Name: Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metody pobierania nasienia i analizę CASA u medaki japońskiej (Oryzias latipes). Techniki te umożliwiają badanie wpływu zanieczyszczeń na płodność samców w ekotoksykologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Norweski Uniwersytet Przyrodniczy i amerykański program Fulbrighta. Autorzy chcieliby podziękować Anthony'emu Peltierowi i Lourdes Carreon G Tan z NMBU za konserwację obiektu rybnego oraz Guillaume'owi Gourmelinowi z ISC LPGP w INRAE (Francja) za udostępnienie ryb i przestrzeni laboratoryjnej do dalszego testowania tych metod.

Wszystkie eksperymenty i prace z zwierzętami przeprowadzono zgodnie z zaleceniami dotyczącymi dobrostanu zwierząt doświadczalnych w Norweskim Uniwersytecie Nauk Przyrodniczych (NMBU). Doświadczenia wykonano na dorosłych (6–9-miesięcznych) samcach japońskiej medaki (szczep Hd-rR) hodowanych w NMBU (Ås, Norwegia). Metody zostały również krótko przetestowane na 9-miesięcznych samcach japońskiej medaki (szczep CAB) hodowanych w Narodowym Instytucie Badawczym Rolnictwa, Żywności i Środowiska (INRAE, Rennes, Francja).
1. Przygotowanie aparatury i roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór zapasowy środka znieczulającego (0,6% tricainy).
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,6 g trikainy (MS-222) w 100 ml 10-krotnego roztworu soli buforowych z fosforanem (PBS).</li>
		<li>Przenieś po 2 ml roztworu zakładowego środka znieczulającego do 50 plastikowych probówek o pojemności 2 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu zastosowania w celu znieczulenia lub eutanazji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wodę do odzyskiwania (0,9% roztwór chlorku sodu [NaCl]).
	<ol>
		<li>Do 3 L wody akwariowej dodać 27 g NaCl.</li>
		<li>Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby dostosować medium aktywacyjne (zrównoważony roztwór soli Hanksa [HBSS]). 
	UWAGA: Roztwór HBSS można nabyć w handlu lub przygotować w laboratorium (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Zmierz pH roztworu HBSS za pomocą pH-metru. W razie potrzeby skoryguj wartość pH, używając kwasu solnego lub wodorotlenku sodu, tak aby końcowe pH wynosiło 7,1–7,3.</li>
		<li>Zmierz osmolalność roztworu HBSS za pomocą osmometru w celu późniejszego zaraportowania wyników. 
		UWAGA: Zakres dla produktu komercyjnego wynosi 266–294 mOsmol/kg; w niniejszym badaniu osmolalność wynosiła 287 mOsmol/kg. W razie potrzeby można go rozcieńczyć wodą destylowaną w celu obniżenia osmolalności, jednak nie jest to konieczne, ponieważ nie występuje znacząca różnica w aktywacji plemników medaki w HBSS o osmolalności 150–300 mOsmol/kg.</li>
		<li>Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować gąbkę stabilizującą.
	<ol>
		<li>Wytnij kawałek miękkiej gąbki tak, aby ściśle pasował do szalki Petriego.</li>
		<li>Wytnij w środku gąbki prostą linię o długości wystarczającej do umieszczenia ryby (3–4 cm) i głębokości około 1 cm (Rysunek 1A). To nacięcie w gąbce pozwoli utrzymać rybę stroną brzuszną do góry, aby odsłonić kloakę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie nasienia
UWAGA: Pobieranie plemników można przeprowadzić dwiema różnymi metodami: masażem jamy brzusznej lub sekcją jąder.
<ol>
	<li>Pozyskiwanie nasienia poprzez masaż brzuszny
	<ol>
