Szybka ocena jakości białka błonowego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiaru fluorescencyjnego

Profil SEC to potężny sposób analizy jakości białka. Celem jest zebranie profilu SEC dla białka błonowego za pomocą fluorescencji, co może informować o jakości próbki. FSEC wykorzystuje niewielkie ilości próbek i może być przeprowadzany do oczyszczania, jest stosunkowo prosty i może być realizowany na sprzęcie dostępnym w wielu laboratoriach.

Procedurę zaprezentuje Jack Wright, starszy naukowiec ds. białek z Peak Proteins. Rozpocznij przygotowanie palet komórkowych, rozmrażając paletę przechowywaną w temperaturze do minus 80 stopni Celsjusza w temperaturze pokojowej przez 15 minut lub do momentu, aż próbka przestanie być zamrożona. Przenieś próbkę natychmiast do lodu.

Aby ponownie zawiesić i rozpuścić próbkę, należy dodać dwa mililitry buforu rozpuszczalności do palety komórek. Inkubuj z inwersją end-to-end w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Następnie dodaj gotowy materiał detergentowy, aby uzyskać końcowe stężenie 1% dodecylowego maltozydu (DDM) oraz 0,1% hemisukcynianu cholesterolu, czyli CHS.

Rozpuszczaj przez 30 minut z inwersją end-to-end w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wykonać niskoprędkościowy etap wirowania, odwiruj próbkę w wirówce stołowej z użyciem wychylanego wiadra i wiruj w 2000g przez 15 minut. Następnie wykonuj wirowanie wysokoprędkościowe, przenosząc supernatant z niskoobrotowej wirówki do rurek ultrawirowacyjnych za pomocą tępej igły przymocowanej do strzykawki pięciomilimetrowej.

Upewnij się, że nie ruszasz palety. Po wyważeniu par rurek umieść je w wirniku ultrawirującym o stałym kącie i wiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut przy 250 000 g. Przygotuj szybką białkową chromatografię cieczową, czyli system FPLC, wypełniając system chromatografią wykluczającą wielkości, czyli buforem SEC, i oczyszczając pompy z powietrza.

Połącz kolumnę SEC z FPLC, upewniając się, że powietrze nie dostaje się do kolumny. Wstępnie wyważ kolumnę SEC, płucząc ją w 1,5 objętości kolumny laboratoryjnie destylowanej i filtrowanej wody, a następnie 1,5 razy objętości buforu SEC przy zalecanym przepływie i ciśnieniu kolumny. Aby przeprowadzić eksperyment SEC, przenieś supernatant z szybkiego etapu wirowania do strzykawki o pojemności jednego mililitra, używając tępego końca igły przymocowanej do strzykawki.

Ustaw pętlę próbki na ładowanie. Przepełnij pętlę próbki o pojemności 500 mikrolitrów, wstrzykując 600 do 700 mikrolitrów próbki ze strzykawki do portu załadowania. Następnie wstrzyknij próbkę z pętli do kolumny, opróżniając ją czterema mililitrami bufora SEC przy zalecanym przepływie i ciśnieniu.

Pracuj kolumną z tym samym przepływem aż do przepuszczenia 1,5-krotności objętości buforu, a po przepuszczeniu 0,25 objętości kolumny zacznij pobierać 90 frakcji 0,2 mililitra. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 90 mikrolitrów laboratoryjnej wody destylowanej ze zbiornika do każdego odwiertu nieprzezroczystej, płaskiej płyty z 96 dołami. Następnie przenosi się 10 mikrolitrów próbek z płyty 96-dołkowej na nieprzezroczystą, płaską płytkę z 96 dołkami i umieszcza płytkę w czytniku płytkowym.

W przypadku fluorescencyjnie oznakowanego GFP ustaw wzbudzenie jak najbliżej 488 nanometrów i wykryj emisję fluorescencyjną jak najbliżej 507 nanometrów przed pomiarem sygnału. Badania zakresu dynamicznego i dolnych granic wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego, czyli detekcji EGFP dla czytnika płytek, wykazały, że czytnik płytek miał niższy limit wykrywania 30 nanogramów oraz zakres dynamiczny do 500 nanogramów białka znakowanego EGFP na długo przed nasyceniem sygnału. Przekształcenie objętości elucji do Kav i wykreślenie ich względem logarytmicznych mas cząsteczkowych pozwoliło oszacować masę cząsteczkową receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez interpolację krzywej standardowej.

Optymalne warunki ekstrakcji błonowej badano poprzez testowanie neopentylglikolu DDM i laurylmaltozy w porównaniu z ekstrakcją bezdetergentową za pomocą kopolimeru kwasu maleinowego styrenu. Wpływ dodawania ligandów na profil chromatografii wykluczenia z fluorescencją badano poprzez dodanie sfingozyny-1-fosforanu, czyli S1P, do próbki podczas rozpuszczalności. Próbka rozpuszczona w obecności S1P wykazała lepszy ślad przy zmniejszonej agregacji.

Badania długoterminowej stabilności receptora serotoniny 5HT2AR w różnych warunkach wykazały, że białko w cząstkach lipidów kwasu maleinowego styrenu pozostaje stabilne przez dłuższy czas, nawet w niekorzystnych temperaturach. Czas między punktem rozpuszczenia a przejściem próbki przez kolumnę SEC jest krytyczny czasowo. Nie może być przerw, a próbka musi być przechowywana w zimnie.

Po FSEC uzyska się zrozumienie, która konstrukcja jest najlepsza, detergent lub bufor. Pozwala to na optymalizację oczyszczania białek oraz wspiera dalszą charakterystykę biofizyczną i strukturalną.