Name: Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj automatyczną metodę izolacji DNA pozakomórkowego i komórek nowotworowych krążących z krwi pełnej. Protokół minimalizuje zanieczyszczenia i zapewnia wysoką czystość ekstrahowanych substancji do badań genomiki nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt był częściowo wspierany przez Koreański Fundusz Rozwoju Urządzeń Medycznych (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) oraz Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Opieki Zdrowotnej (KHIDI, grant nr. HI19C0521020020).

Wszystkie próbki krwi pobrano od pacjentów z rakiem płuc. Badania i analizy w Clinomics są prowadzone przez Cancer Genomics Research Institute, a zatwierdzanie badań IRB przez rząd jest prowadzone przez Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB NO. 2021-0802) z numerem IRB zarejestrowanym do badań w Clinomics.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Zbierz 9 ml krwi pełnej do probówki do pobierania krwi stabilnej EDTA lub cfDNA.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj, obracając rurkę w górę iw dół około 10 razy.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT; do krótkotrwałego przechowywania) lub 4 °C (do długotrwałego przechowywania). Nie zamrażać i nie rozmrażać.</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia
<ol>
	<li>Naciśnij wyłącznik zasilania, aby włączyć instrument. 
	UWAGA: Na touchpadzie pojawi się ekran ładowania, a instrument zostanie zainicjowany. Trzymaj ręce z dala od instrumentu podczas inicjalizacji. Ekran wyboru wkładki pojawia się po zakończeniu inicjalizacji instrumentu.</li>
	<li>Wybierz tryb próbkowania, który ma być używany. Zmień liczbę próbek, naciskając strzałkę.</li>
</ol>
3. Obsługa urządzenia i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Ładowanie naboju LBx-1
	<ol>
		<li>Wybierz typ wkładki na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Zmień liczbę próbek, naciskając przycisk strzałki.</li>
		<li>Otwórz drzwiczki przyrządu i włóż wszystkie wkłady, które mają być używane, w kolejności według numeru na uchwycie wkładu. Upewnij się, że wkład i uchwyt wkładu są prawidłowo włożone. Jeśli wkładka nie zostanie prawidłowo włożona, może to spowodować znaczne uszkodzenie instrumentu.</li>
		<li>W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład.</li>
		<li>Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć.</li>
		<li>Zamknij drzwi i naciśnij przycisk RUN na ekranie panelu dotykowego. Przyrząd zamyka zawory na wkładach, co trwa około 30 s.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi, zdjąć koło podporowe i wyjąć wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu.</li>
		<li>Umieść wkład na stole i przygotuj się do wstrzyknięcia próbki krwi pełnej. Odpipetować maksymalnie 10 ml próbki krwi pełnej za pomocą pipety serologicznej. 
		UWAGA: Niebezpieczeństwa związane z obchodzeniem się z krwią. Podczas całej procedury obchodzenia się z próbkami krwi i odczynnikami ważne jest noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawic laboratoryjnych. Dostarczone karty charakterystyki powinny być dokładnie przebadane przez pracowników laboratorium.</li>
		<li>Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej. 
		UWAGA W przypadku użycia więcej niż 9 ml próbki krwi pełnej nie jest konieczne dodawanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). W przypadku użycia mniej niż 9 ml próbki krwi pełnej dodaj PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 9 ml. Na przykład, używając 7,2 ml krwi pełnej, należy dodać 1,8 ml PBS do wlotu próbki. Do wstrzykiwania krwi pełnej i PBS można użyć pipety serologicznej lub końcówki do pipety. W przypadku użycia mniej niż 8 ml próbki krwi pełnej, kożucha może nie zostać odzyskana nawet przez dodanie 1 ml PBS. Do przygotowania gDNA użyj 200 μl krwi pełnej, która została oddzielona przed tym krokiem.</li>
		<li>Włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności od liczby na uchwycie wkładu. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk OK. 
		UWAGA: Osocze i kożuchowa sierść są automatycznie oddzielane od krwi pełnej, co zajmuje około 30 min. 
		UWAGA Niebezpieczeństwo podczas pracy. Otwieranie drzwi lub dotykanie instrumentu podczas obracania z dużą prędkością może spowodować poważne obrażenia. Istnieje również ryzyko obrażeń z powodu asymetrycznego obciążenia wirnika. Jeśli podczas uruchamiania instrumentu w trybie wspomaganego wzbogacania komórek lub w trybie eksperta wystąpią nietypowe wibracje i szumy, umieszczenie wkładki może być asymetryczne. Natychmiast naciśnij zasilania, aby zatrzymać i prawidłowo zainstalować wkład.</li>
		<li>Poszukaj komunikatu na ekranie, któremu towarzyszy dźwięk alarmu, który pojawia się po zakończeniu oddzielania plazmy i kożuchówki.</li>
		<li>Zatrzymaj alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk STOP. Otwórz drzwiczki, wyjmij wkład i połóż go na stole.</li>
		<li>Odzyskaj 3 ml osocza z wylotu osocza za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Odzyskaj kożuchową warstwę 3 ml z wylotu kożucha za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie kasety LBx-2
	<ol>
		<li>Wybierz nazwę wkładki na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Zmień liczbę próbek, naciskając przycisk strzałki.</li>
		<li>Otwórz drzwiczki i włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności według liczby na uchwycie naboju.</li>
		<li>W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład.</li>
		<li>Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Upewnij się, że wkład został prawidłowo włożony do uchwytu wkładu. Jeśli wkładka nie zostanie prawidłowo włożona, może to spowodować znaczne uszkodzenie instrumentu.</li>