		<li>Przygotować 0,03% roztwór znieczulający, rozcieńczając jedną probówkę stoku Tricaine (0,6%) w 38 mL wody akwariowej w szklanym pojemniku o pojemności 100 mL.</li>
		<li>Przygotować instrumenty, w tym gładkie pęsety z tępym końcem oraz jednorazową kalibrowaną szklaną mikropipetę o pojemności 10 µL wraz z zestawem rurki aspiracyjnej (Rysunek 1A). Zwilżyć gąbkę do unieruchamiania przygotowaną w kroku 1.4 roztworem znieczulającym.</li>
		<li>Przygotować probówki zawierające 36 µL roztworu aktywującego do natychmiastowej analizy. Podgrzać roztwór aktywujący w kąpieli wodnej lub inkubatorze ustawionym na 27 °C przez co najmniej 5 min. 
		UWAGA: Chociaż analizę można przeprowadzać na próbkach od pojedynczych ryb, zmienność osobniczą można zredukować poprzez łączenie próbek od wielu samców w tym samym roztworze aktywującym. Przy łączeniu próbek od wielu ryb należy stosować 36 µL roztworu aktywującego na jedną rybę. Rozcieńczenie to może wymagać korekty w zależności od szczepu lub warunków hodowli medaki, ponieważ czynniki te mogą wpływać na stężenie i objętość nasienia. Program CASA wskaże, czy stężenie jest zbyt wysokie, aby zidentyfikować plemniki.</li>
		<li>Znieczulić rybę, umieszczając ją w roztworze znieczulającym na 30-90 s. 
		UWAGA: Czas znieczulenia musi zostać dostosowany, ponieważ różni się on w zależności od wielkości ryby. Aby upewnić się, że ryba jest całkowicie znieczulona, należy delikatnie ucisnąć pęsetą szypułkę ogonową. Jeśli ryba nie reaguje, można rozpocząć masaż.</li>
		<li>Wyjąć rybę z roztworu znieczulającego i za pomocą ręcznika papierowego lub delikatnie wytrzeć, aby osuszyć brzuch ryby. Umieścić rybę w zagłębieniu wilgotnej gąbki do unieruchamiania stroną brzuszną do góry, tak aby skrzela były wystawione na działanie roztworu znieczulającego w gąbce (Rysunek 1B).</li>
		<li>Jeśli obszar wokół kloaki jest mokry, delikatnie osuszyć spód ryby jednorazową chusteczką higieniczną.</li>
		<li>Umieścić rybę w gąbce do unieruchamiania pod mikroskopem stereoskopowym i przyłożyć mikropipetę z dołączoną rurką aspiracyjną do kloaki ryby (Rysunek 1C).</li>
		<li>Wykonuje masaż brzucha ryby, delikatnie uciskając go gładkimi pęsetami z tępym końcem w kierunku od głowy do ogona, jednocześnie zasysając wydzielaną milt do pipety (Rysunek 1D).</li>
		<li>Przenieść rybę z gąbki do wody regeneracyjnej. Pozostawić ryby w roztworze na co najmniej 15 min przed powrotem do systemu akwariowego.</li>
		<li>Przenieść milt do przygotowanej probówki z podgrzanym roztworem aktywującym i kilkukrotnie pipetować, zasysając i wydmuchując powietrze przez zestaw rurki aspiracyjnej.</li>
		<li>Delikatnie zhomogenizować rozcieńczone nasienie poprzez strzepywanie probówek przed analizą. 
		UWAGA: Dla uzyskania najlepszych wyników próbki należy analizować natychmiast (np. po 5 s) po aktywacji. U medaki analizę można w razie potrzeby opóźnić, ponieważ plemniki pozostają ruchliwe przez kilka godzin, jednak czas ten powinien być spójny dla wszystkich próbek, gdyż ruchliwość zmniejsza się z czasem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie nasienia poprzez sekcję jąder
	<ol>
		<li>Przygotować 0,08% roztwór do eutanazji, rozcieńczając dwie probówki stoku Tricaine (0,6%) w 26 mL wody akwariowej w szklanym pojemniku o pojemności 100 mL.</li>
		<li>Przygotować narzędzia do sekcji, w tym pęsety tępe i precyzyjne oraz małe nożyczki sekcyjne (Rysunek 1E).</li>
