Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)
October 6th, 2022
Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).
Technika ta umożliwia pobieranie próbek mleka z małego modelu ryby, japońskiej Madaki, oraz badanie jego jakości w spójny sposób. W szczególności pobieranie nasienia za pomocą masażu brzucha pozwala na wielokrotne pobieranie próbek na tej samej rybie, ponieważ takie podejście nie jest inwazyjne. Co więcej, technika ta może być stosowana do kriokonserwacji nasienia Madaka.
Jakość nasienia jest podstawowym wskaźnikiem sukcesu zapłodnienia, a zatem ważnym parametrem do analizy w badaniach nad ekologii i całością fizjologii produkcyjnej. Na początek przygotuj miękką gąbkę, krojąc ją tak, aby pasowała do szalki Petriego. Wytnij prostą linię na środku gąbki, która jest wystarczająco długa, aby utrzymać rybę brzuszną stroną do góry.
Po znieczuleniu ryby osusz brzuch ryby, delikatnie wycierając go ręcznikiem papierowym. Umieść rybę w korycie wilgotnej gąbki mocującej brzuszną stroną do góry, tak aby jej skrzela były wystawione na działanie roztworu znieczulającego zawartego w gąbce. Jeśli obszar wokół kloaki jest mokry, delikatnie osusz spód brzucha jednorazową chusteczką do chusteczek.
Pod mikroskopem preparacyjnym umieść mikropipetę z dołączoną rurką aspiratora do kloaki ryby. Teraz masuj brzuch ryby, delikatnie ściskając końcem gładkie kleszcze w ruchu rostralnym do ogonowego. W celu odzyskania ryby, wypuść ją z gąbki do wcześniej przygotowanej wody regeneracyjnej przed powrotem ryb do systemu akwariowego.
Przenieść zebrane mleczo do probówki zawierającej wstępnie podgrzany roztwór aktywujący i kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół za pomocą zespołu probówki aspiratora. Delikatnie homogenizować rozcieńczone plemniki, przesuwając probówki przed analizą. Po eutanazji ryba wysuszyć ją, jak pokazano wcześniej, i umieścić rybę pod mikroskopem preparacyjnym lewą boczną stroną skierowaną do góry.
Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych odetnij klapę grzbietowo od kloaki, a następnie w poprzek żeber do skrzeli, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Zlokalizuj jądra i odetnij nasadkę na obu końcach drobnymi kleszkami. Usunąć jądra i przenieść je do przygotowanej probówki zawierającej wstępnie podgrzany roztwór aktywujący.
Użyj kleszczy, aby kilkakrotnie zmiażdżyć jądra o bok probówki, aby uwolnić plemniki, co można uwidocznić po lekko mętnym wyglądzie roztworu. Aby rozpocząć analizę, otwórz oprogramowanie do analizy nasienia i wybierz moduł ruchliwości. Ustaw konfiguracje w oprogramowaniu dla wszystkich parametrów.
Umieść wstępnie podgrzane jednorazowe szkiełko z komorą liczącą o długości 20 mikrometrów pod mikroskopem na podgrzewanym stoliku, ustawionym na 27 stopni Celsjusza. Odpipetować próbkę do komory na szkiełku, aż się napełni, ale bez przepełnienia. Ostrożnie zetrzyj nadmiar próbek z wejścia do komory, aby zapobiec ruchowi dryftu komórek w roztworze.
Wybierz opcję Analizuj, aby przyjrzeć się próbce pod mikroskopem. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony i ponownie wybierz opcję Analizuj, aby zarejestrować plemniki w terenie. Przesuń szkiełko do nowego obszaru próbki w ramce i powtórz procedurę dla trzech do pięciu różnych pól widzenia, unikając pęcherzyków powietrza, mas komórkowych lub artefaktów.
Aby wyświetlić wyniki, wybierz wyniki i kliknij dwukrotnie pole, aby wyświetlić wizualizację pojedynczego pola lub ręcznie sprawdzić, czy nie ma błędnie oznaczonych lub nieśledzonych plemników. W razie potrzeby kliknij prawym przyciskiem myszy na poszczególne plemniki, aby ponownie oznaczyć ruchliwość. W niniejszym badaniu wykorzystano komputerową analizę nasienia do rejestracji różnych parametrów prędkości i ruchu.