		<li>Zamknij drzwi i naciśnij przycisk RUN na ekranie panelu dotykowego. Przyrząd zamyka zawory na kartridżu, co trwa około 30 s.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi, zdejmij koło podporowe, wyjmij wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu i umieść go na stole.</li>
		<li>Umieścić wkład na stole i przygotować się do wstrzyknięcia roztworu gradientu gęstości i próbki krwi pełnej. Sprawdzić objętość roztworu gradientu gęstości i PBS do wstrzyknięcia w zależności od objętości próbki krwi pełnej (tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Odpipetować roztwór gradientu gęstości za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu wkładu i powoli wstrzykuj roztwór gradientu gęstości.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu roztworu gradientu gęstości należy odpipetować próbkę krwi pełnej za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej. 
		UWAGA: W przypadku użycia mniej niż 9 ml próbki krwi pełnej, dodaj PBS, odwołując się do tej tabeli (Tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności zgodnej z numerem na uchwycie wkładu. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk OK.</li>
		<li>Osocze i PBMC są automatycznie oddzielane od krwi pełnej, co trwa około 30 minut. Poszukaj komunikatu, który pojawia się wraz z dźwiękiem alarmu, gdy separacja osocza i PBMC zostanie zakończona.</li>
		<li>Zatrzymaj alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk STOP. Otwórz drzwiczki, wyjmij wkład i połóż go na stole.</li>
		<li>Odzyskaj 3 ml osocza z wylotu osocza za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Odzyskaj 3 ml PBMC z wylotu PBMC za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie kasety FAST-auto
	<ol>
		<li>Wybierz wkładkę na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Zmień liczbę próbek, naciskając przycisk strzałki.</li>
		<li>Otwórz drzwiczki i włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności według liczby na uchwycie naboju. W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład.</li>
		<li>Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć.</li>
		<li>Zamknij drzwi i naciśnij przycisk RUN na ekranie panelu dotykowego. Przyrząd zamyka zawory na kartridżu, co trwa około 30 s.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi, zdjąć koło podporowe i wyjąć wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu.</li>
		<li>Umieścić wkład na stole i przygotować się do wstrzyknięcia roztworu PBS i próbki krwi pełnej. Odpipetować 6 ml roztworu PBS za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu PBS wkładu i powoli wstrzyknij 6 ml roztworu PBS.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu roztworu PBS należy odpipetować 3 ml krwi pełnej lub próbki PBMC uzyskanej z LBx-2 za pomocą pipety serologicznej, która została uprzednio przepłukana 1% BSA, aby zapobiec przywieraniu pozostałości. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej.</li>
		<li>Włóż wkłady, które mają być używane, w kolejności od liczby na uchwycie wkładu. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk OK.</li>
		<li>CTC są automatycznie wzbogacane z krwi pełnej, co trwa około 15 minut. Poszukaj komunikatu, który pojawia się wraz z dźwiękiem alarmu po zakończeniu wzbogacania CTC. Zatrzymaj alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk STOP.</li>
		<li>Otwórz drzwiczki, wyjmij wkład i połóż go na stole. Włóż narzędzie do usuwania tylnej płyty (BPR) do czterech otworów z przodu wkładu. Naciśnij ciemnoniebieskie skrzydło kciukami obu rąk, a następnie naciśnij jasnoniebieski korpus, aż usłyszysz kliknięcie.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij korpus wkładu, podnosząc go do góry. Bardzo delikatnie podnieś membranę filtracyjną za krawędź za pomocą pęsety. Upewnij się, że używasz zewnętrznej krawędzi (krawędź o szerokości 1 mm) membrany filtracyjnej, aby ścisnąć i przytrzymać membranę filtra.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić membranę filtracyjną (na której znajdują się wzbogacone CTC) w probówce o pojemności 1,5 ml w celu przygotowania kwasu nukleinowego. W razie potrzeby odzyskaj przefiltrowaną krew do ujścia krwi za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrzymanie systemu
<ol>
	<li>Przygotowanie do czyszczenia i dezynfekcji instrumentu
	<ol>
		<li>Czyść wszystkie dostępne powierzchnie instrumentu i akcesoriów raz w tygodniu za pomocą etanolu i wysuszonej chusteczki, a także natychmiast po zanieczyszczeniu.</li>
		<li>Regularnie czyść miskę i wał wirnika za pomocą alkoholu (etanolu i izopropanolu) lub środków dezynfekujących na bazie alkoholu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie i dezynfekcja instrumentu 
	UWAGA: Aby zapoznać się z ogólnymi informacjami na temat rozwiązywania problemów i innymi uwagami dotyczącymi urządzenia, zapoznaj się z Tabelą Uzupełniającą 2.
	<ol>
		<li>Wyłącz przyrząd za pomocą głównego wyłącznika zasilania. Odłącz wtyczkę zasilania od zasilania.</li>
		<li>Otwórz drzwi i wyczyść i zdezynfekuj wszystkie dostępne powierzchnie instrumentu, w tym zasilający, za pomocą adamp szmatką i zalecanymi środkami czyszczącymi.</li>
		<li>Sprawdź wał wirnika pod kątem uszkodzeń. Sprawdź przyrząd pod kątem korozji i uszkodzeń.</li>
		<li>Podłącz przyrząd do zasilania tylko wtedy, gdy jest całkowicie suchy wewnątrz i na zewnątrz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłącz główną wtyczkę zasilania i wyjmij uchwyt bezpiecznika. Uchwyt bezpiecznika znajduje się nad gniazdkiem elektrycznym. Wymień zużyty bezpiecznik na zapasowy z pojemnika.</li>
</ol>