		<li>Przygotować probówkę dla każdej próbki z 120 µL roztworu aktywującego do natychmiastowej analizy. Podgrzać roztwór aktywujący w kąpieli wodnej lub inkubatorze ustawionym na 27 °C przez co najmniej 5 min. 
		UWAGA: Chociaż analizę można przeprowadzać na próbkach od pojedynczych ryb, zmienność osobniczą można zredukować poprzez łączenie próbek od wielu samców w tym samym roztworze aktywującym. Przy łączeniu próbek od wielu ryb należy stosować 120 µL roztworu aktywującego na jedną rybę. Rozcieńczenie to może wymagać korekty w zależności od szczepu lub warunków hodowli medaki, ponieważ czynniki te mogą wpływać na stężenie i objętość nasienia. Program CASA wskaże, czy stężenie jest zbyt wysokie, aby zidentyfikować plemniki.</li>
		<li>Uśmiercić rybę, umieszczając ją w 0,08% roztworze znieczulającym na 30-90 s. 
		UWAGA: Czas zależy od wielkości ryby. Aby upewnić się, że ryba została uśmiercona, należy poczekać do ustania ruchów pokryw skrzelowych. Ryba nie powinna reagować na dotyk pęsety.</li>
		<li>Wyjąć rybę z roztworu do eutanazji i delikatnie osuszyć ją ręcznikiem papierowym lub miękko wytrzeć. 
		UWAGA: Na tym etapie rybę można zważyć, aby później obliczyć wskaźnik gonadosomatyczny (GSI, masa gonad / masa ciała).</li>
		<li>Umieścić rybę pod mikroskopem stereoskopowym lewą stroną boczną skierowaną do góry (Rysunek 1F).</li>
		<li>Za pomocą małych nożyczek sekcyjnych wyciąć płat grzbietowo od strony kloaki, a następnie w poprzek żeber aż do skrzeli, aby odsłonić narządy wewnętrzne (Rysunek 1G).</li>
		<li>Zlokalizować jądra, odciąć przyczepy na obu końcach precyzyjną pęsetą i usunąć jądra (Rysunek 1H). 
		UWAGA: Aby obliczyć GSI, jądra można zważyć na tym etapie. Należy pracować szybko, aby uniknąć wyschnięcia tkanki.</li>
		<li>Przenieść jądra do przygotowanej probówki z podgrzanym roztworem aktywującym.</li>
		<li>Za pomocą pęsety kilka razy rozgnieść jądra o ściankę probówki, aby uwolnić nasienie. Uwolnienie plemników jest zazwyczaj widoczne i spowoduje lekkie zmętnienie roztworu.</li>
		<li>Delikatnie zhomogenizować rozcieńczone nasienie poprzez strzepywanie probówek przed analizą. 
		UWAGA: Dla uzyskania najlepszych wyników próbki należy analizować natychmiast (np. po 5 s) po aktywacji. U medaki analizę można w razie potrzeby opóźnić, ponieważ plemniki pozostają ruchliwe przez kilka godzin, jednak czas ten powinien być spójny dla wszystkich próbek, gdyż ruchliwość zmniejsza się z czasem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Ekstrakcja i sekcja nasienia ryb; mikropipeta, pęseta i nożyczki; proces eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64326/64326fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pobieranie nasienia poprzez masaż brzuszny (A-D) oraz sekcję jąder (E-H). (A) Narzędzia do masażu brzusznego: gąbka stabilizująca, tępa gładka pęseta oraz jednorazowa kalibrowana szklana mikropipeta 10 µL z zestawem rurki aspiracyjnej; (B) Położenie ryby w gąbce stabilizującej, z odsłoniętymi skrzelami do znieczulenia w gąbce i otworem kloaki skierowanym do góry; (C) Położenie tępej gładkiej pęsety na brzuchu i mikropipety przy kloace; (D) Nasienie w mikropipecie po delikatnym masażu i zasysaniu. (E) Narzędzia do sekcji jąder: pęseta tępa, pęseta precyzyjna i małe nożyczki sekcyjne; (F) Położenie ryby do sekcji jąder; (G) Widok boczny narządów wewnętrznych; (H) Usunięcie jąder poprzez przecięcie przyczepów na obu końcach za pomocą pęsety precyzyjnej. Pasek skali: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64326/64326fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Analiza nasienia z wykorzystaniem systemu CASA
