyjnych biomarkerów poprzez pomiar ekspresji tlenku azotu i cytokin.
- Łączy wyniki wczesnych odkryć z przedkliniczną walidacją neurotoksyczności i aktywacji immunologicznej.
Integracja rurociągów i przepływu pracy
Ten model mikroiniekcji LPS u danio prążkowanego integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając walidację celów, identyfikację związków wiodących oraz dopasowanie biomarkerów translacyjnych w rozwoju leków na schorzenia OUN.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów neurozapalnych oraz utraty neuronów in vivo.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne wyniki do oceny skuteczności i toksyczności związków.
- Analityka: Ilościowo określa przeżywalność neuronów, deficyty behawioralne oraz ekspresję cytokin na potrzeby analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki mechanistyczne z biomarkerami istotnymi dla choroby oraz odpowiedziami immunologicznymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, skalowalną platformę dla różnorodnych badań nad neurozapaleniem i neurotoksycznością.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neurozapalnych oraz w minimalizowaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy neurozapalenia in vivo, zapewniając wysoką powtarzalność i wydajność.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje biologiczne ryzyko w późnych etapach badań nad OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów dotyczących neurozapalenia i neuroprotekcji w oparciu o dostosowany poziom ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi rybek zebrafish, mikroiniekcji oraz technik obrazowania żywych organizmów.
- Konieczny jest dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej, zautomatyzowanego śledzenia zachowań oraz infrastruktury qPCR.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów iniekcji i przepływów analizy danych w ramach poszczególnych zespołów.
- W zależności od konkretnych projektów może być konieczna adaptacja metody do różnych linii transgenicznych i punktów końcowych stanu zapalnego neuronów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują specyficzne dla gatunku odpowiedzi oraz zmienność techniczną precyzji mikroiniekcji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing and Mounting Zebrafish for Microinjections
2:22
Injecting the Brain Ventricle
3:08
Imaging
3:43
Determination of Gene Expression Markers
4:44
Zebrafish Locomotive Behavioral Assay
5:34
Results: Lipopolysaccharide-Induced Neuroinflammation to Assess the Levels of Proinflammatory Mediators
7:02
Conclusion