<ol><li>Babayan, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+liquid+biopsy+approaches+for+early+detection+and+monitoring+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer.</a> Genome Medicine. 10 (1), 21(2018).</li>
<li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).</li>
<li>Bardelli, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%2C+what+we+do+not+know+%28yet%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies, what we do not know (yet).</a> Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).</li>
<li>Mattox, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+liquid+biopsies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Applications of liquid biopsies for cancer.</a> Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).</li>
<li>Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+liquid+biopsies+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer.</a> NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36(2017).</li>
<li>Scudellari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myths+that+will+not+die%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myths that will not die.</a> Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).</li>
<li>Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+oncology%3A+origins%2C+optimism%2C+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Precision oncology: origins, optimism, and potential.</a> The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).</li>
<li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+The+precision-oncology+illusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspective: The precision-oncology illusion.</a> Nature. 537 (7619), 63(2016).</li>
<li>Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+liquid+biopsies+into+the+management+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Integrating liquid biopsies into the management of cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-and+late-stage+human+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24(2014).</li>
<li>Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+distribution+of+cell-free+DNA+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Size distribution of cell-free DNA in oncology.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455(2021).</li>
<li>Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+%28CTC%29+detection%3A+clinical+impact+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions.</a> Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).</li>
<li>Loeian, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+using+the+nanotube-CTC-chip%3A+capture+of+invasive+CTCs+with+high+purity+using+preferential+adherence+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients.</a> Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).</li>
<li>Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+affects+the+purity+of+liquid+biopsy-based+tumor+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers.</a> Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+isolation%2C+culture%2C+and+downstream+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+advances%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis.</a> Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).</li>
<li>Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+and+next-generation+sequencing+in+the+service+of+personalized+medicine+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer.</a> Oncotarget. 7 (43), 71013(2016).</li>
<li>Lowes, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+%28CTC%29+and+cell-free+DNA+%28cfDNA%29+workshop+2016%3A+scientific+opportunities+and+logistics+for+cancer+clinical+trial+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505(2016).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+cell-free+DNA+in+different+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Concentration of cell-free DNA in different tumor types.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+as+an+indicator+of+early+and+systemic+recurrence+after+surgical+resection+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).</li>
<li>Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+Potential+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: Potential and challenges.</a> International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).</li>
<li>Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA%3A+the+role+in+pathophysiology+and+as+a+biomarker+in+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1(2018).</li>
<li>Thierry, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+quantification+of+circulating+DNA+in+mice+with+human+colorectal+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).</li>
<li>Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+and+clearance+of+cell-free+plasma+DNA+in+hemodialysis+quantified+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine+%28CCLM%29%22%5BJournal%5D)">Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).</li>
<li>Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+kinetics+and+liver+uptake+of+mononucleosomes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice.</a> Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).</li>
<li>Meng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+in+patients+with+breast+cancer+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy.</a> Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+circulating+tumour+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+in+non-small-cell-lung-cancer+patients+using+a+multi-flow+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel.</a> Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8(2019).</li>
<li>Sajay, B. N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+optimal+and+unbiased+approach+for+tumor+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation.</a> Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).</li>
<li>Bailey, P. C., Martin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+CTC+biology+and+clinical+impact+emerging+from+advances+in+capture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology.</a> Cells. 8 (6), 553(2019).</li>
<li>Ahn, S. M., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+fluid+proteomics%3A+Prospects+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics-Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery.</a> Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Ilość i stężenie cfDNA i CTC zależy od osoby, stadium i rodzaju nowotworu. Zależy to również od stanu pacjenta 2,4,5,10,20. W szczególności we wczesnych lub przedrakowych stadiach raka stężenia substancji związanych z rakiem są bardzo niskie, więc istnieje duże prawdopodobieństwo, że nie można go wykryć. Niemniej jednak wczesne wykrycie ma bardzo pozytywny wpł...