<ol>
	<li>System CASA (SCA Evolution) należy skonfigurować zgodnie z instrukcją obsługi, używając mikroskopu z filtrem zielonym i obiektywem 10x z kontrastem fazowym.</li>
	<li>Jednorazowe szkiełka z komorą liczbową 20 µm należy przygotować poprzez wstępne podgrzanie na płycie grzejnej lub w inkubatorze ustawionym na 27 °C przez co najmniej 5 min.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy nasionsia i wybierz moduł ruchliwości.</li>
	<li>Ustaw konfigurację dla medaka, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2B.</li>
	<li>Umieść wstępnie podgrzane jednorazowe szkiełko z komorą liczbową 20 µm pod mikroskopem na podgrzewanym stole ustawionym na 27 °C.</li>
	<li>Pipetuj próbkę do komory na szkiełku, aż wypełni ona przestrzeń, uważając, aby jej nie przepełnić. Ostrożnie usuń nadmiar próbki z wlotu komory za pomocą patyczka bawełnianego lub delikatnie przemyj, aby zapobiec pojawieniu się pływających komórek.</li>
	<li>Wybierz Analyze, aby obejrzeć próbkę pod mikroskopem. 
	UWAGA: Jeśli ikona mikroskopu jest czerwona, należy dostosować oświetlenie mikroskopu, aby program mógł dokładnie śledzić plemniki. Dostosuj jasność mikroskopu tak, aby ruch ogonów plemników był wyraźnie widoczny. Ikona powinna stać się niebieska.</li>
	<li>Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w ostrości i ponownie wybierz Analyze, aby zarejestrować plemniki w polu widzenia. Przesuń szkiełko tak, aby w kadrze znalazł się nowy obszar próbki i powtórz czynność dla 3-5 różnych pól widzenia. Unikaj pól z pęcherzykami powietrza, skupiskami komórek lub artefaktami.</li>
	<li>Wybierz Results, aby wyświetlić wyniki. 
	UWAGA: Jeśli pola na stronie wyników są obwiedzione na czerwono, postępuj zgodnie z komunikatami systemu, aby usunąć pola, w których stężenie lub ruchliwość zbyt mocno odbiegają od normy.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie pole, aby wyświetlić wyniki dla pojedynczego pola lub ręcznie sprawdzić błędnie oznaczone lub nienaniesione plemniki. Jeśli jest to konieczne, kliknij prawym przyciskiem myszy na poszczególne plemniki, aby zmienić etykietę ich ruchliwości (Rysunek 2A).</li>
</ol>
<img alt="Interfejs oprogramowania do analizy nasienia; dane dotyczące ruchliwości, konfiguracja parametrów, wykres wizualizacji wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64326/64326fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zrzut ekranu oprogramowania SCA Evolution. (A) Wyniki śledzenia plemników dla jednego pola. Dane pola są widoczne po prawej stronie; dwukrotne kliknięcie plemnika pozwala wyświetlić indywidualne dane; (B) Podsumowanie wyników dla wszystkich pól z otwartym menu konfiguracji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64326/64326fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Osmolalność jest ważnym czynnikiem w aktywacji plemników ryb36,37. Ogólnie rzecz biorąc, plemniki są nieruchome w jądrach i stają się ruchliwe w pożywkach, które są hiperosmotyczne w stosunku do płynu nasiennego u ryb morskich i hipoosmotyczne w stosunku do płynu nasiennego u ryb słodkowodnych37. Podobnie jak we krwi, osocze nasienia u ryb słodkowodnych jest zazwyczaj niższe niż u ryb morskich (około 300 mOsmol/kg w porównaniu do 400 mOsmo...

