Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Nasz protokół jest przyjazny dla użytkownika. Korzystając z tej techniki, każdy może łatwo wyizolować składnik z krwi. Zanieczyszczenie można zminimalizować, a materiały można dokładnie oddzielić.

Dzięki automatyzacji i ustanowieniu tego protokołu, naukowcy mogą łatwo uzyskać substancje związane z rakiem o wysokiej czystości, co jest pomocne w różnych dalszych badaniach. W szczególności oczekuje się, że przyniesie to istotne korzyści w zakresie badań z użytkownikami końcowymi. Swoją procedurę zademonstruje Jay Jeong, starszy badacz i asystent kierownika w Instytucie Badawczym Cancer Genomics.

Aby rozpocząć, załaduj wkładkę LBx 1, wybierając typ wkładu na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Naciśnij przycisk strzałki, aby zmienić liczbę próbek. Następnie otwórz drzwiczki przyrządu i włóż wszystkie wkłady, które mają być używane, w kolejności według numeru na uchwycie wkładu.

W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk uruchamiania na ekranie panelu dotykowego.

Przyrząd zamyka zawory na wkładach, co trwa około 30 sekund. Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi. Zdejmij koło podporowe i wyjmij wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu.

Odpipetować maksymalnie 10 mililitrów próbki krwi pełnej za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej. Po włożeniu wkładów do instrumentu zamknij drzwiczki przyrządu i naciśnij przycisk OK.

Płaszcze plazmowe i kożuchowe są automatycznie oddzielane od krwi pełnej, co trwa około 30 minut. Gdy płaszcz plazmowy i kożuchowy zostaną oddzielone, na ekranie pojawi się komunikat, któremu towarzyszy dźwięk alarmu. Wyłącz alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk stop.

Otwórz drzwi. Wyjmij wkład i połóż go na stole. Odzyskaj trzy mililitry osocza z wylotu plazmy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety.

Następnie odzyskaj trzy mililitry kożucha z wylotu kożucha za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipety. Następnie załaduj wkładkę LBx 2, wybierając nazwę wkładki na panelu ekranu dotykowego urządzenia. Naciśnij przycisk strzałki, aby zmienić liczbę próbek i postępuj zgodnie z tą samą procedurą, która jest pokazana dla wkładu LBx 1, aby włożyć wkład do uchwytu wkładu.

Po włożeniu wkładu i zamknięciu drzwiczek naciśnij przycisk uruchamiania na ekranie panelu dotykowego. Postępuj zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej, aby wyjąć wkład zamknięty zaworem z uchwytu wkładu i umieścić go na stole. Odpipetować roztwór gradientu gęstości za pomocą pipety serologicznej.

Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu wkładu i powoli wstrzykuj roztwór. Następnie należy odpipetować próbkę krwi pełnej i powoli wstrzyknąć ją do wlotu próbki. Po włożeniu i zabezpieczeniu wkładu zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk OK.

Gdy osocze i PBMC zostaną automatycznie oddzielone od krwi pełnej, pojawi się komunikat, któremu towarzyszy dźwięk alarmu. Otwórz drzwiczki i wyjmij wkład. Odzyskaj trzy mililitry osocza z wylotu plazmy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, a następnie odzyskaj trzy mililitry PBMC z wylotu PBMC.

Podobnie w przypadku wkładu FAST-auto, po wyjęciu wkładu z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu, wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu PBS do wlotu PBS wkładu. Następnie odpipetować trzy mililitry krwi pełnej lub kożuchy uzyskanej z LBx 1 lub próbki PBMC otrzymanej z LBx 2 i powoli wstrzyknąć próbkę do wlotu próbki wkładu. Po włożeniu wkładu i zabezpieczeniu go zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk OK.

Po zakończeniu automatycznego wzbogacania CTC zatrzymaj alarm. Wyjmij wkład i włóż środek do usuwania tylnej płyty (BPR) do czterech otworów z przodu wkładu. Naciśnij ciemnoniebieskie skrzydło kciukami obu rąk, a następnie naciśnij jasnoniebieski korpus, aż usłyszysz kliknięcie.

Ostrożnie wyjmij korpus wkładu, podnosząc go. Bardzo delikatnie podnieś membranę filtracyjną za krawędź za pomocą pęsety i umieść membranę w 1,5-mililitrowej probówce do przygotowania kwasu nukleinowego lub na szkle szkiełkowym do barwienia. W razie potrzeby odzyskaj przefiltrowaną krew do ujścia krwi za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety.

Wyekstrahowane cfDNA oceniono za pomocą Bioanalyzera, a taśmy przesiewowe cfDNA użyto razem z elektroniczną drabinką. Zielona linia została użyta do wyrównania drabiny i próbki. Trójkątne znaki wskazują prążek DNA.

Większość cfDNA ma długość 166 par zasad, a niektóre występują w całkowitych wielokrotnościach długości. Zwykle stężenie cfDNA mierzy do wielkości od 50 do 700 par zasad. Chociaż istnieje różnica w ilości uzyskanej z każdej pojedynczej próbki, taka jak 8,47 nanogramów na mililitr i 5,2 nanogramów na mililitr, wyniki ekstrakcji cfDNA były dobre zarówno dla stężenia, jak i rozkładu wielkości we wszystkich przypadkach.

Wyniki te wskazują, że metoda LBx 1 dokładnie oddziela osocze zawierające cfDNA. W FAST-auto błona została usunięta i wybarwiona przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu wykrycia CTC i białych krwinek. Zabarwioną membranę, umieszczoną na szkiełkach podstawowych, obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Po barwieniu błony komórki wykazują DAPI lub sygnały jądrowo-dodatnie na niebiesko, podczas gdy dodatnie sygnały EpCAM i CK lub CTC są podświetlone na zielono, a dodatnie CD45 lub WBC są podświetlone na czerwono. Usunięcie membrany nie jest trudne. Należy jednak zachować ostrożność w związku z utratą i zanieczyszczeniem CTC.

Dostępna jest krew pełna, PBMC i kożuchowa sierść. Zamiast tego wystarczy ustawić całą głośność. Można również użyć innych płynów, chociaż wymagane będą testy.

Technika ta może być stosowana bezpośrednio w szpitalach, a substancję można szybko uzyskać.