Wczesne i dokładne wykrywanie różnych chorób, w tym raka, jest najważniejszym czynnikiem w ustalaniu strategii leczenia1,2,3,4. W szczególności wczesne wykrycie raka jest ściśle związane ze zwiększonymi szansami na przeżycie pacjenta5,6,7,8. Ostatnio płynne biopsje znalazły się w centrum uwagi w celu wczesnego wykrywania raka. Guzy lite ulegają angiogenezie i uwalniają różne substancje do krwi. W szczególności we krwi pacjentów z rakiem znaleziono krążące DNA (ctDNA), krążące RNA (ctRNA), białka, pęcherzyki, takie jak egzosomy i krążące komórki nowotworowe (CTC)2,9. Chociaż istnieją różnice w ilości tych substancji, są one konsekwentnie obserwowane nie tylko we wczesnych stadiach, ale także w późniejszych etapach6,10. Jednak te indywidualne różnice są bardzo duże; na przykład ilość bezkomórkowego DNA (cfDNA) zawierającego ctDNA jest mniejsza niż 1,000 ng, a liczba CTC jest mniejsza niż 100 w 10 ml pełnej krwi od pacjentów z rakiem11,12,13. Wiele badań charakteryzowało raka przy użyciu tych substancji obecnych w mniejszych ilościach (tj. cfDNA, ctDNA i CTC). Aby uzyskać dokładne wyniki, ważne jest, aby dokładnie oddzielić małe ilości substancji o wysokiej czystości13,14. Powszechnie stosowane są konwencjonalne metody wirowania, ale są one trudne w obsłudze i mają niską czystość w zależności od umiejętności użytkownika. Od czasu odkrycia CTC opracowano kilka technik separacji, takich jak wirowanie lub separacja o dużej gęstości, metody immunobeadowe i mikroprzepływowe. Od czasu odkrycia CTC opracowano kilka technik hermetyzacji. Jednak techniki te są często ograniczane, gdy konieczne jest odizolowanie komórek od różnych chipów i błon używanych do ich izolacji15. Ponadto metody znakowania wymagają sprzętu, takiego jak FACS, a dalszy proces jest ograniczony ze względu na zanieczyszczenie znakowania.
Ostatnio wzrosło użycie płynnych biopsji i prowadzone są różne badania nad wczesnym wykrywaniem raka. Chociaż ta metoda jest prosta, nadal istnieją trudności w dalszej analizie, a różne badania próbują przezwyciężyć te trudności16,17. Ponadto wiele placówek, w tym szpitale, wymaga zautomatyzowanych, powtarzalnych i wygodnych w użyciu metod o wysokiej czystości. W tym przypadku opracowaliśmy urządzenie typu lab-on-a-disc do automatycznego oddzielania substancji od próbek krwi po płynnej biopsji. Urządzenia te opierają się na zasadzie wirowania, mikrofluidyki i wychwytywania komórek o wielkości porów. Istnieją trzy rodzaje krążków: LBx-1 może pozyskiwać osocze i kożuch, podczas gdy LBx-2 może pozyskiwać osocze i PBMC z krwi pełnej o objętości mniejszej niż 10 ml; FAST-auto może również rejestrować CTC za pomocą membrany, którą można usunąć z dysku. W jednym cyklu można użyć do czterech sztuk każdej tarczy. Przede wszystkim zaletą tego urządzenia i metody jest to, że można uzyskać różne substancje pochodzenia rakotwórczego z tej samej próbki przy użyciu niewielkiej ilości krwi. Oznacza to, że krew pacjenta musi zostać pobrana tylko raz. Ponadto ma tę zaletę, że wyklucza błędy wynikające z różnic w okresie pobierania krwi. Platforma ta jest łatwa w użyciu i zapewnia dokładne wyniki dla płynnych biopsji i dalszych zastosowań. W tym protokole wprowadzono użycie urządzenia i kartridża.