Japońska medaka to mała, składająca jaja słodkowodna ryba teleostyczna pochodząca z Azji Wschodniej. Medaka stała się doskonałym systemem modelowania kręgowców dla ekotoksykologii, genetyki rozwojowej, genomiki oraz badań nad biologią ewolucyjną i fizjologią1,2. Podobnie jak popularne danio pręgowane, są stosunkowo łatwe w hodowli i wysoce odporne na wiele powszechnych chorób ryb1,2. Istnieje kilka zalet korzystania z medaka jako modelu, w tym krótki czas generacji, przezroczysty embryos1,2 oraz sekwencjonowany genom3. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, medaka ma gen4, a także tolerancję na wysoką temperaturę (od 4-40 °C) i zasolenie (gatunki euryhalinowe)5. Ponadto wiele narzędzi genetycznych i anatomicznych, a także protokołów6,7,8,9,10,11,12, zostały opracowane w medaka, aby ułatwić badanie jego biologii.
Rozmnażanie jest podstawową funkcją fizjologiczną, ponieważ pozwala gatunkowi przetrwać. Rozmnażanie kręgowców wymaga niezliczonych precyzyjnie zaplanowanych zdarzeń, w tym produkcji oocytów u samic i produkcji plemników u samców. Plemniki to unikalne komórki, wytwarzane w złożonym procesie spermatogenezy, w którym istnieje szereg punktów kontrolnych gwarantujących dostarczenie produktu wysokiej jakości13. Jakość gamet stała się przedmiotem zainteresowania w akwakulturze i badaniach populacji ryb ze względu na jej wpływ na sukces zapłodnienia i przeżywalność larw. Jakość nasienia jest zatem ważnym wskaźnikiem płodności samców kręgowców.
Trzy użyteczne czynniki do oceny jakości nasienia ryb to ruchliwość, postępowość i długowieczność. Ruchliwość procentowa i ruchliwość postępowa są powszechnymi wskaźnikami jakości plemników, ponieważ ruch postępowy jest niezbędny do powodzenia zapłodnienia i silnie z nim koreluje14,15. Czas trwania ruchu jest również ważnym wskaźnikiem u ryb, ponieważ plemniki pozostają w pełni ruchliwe przez mniej niż 2 minuty u większości gatunków teleostów, a trajektoria plemników jest na ogół mniej liniowa niż u ssaków15. Jednak wiele badań oceniających ruchliwość plemników w przeszłości opierało się na subiektywnych lub półilościowych metodach analizy plemników15,16. Na przykład ruchliwość plemników w medaka była w przeszłości szacowana wizualnie pod mikroskopem17. Oszacowano go również poprzez rejestrowanie ruchu plemników i używanie oprogramowania do obrazowania w celu łączenia ramek oraz pomiaru ścieżki i prędkości pływania18,19,20. Takie podejścia często nie są solidne, dając różne wyniki w zależności od osoby przeprowadzającej analizę15,21.
Komputerowa analiza nasienia (CASA) została początkowo opracowana dla ssaków. CASA to szybka metoda ilościowa do oceny jakości nasienia poprzez rejestrowanie i pomiar prędkości i trajektorii w sposób zautomatyzowany15. U ryb był używany u różnych gatunków do monitorowania wpływu kilku zanieczyszczeń wody na jakość nasienia, do identyfikacji interesujących progenitorów w celu ulepszenia stada wylęgowego, poprawy efektywności kriokonserwacji i przechowywania oraz optymalizacji warunków zapłodnienia15. Dlatego jest to potężne narzędzie do wiarygodnej oceny jakości nasienia u różnych gatunków kręgowców. Jednak ze względu na dużą różnorodność strategii rozrodczych między rybami, plemniki ryb teleost różnią się od nasienia ssaków i gatunków ryb. Ryby teleost, które przede wszystkim zapładniają jaja zewnętrznie, uwalniając gamety do wody, mają wysoce skoncentrowane plemniki, które są stosunkowo proste w budowie bez akrosomów, w przeciwieństwie do ssaków, które zapładniają wewnętrznie i dlatego nie muszą kompensować rozcieńczenia w wodzie, ale muszą wytrzymać bardziej lepkie płyny14. Ponadto plemniki większości ryb poruszają się szybko, ale są w pełni ruchliwe przez mniej niż 2 minuty po aktywacji, chociaż istnieje kilka wyjątków15,22. Ponieważ ruchliwość może gwałtownie spaść u większości ryb, należy zachować szczególną ostrożność przy czasie analizy po aktywacji podczas określania protokołu analizy nasienia dla ryb.