<table><tbody><tr><td>1% BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka stożkowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>4150 System TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td>Bezkomórkowa taśma przesiewowa DNA (Agilent, 5067-5630), bezkomórkowy bufor do próbek DNA (Agilent, 5067-5633)</td></tr><tr><td>Apostle MiniMax Wysokowydajny zestaw do bezkomórkowej izolacji DNA&nbsp;</td><td>Apostles</td><td>A17622-250</td> 5 <td>mL X 50 wersja przygotowawcza</td></tr><tr><td>BD Probówki do pobierania krwi Vacutainer</td><td>Probówka do</td> pobierania krwi BD <td>367525</td><td>EDTA (10 ml)</td></tr><tr><td>BioViewCCBS</td><td>Clinomics</td><td></td><td>BioView - dostosowany system Bioview. Sprzęt do personalizacji oparty na mikroskopie Allegro Plus</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD45 (HI30), PE-Alexa Fluor 610</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD4522</td><td></td></tr><tr><td>FAST Kartridż automatyczny</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M3001</td><td></td></tr><tr><td>Kartridż LBx-1</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M4101</td><td></td></tr><tr><td>Kartridż LBx-2</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M4201</td><td></td></tr><tr><td>OPR-2000 instrument</td><td>Clinomics</td><td>CLX-I2001</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0101040</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny DynaMag 2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Solution</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>rozwiązanie gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Końcówka filtra, 10 i mikro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-10</td><td>Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</td></tr><tr><td>Końcówka filtra, 200 i mikro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-200</td><td>Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</td></tr><tr><td>Końcówka filtra, 100 &mikro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-100</td><td>Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</td></tr><tr><td>Końcówka filtra, 1000 i mikro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-1000</td><td>Końcówki do pipet z barierami aerozolowymi są zalecane, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie FITC CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td>324204</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz Anty-ludzka cytokeratyna</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (35% wag. w H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433284</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Wycieraczki</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>41117</td><td></td></tr><tr><td>Rękawica lateksowa</td><td>Microflex</td><td>63-754</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak do separacji kulek</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 772F2M-2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetowanie ręczne&nbsp; (0,5-10 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>Pipetowanie ręczne&nbsp; (2-20 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000038</td><td></td></tr><tr><td>Pipetowanie ręczne&nbsp; (10-100 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>Pipetowanie ręczne&nbsp; (20-200 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Ręczne pipetowanie&nbsp; (100-1000 &mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe z DAPI&nbsp;- Wodny, Fluoroshield</td><td>abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Normalna ludzka kontrola IgG</td><td>R& D Systems</td><td>1-001-A</td><td></td></tr><tr><td>OLYMPUS BX-UCB</td><td>Olympus</td><td>9217316</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne cytokeratyny Pan (AE1/AE3), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53-9003-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami)</td><td>Corning</td><td>21-040CVC</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny środek do pipetowania</td><td>Drummond</td><td>4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Szkło przesuwne</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-1000612</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko do barwienia Simport</td><td></td><td>M920</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna pipeta serologiczna (10 ml)</td><td>SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; Rozwiązanie X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Krew</td><td></td><td></td> pełna <td>przechowywana w temperaturze 4-8 stopni; C przez gromadzenie w stabilnej probówce EDTA lub cfDNA : Jeśli pełna krew jest niewystarczająca w 9 ml, dodaj PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) tyle, ile to konieczne.</td></tr><tr><td>X-Cite 120Q (oświetlacz świetlówki)</td><td>Excelitas</td><td>010-00157</td><td></td></tr></tbody></table>

automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Ostatnio płynne biopsje są używane do diagnozowania różnych chorób, w tym raka. Płyny ustrojowe zawierają wiele substancji, w tym komórki, białka i kwasy nukleinowe pochodzące z normalnych tkanek, ale niektóre z tych substancji pochodzą również z chorego obszaru. Badanie i analiza tych substancji w płynach ustrojowych odgrywają kluczową rolę w diagnostyce różnych chorób. Dlatego ważne jest, aby dokładnie oddzielić wymagane substancje i opracowano kilka technik, które można zastosować w tym celu.
Opracowaliśmy urządzenie i platformę typu lab-on-a-disc o nazwie CD-PRIME. To urządzenie jest zautomatyzowane i daje dobre wyniki w zakresie zanieczyszczenia próbki i stabilności próbki. Ponadto ma zalety dobrej wydajności akwizycji, krótkiego czasu pracy i wysokiej powtarzalności. Ponadto, w zależności od rodzaju dysku, który ma być zamontowany, można oddzielić osocze zawierające bezkomórkowe DNA, krążące komórki nowotworowe, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub kożuchy. W ten sposób pozyskiwanie różnych materiałów obecnych w płynach ustrojowych może odbywać się do różnych dalszych zastosowań, w tym do badań omicznych.

Celem tej techniki jest łatwe i automatyczne izolowanie substancji związanych z nowotworami z krwi pełnej. W szczególności technika ta może być wykorzystana przez każdego w odpowiednich obszarach badań i analiz. Jednoczesna i powtarzalna separacja wielu substancji w jednej próbce krwi ma istotne znaczenie w płynnych biopsjach. Dyski LBx-1 i LBx-2 są używane do izolowania osocza oraz warstwy leukocytarnej (buffy coat) lub PBMC z krwi pełnej. Rysunek 1 przedstawia materiały oddzielone przy zas...

Ten artykuł opisuje zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do łatwego i efektywnego oddzielania i zbierania substancji, takich jak bezkomórkowe DNA i krążące komórki nowotworowe, z krwi pełnej.

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Nasz protokół jest przyjazny dla użytkownika. Korzystając z tej techniki, każdy może łatwo wyizolować składnik z krwi. Zanieczyszczenie można zminimalizować, a materiały można dokładnie oddzielić.Dzięki automatyzacji i ustanowieniu tego protokołu, naukowcy mogą łatwo uzyskać substancje związane z rakiem o wysokiej czystości, co jest pomocne w różnych dalszych badaniach. W szczególności oczekuje się, że przyniesie to istotne korzyści w zakresie badań z użytkownikami końcowymi. Swoją procedurę zademonstruje Jay Jeong, starszy badacz i asystent kierownika w Instytucie Badawczym Cancer Genomics.Aby rozpocząć, załaduj wkładkę LBx 1, wybierając typ wkładu na panelu ekranu dotykowego instrumentu. Naciśnij przycisk strzałki, aby zmienić liczbę próbek. Następnie otwórz drzwiczki przyrządu i włóż wszystkie wkłady, które mają być używane, w kolejności według numeru na uchwycie wkładu.W przypadku łącznie czterech wkładów należy umieścić atrapę naboju w pustej przestrzeni uchwytu na wkład. Użyj koła podporowego, aby zamontować wkład i dokręć nakrętkę zabezpieczającą, aby ją zabezpieczyć. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk uruchamiania na ekranie panelu dotykowego.Przyrząd zamyka zawory na wkładach, co trwa około 30 sekund. Postępuj zgodnie z komunikatem, aby otworzyć drzwi. Zdejmij koło podporowe i wyjmij wkład z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu.Odpipetować maksymalnie 10 mililitrów próbki krwi pełnej za pomocą pipety serologicznej. Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu próbki wkładu i powoli wstrzyknij próbkę krwi pełnej. Po włożeniu wkładów do instrumentu zamknij drzwiczki przyrządu i naciśnij przycisk OK.Płaszcze plazmowe i kożuchowe są automatycznie oddzielane od krwi pełnej, co trwa około 30 minut. Gdy płaszcz plazmowy i kożuchowy zostaną oddzielone, na ekranie pojawi się komunikat, któremu towarzyszy dźwięk alarmu. Wyłącz alarm, otwierając drzwi lub naciskając przycisk stop.Otwórz drzwi. Wyjmij wkład i połóż go na stole. Odzyskaj trzy mililitry osocza z wylotu plazmy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety.Następnie odzyskaj trzy mililitry kożucha z wylotu kożucha za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipety. Następnie załaduj wkładkę LBx 2, wybierając nazwę wkładki na panelu ekranu dotykowego urządzenia. Naciśnij przycisk strzałki, aby zmienić liczbę próbek i postępuj zgodnie z tą samą procedurą, która jest pokazana dla wkładu LBx 1, aby włożyć wkład do uchwytu wkładu.Po włożeniu wkładu i zamknięciu drzwiczek naciśnij przycisk uruchamiania na ekranie panelu dotykowego. Postępuj zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej, aby wyjąć wkład zamknięty zaworem z uchwytu wkładu i umieścić go na stole. Odpipetować roztwór gradientu gęstości za pomocą pipety serologicznej.Włóż końcówkę pipety głęboko do wlotu wkładu i powoli wstrzykuj roztwór. Następnie należy odpipetować próbkę krwi pełnej i powoli wstrzyknąć ją do wlotu próbki. Po włożeniu i zabezpieczeniu wkładu zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk OK.Gdy osocze i PBMC zostaną automatycznie oddzielone od krwi pełnej, pojawi się komunikat, któremu towarzyszy dźwięk alarmu. Otwórz drzwiczki i wyjmij wkład. Odzyskaj trzy mililitry osocza z wylotu plazmy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, a następnie odzyskaj trzy mililitry PBMC z wylotu PBMC.Podobnie w przypadku wkładu FAST-auto, po wyjęciu wkładu z zamkniętym zaworem z uchwytu wkładu, wstrzyknąć sześć mililitrów roztworu PBS do wlotu PBS wkładu. Następnie odpipetować trzy mililitry krwi pełnej lub kożuchy uzyskanej z LBx 1 lub próbki PBMC otrzymanej z LBx 2 i powoli wstrzyknąć próbkę do wlotu próbki wkładu. Po włożeniu wkładu i zabezpieczeniu go zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk OK.Po zakończeniu automatycznego wzbogacania CTC zatrzymaj alarm. Wyjmij wkład i włóż środek do usuwania tylnej płyty (BPR) do czterech otworów z przodu wkładu. Naciśnij ciemnoniebieskie skrzydło kciukami obu rąk, a następnie naciśnij jasnoniebieski korpus, aż usłyszysz kliknięcie.Ostrożnie wyjmij korpus wkładu, podnosząc go. Bardzo delikatnie podnieś membranę filtracyjną za krawędź za pomocą pęsety i umieść membranę w 1,5-mililitrowej probówce do przygotowania kwasu nukleinowego lub na szkle szkiełkowym do barwienia. W razie potrzeby odzyskaj przefiltrowaną krew do ujścia krwi za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety.Wyekstrahowane cfDNA oceniono za pomocą Bioanalyzera, a taśmy przesiewowe cfDNA użyto razem z elektroniczną drabinką. Zielona linia została użyta do wyrównania drabiny i próbki. Trójkątne znaki wskazują prążek DNA.Większość cfDNA ma długość 166 par zasad, a niektóre występują w całkowitych wielokrotnościach długości. Zwykle stężenie cfDNA mierzy do wielkości od 50 do 700 par zasad. Chociaż istnieje różnica w ilości uzyskanej z każdej pojedynczej próbki, taka jak 8,47 nanogramów na mililitr i 5,2 nanogramów na mililitr, wyniki ekstrakcji cfDNA były dobre zarówno dla stężenia, jak i rozkładu wielkości we wszystkich przypadkach.Wyniki te wskazują, że metoda LBx 1 dokładnie oddziela osocze zawierające cfDNA. W FAST-auto błona została usunięta i wybarwiona przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu wykrycia CTC i białych krwinek. Zabarwioną membranę, umieszczoną na szkiełkach podstawowych, obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym.Po barwieniu błony komórki wykazują DAPI lub sygnały jądrowo-dodatnie na niebiesko, podczas gdy dodatnie sygnały EpCAM i CK lub CTC są podświetlone na zielono, a dodatnie CD45 lub WBC są podświetlone na czerwono. Usunięcie membrany nie jest trudne. Należy jednak zachować ostrożność w związku z utratą i zanieczyszczeniem CTC.Dostępna jest krew pełna, PBMC i kożuchowa sierść. Zamiast tego wystarczy ustawić całą głośność. Można również użyć innych płynów, chociaż wymagane będą testy.Technika ta może być stosowana bezpośrednio w szpitalach, a substancję można szybko uzyskać.