Rozmnażanie jest jedną z dziedzin biologii, w której teleosty i medaka były szeroko stosowane jako organizmy modelowe. Rzeczywiście, samce medaka wykazują interesujące zachowania reprodukcyjne i społeczne, takie jak ochrona partnera23,24. Ponadto istnieje kilka linii transgenicznych do badania neuroendokrynnej kontroli rozrodu u tego gatunku25,26,27. Pobieranie próbek nasienia, procedura, która jest stosunkowo prosta u większych ryb, może być bardziej skomplikowana u małych ryb modelowych, ponieważ produkują one mniej plemników i są delikatniejsze. Z tego powodu większość badań polegających na pobieraniu próbek nasienia w ekstrakcie medaka milt (nasienie ryb) poprzez zmiażdżenie wypreparowanych jąder17,28,29,30. W kilku badaniach stosuje się również zmodyfikowany masaż brzucha, aby wyrazić milt bezpośrednio w medium aktywującym18,19,20; Jednak przy tej metodzie trudno jest zobrazować ilość i kolor wydobywanego mlecza. U danio pręgowanego masaż brzucha jest powszechnie stosowany do wyrażania mleczka, które jest natychmiast zbierane w rurce kapilarnej31,32,33. Metoda ta umożliwia oszacowanie objętości mlecza, a także obserwację barwy ejakulatu, która jest szybkim i prostym wskaźnikiem jakości nasienia32,33. W związku z tym w przypadku medaki brakuje jasnego i dobrze opisanego protokołu pobierania i analizy nasienia.
Ten artykuł opisuje zatem dwie metody pobierania nasienia u małego modelu japońskiej ryby: preparację jąder i masaż brzucha za pomocą kapilarnek. Pokazuje to, że oba podejścia są wykonalne dla medaka i pokazuje, że masaż brzucha może być wykonywany wielokrotnie wiele razy, ponieważ ryba szybko wraca do zdrowia po zabiegu. Opisano w nim również protokół komputerowej analizy nasienia w medaka, aby wiarygodnie zmierzyć kilka ważnych wskaźników jakości plemników medaka (ruchliwość, progresywność, długowieczność i względne stężenie plemników). Procedury te, określone dla tego użytecznego modelu małego teleostu, znacznie poprawią zrozumienie środowiskowych, fizjologicznych i genetycznych czynników wpływających na płodność u samców kręgowców.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Można użyć dowolnej standardowej marki</td></tr><tr><td>10 i mikro; L jednorazowy kalibrowany szklany zespół mikropipety i rurki aspiratora</td><td>Drummond</td><td>2-000-010</td><td></td></tr><tr><td>10-krotny obiektyw z kontrastem fazowym</td><td>Nikon</td><td>MRP90100</td><td></td></tr><tr><td>rurki 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-c-s</td><td>Można użyć dowolnej standardowej marki</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze gładkie</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa szkiełko z komorą liczącą 20 mikronów</td><td>Microptic</td><td>20.2.25&nbsp;</td><td>Leja 2 zjeżdżalnie komorowe</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>Można użyć dowolnej standardowej marki</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H8264-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka trzymająca</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ts2R</td><td></td></tr><tr><td>SCA Evolution</td><td>Microptic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Wir stołowy</td><td>Labnet</td><td>C1301B</td><td></td></tr><tr><td>Trikaine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej medaka (oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Japońska medaka (Oryzias latipes) to ryba teleostyczna i wyłaniający się model kręgowców do badań ekotoksykologicznych, rozwojowych, genetycznych i fizjologicznych. Medaka jest również szeroko stosowana do badania rozmnażania kręgowców, które jest podstawową funkcją biologiczną, ponieważ pozwala gatunkowi na przetrwanie. Jakość nasienia jest ważnym wskaźnikiem męskiej płodności, a tym samym sukcesu reprodukcyjnego. Techniki ekstrakcji nasienia i analiza nasienia są dobrze udokumentowane dla wielu gatunków, w tym ryb teleostowych. Pobieranie nasienia jest stosunkowo proste u większych ryb, ale może być bardziej skomplikowane u małych ryb modelowych, ponieważ produkują one mniej plemników i są delikatniejsze. W związku z tym w niniejszym artykule opisano dwie metody pobierania nasienia u małego modelu ryby, japońskiej medaki: preparację jąder i masaż brzucha. Artykuł ten pokazuje, że oba podejścia są wykonalne w przypadku medaka i pokazuje, że masaż brzucha może być wykonywany wielokrotnie wiele razy, ponieważ ryby szybko wracają do zdrowia po zabiegu. W artykule opisano również protokół komputerowej analizy nasienia w medaka w celu obiektywnej oceny kilku ważnych wskaźników jakości nasienia medaka (ruchliwość, progresywność, czas trwania ruchliwości, względne stężenie). Procedury te, określone dla tego użytecznego modelu małego teleostu, znacznie poprawią zrozumienie środowiskowych, fizjologicznych i genetycznych czynników wpływających na płodność u samców kręgowców.

Rodzaj uzyskanych danych 
Analiza ruchliwości plemników za pomocą oprogramowania SCA Evolution dostarcza danych na temat ruchliwości (procent plemników ruchliwych i nieruchomych), progresywności (procent plemników progresywnych i nieprogresywnych) oraz prędkości (procent plemników poruszających się szybko, średnio i powoli). Łączy ona również progresywność z prędkością (szybko progresywne, średnio progresywne, nieprogresywne). Etykiety te opierają się na pomiarach (Rysunek 3A</str...

Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Technika ta umożliwia pobieranie próbek mleka z małego modelu ryby, japońskiej Madaki, oraz badanie jego jakości w spójny sposób. W szczególności pobieranie nasienia za pomocą masażu brzucha pozwala na wielokrotne pobieranie próbek na tej samej rybie, ponieważ takie podejście nie jest inwazyjne. Co więcej, technika ta może być stosowana do kriokonserwacji nasienia Madaka.Jakość nasienia jest podstawowym wskaźnikiem sukcesu zapłodnienia, a zatem ważnym parametrem do analizy w badaniach nad ekologii i całością fizjologii produkcyjnej. Na początek przygotuj miękką gąbkę, krojąc ją tak, aby pasowała do szalki Petriego. Wytnij prostą linię na środku gąbki, która jest wystarczająco długa, aby utrzymać rybę brzuszną stroną do góry.Po znieczuleniu ryby osusz brzuch ryby, delikatnie wycierając go ręcznikiem papierowym. Umieść rybę w korycie wilgotnej gąbki mocującej brzuszną stroną do góry, tak aby jej skrzela były wystawione na działanie roztworu znieczulającego zawartego w gąbce. Jeśli obszar wokół kloaki jest mokry, delikatnie osusz spód brzucha jednorazową chusteczką do chusteczek.Pod mikroskopem preparacyjnym umieść mikropipetę z dołączoną rurką aspiratora do kloaki ryby. Teraz masuj brzuch ryby, delikatnie ściskając końcem gładkie kleszcze w ruchu rostralnym do ogonowego. W celu odzyskania ryby, wypuść ją z gąbki do wcześniej przygotowanej wody regeneracyjnej przed powrotem ryb do systemu akwariowego.Przenieść zebrane mleczo do probówki zawierającej wstępnie podgrzany roztwór aktywujący i kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół za pomocą zespołu probówki aspiratora. Delikatnie homogenizować rozcieńczone plemniki, przesuwając probówki przed analizą. Po eutanazji ryba wysuszyć ją, jak pokazano wcześniej, i umieścić rybę pod mikroskopem preparacyjnym lewą boczną stroną skierowaną do góry.Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych odetnij klapę grzbietowo od kloaki, a następnie w poprzek żeber do skrzeli, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Zlokalizuj jądra i odetnij nasadkę na obu końcach drobnymi kleszkami. Usunąć jądra i przenieść je do przygotowanej probówki zawierającej wstępnie podgrzany roztwór aktywujący.Użyj kleszczy, aby kilkakrotnie zmiażdżyć jądra o bok probówki, aby uwolnić plemniki, co można uwidocznić po lekko mętnym wyglądzie roztworu. Aby rozpocząć analizę, otwórz oprogramowanie do analizy nasienia i wybierz moduł ruchliwości. Ustaw konfiguracje w oprogramowaniu dla wszystkich parametrów.Umieść wstępnie podgrzane jednorazowe szkiełko z komorą liczącą o długości 20 mikrometrów pod mikroskopem na podgrzewanym stoliku, ustawionym na 27 stopni Celsjusza. Odpipetować próbkę do komory na szkiełku, aż się napełni, ale bez przepełnienia. Ostrożnie zetrzyj nadmiar próbek z wejścia do komory, aby zapobiec ruchowi dryftu komórek w roztworze.Wybierz opcję Analizuj, aby przyjrzeć się próbce pod mikroskopem. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony i ponownie wybierz opcję Analizuj, aby zarejestrować plemniki w terenie. Przesuń szkiełko do nowego obszaru próbki w ramce i powtórz procedurę dla trzech do pięciu różnych pól widzenia, unikając pęcherzyków powietrza, mas komórkowych lub artefaktów.Aby wyświetlić wyniki, wybierz wyniki i kliknij dwukrotnie pole, aby wyświetlić wizualizację pojedynczego pola lub ręcznie sprawdzić, czy nie ma błędnie oznaczonych lub nieśledzonych plemników. W razie potrzeby kliknij prawym przyciskiem myszy na poszczególne plemniki, aby ponownie oznaczyć ruchliwość. W niniejszym badaniu wykorzystano komputerową analizę nasienia do rejestracji różnych parametrów prędkości i ruchu.Obliczane wartości obejmują wskaźnik prostoliniowości, wskaźnik liniowości i chybotanie. Osmolarność roztworów aktywacyjnych wpłynęła na ruchliwość plemników z sekcji jądra. Plemniki były nieruchome w wodzie akwariowej, ale ruchliwe w HBSS z wysoką i niską osmolarnością.Jednak ruchliwość jest znacznie zmniejszona przy 36 mili osmolu na kilogram w porównaniu z roztworami o wyższej osmolalności. Na ruchliwość wpłynęła również metoda pobierania nasienia, w której plemniki są znacznie bardziej ruchliwe w metodzie rozwarstwiania jąder w porównaniu z masażem brzucha. Ponadto większy odsetek komórek był postępujący, a więcej komórek poruszało się średnio lub szybko.Procentowa ruchliwość i postępowość są znacznie wyższe w plemnikach przechowywanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie, w porównaniu z przechowywaniem w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Warunki środowiskowe i mieszkaniowe również nieznacznie wpłynęły na ruchliwość plemników. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w ruchliwości plemników w plemnikach pobranych po i przed tarłem.Samce trzymane bez samic przez miesiąc wykazywały wysoką ruchliwość, ale różnica była nieznaczna. W przypadku pobierania nasienia za pomocą masażu brzucha potrzebne jest szkolenie, aby nauczyć się prawidłowego nacisku i ruchu kleszczy oraz uniknąć zanieczyszczenia kałem. Technika ta będzie bardzo przydatna do zbadania, na przykład, wpływu różnych zanieczyszczeń na męską płodność w badaniach ekotoksykologicznych, gdzie Medaka jest powszechnie stosowanym modelem.