automatic-separation-collection-cancer-related-substances-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są prognostyczne w kilku nowotworach przerzutowych. Ten manuskrypt opisuje złoty standard systemu CellSearch (CSS) platformy wyliczania CTC i zwraca uwagę na typowe błędy błędnej klasyfikacji. Ponadto opisano dwa dostosowane protokoły do definiowanej przez użytkownika charakterystyki markerów CTC i liczenia CTC w przedklinicznych mysich modelach przerzutów przy użyciu tej technologii.

Adaptacja półautomatycznych testów na krążące komórki nowotworowe (CTC) do zastosowań klinicznych i przedklinicznych

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

Manuskrypt przedstawia pobieranie próbek ludzkich guzów mózgu na miejscu za pomocą mikroekstrakcji w fazie stałej, a następnie ich profil biochemiczny w kierunku odkrycia biomarkerów.

Pobieranie próbek i ekstrakcja guzów mózgu na miejscu do analizy metabolomicznej i lipidomicznej

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Protokół ten standaryzuje analizę SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania korona białek na nanocząstkach, umożliwiając powtarzalne, skalowalne i niskokosztowe wykrywanie sygnatur specyficznych dla raka. Zaprojektowany do wczesnej diagnozy gruczolakoraka przewodowego trzustki, oferuje praktyczną, PEWNĄ alternatywę dla złożonych metod proteomicznych zarówno w badaniach, jak i klinicznych.

Standaryzowany przepływ SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów

Poznaj automatyczną metodę izolacji DNA pozakomórkowego i komórek nowotworowych krążących z krwi pełnej. Protokół minimalizuje zanieczyszczenia i zapewnia wysoką czystość ekstrahowanych substancji do badań genomiki nowotworowej.

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Przeglądaj więcej filmów