sperm-collection-computer-assisted-sperm-analysis-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku...

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Danio pręgowany jest ważnym organizmem modelowym do badania homeostazy energetycznej.  Wykorzystując czuły na NADH2 wskaźnik redoks, alamar Blue, opracowaliśmy test, który mierzy tempo metabolizmu larw danio pręgowanego w formacie 96-dołkowej płytki i może być stosowany do odkrywania leków lub genów.

Wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego Danio Rerio

Małe ryby laboratoryjne stały się popularnymi modelami do badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw zaburzeń kości u ludzi oraz do badań przesiewowych leków modulujących kości. W niniejszym raporcie opisano protokół oceny wpływu alendronianu na komórki kostne larw medaka ze zmianami osteoporotycznymi.

Leczenie farmakologiczne i obrazowanie in vivo interakcji osteoblast-osteoklast w modelu osteoporozy ryb Medaka

Niniejszy protokół opisuje procedurę oceny nasienia ryb za pomocą wspomaganych komputerowo urządzeń do analizy nasienia i chłodzenia. Oprogramowanie zapewnia szybką, dokładną i ilościową analizę jakości nasienia ryb na podstawie ruchliwości plemników, co może być przydatnym narzędziem w akwakulturze w celu poprawy sukcesu reprodukcyjnego.

Ocena nasienia ryb za pomocą oprogramowania i urządzeń chłodzących

Protokoły dojrzewania europejskiego węgorza i kriokonserwacji plemników zostały ulepszone w ciągu ostatnich lat. W tym artykule opisano najlepszy dostępny protokół wykorzystujący ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG) do indukowania dojrzewania i metanol jako krioprotektant.

Postępowanie z samcami węgorza europejskiego (Anguilla anguilla) i ich leczenie w celu dojrzewania hormonalnego i kriokonserwacji nasienia

Zapłodnienie in vitro jest powszechnie stosowaną techniką z różnymi organizmami modelowymi do utrzymania populacji laboratoryjnych i produkcji zsynchronizowanych zarodków do dalszych zastosowań. Tutaj przedstawiamy protokół, który implementuje tę technikę dla różnych populacji meksykańskiej ryby tetra, Astyanax mexicanus.

Pobieranie gamet i zapłodnienie in vitro Astyanax mexicanus

Artykuł opisuje szybki protokół gonadektomii i pobierania próbek krwi od małych ryb teleost, używając japońskiej medaki (Oryzias latipes) jako modelu, w celu zbadania roli sterydów płciowych w fizjologii zwierząt.

Zabiegi gonadektomii i pobierania krwi w małym modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Poznaj metody pobierania nasienia i analizę CASA u medaki japońskiej (Oryzias latipes). Techniki te umożliwiają badanie wpływu zanieczyszczeń na płodność samców w ekotoksykologii.

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Przeglądaj więcej filmów