Obliczane wartości obejmują wskaźnik prostoliniowości, wskaźnik liniowości i chybotanie. Osmolarność roztworów aktywacyjnych wpłynęła na ruchliwość plemników z sekcji jądra. Plemniki były nieruchome w wodzie akwariowej, ale ruchliwe w HBSS z wysoką i niską osmolarnością.
Jednak ruchliwość jest znacznie zmniejszona przy 36 mili osmolu na kilogram w porównaniu z roztworami o wyższej osmolalności. Na ruchliwość wpłynęła również metoda pobierania nasienia, w której plemniki są znacznie bardziej ruchliwe w metodzie rozwarstwiania jąder w porównaniu z masażem brzucha. Ponadto większy odsetek komórek był postępujący, a więcej komórek poruszało się średnio lub szybko.
Procentowa ruchliwość i postępowość są znacznie wyższe w plemnikach przechowywanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie, w porównaniu z przechowywaniem w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Warunki środowiskowe i mieszkaniowe również nieznacznie wpłynęły na ruchliwość plemników. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w ruchliwości plemników w plemnikach pobranych po i przed tarłem.
Samce trzymane bez samic przez miesiąc wykazywały wysoką ruchliwość, ale różnica była nieznaczna. W przypadku pobierania nasienia za pomocą masażu brzucha potrzebne jest szkolenie, aby nauczyć się prawidłowego nacisku i ruchu kleszczy oraz uniknąć zanieczyszczenia kałem. Technika ta będzie bardzo przydatna do zbadania, na przykład, wpływu różnych zanieczyszczeń na męską płodność w badaniach ekotoksykologicznych, gdzie Medaka jest powszechnie stosowanym modelem.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia dwie efektywne techniki pobierania spermy od małych ryb, gatunku modelowego medaka (Oryzias latipes). Omówione metody koncentrują się na masażu brzucha i sekcji jąder, wraz z protokołem oceny jakości spermy przy użyciu komputerowej analizy spermy (CASA).
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia rozrodu
- Ekotoksykologia
- Fizjologia ryb
Tło
- Medaka jest często stosowanym organizmem modelowym w badaniach nad płodnością.
- Jakość spermy jest kluczowa dla pomyślnej zapłodnienia.
- Metody nieinwazyjne są niezbędne do wielokrotnego pobierania próbek.
Stosowane metody
- Pobieranie spermy poprzez masaż brzucha i sekcja jąder
- Organizm modelowy: Medaka (Oryzias latipes)
- Komputerowa analiza spermy (CASA)
Główne wyniki
- Ruchliwość spermy znacząco różni się w zależności od stosowanej metody pobierania.
- Warunki środowiskowe wpływają na jakość spermy, choć niektóre czynniki nie miały istotnego wpływu.
- Wysokie poziomy ruchliwości zostały osiągnięte poprzez sekcje jąder w porównaniu z masażem brzucha.
Wnioski
- Badanie dostarcza niezawodnych metod pobierania spermy i oceny jej jakości u medaka.
- Te techniki mogą promować badania nad wpływem zanieczyszczeń na płodność męską.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of sperm quality in Japanese medaka enables objective evaluation of male fertility, supporting mechanistic studies in reproductive biology and ecotoxicology. Computer-assisted sperm analysis (CASA) provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in vertebrate fertility research. These capabilities facilitate predictive confidence and risk-adjusted decision-making in translational and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of environmental, physiological, and genetic factors affecting male fertility.
- Supports functional validation of reproductive targets through objective sperm quality metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating variables impacting motility and progressivity.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven fertility studies.
Screening & Assay Development
- Delivers validated protocols for sperm collection and analysis in small vertebrate models.
- Standardizes motility and progressivity measurements for assay reproducibility.
- Enables scalable, repeatable workflows for compound or environmental screening.
- Supports reliable evaluation of toxicological or pharmacological impacts on reproductive endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sperm quality metrics with disease-relevant and environmental exposure models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of reproductive toxicity or efficacy.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate interventions or environmental assessments.
- Strengthens predictive value for cross-species translational research in vertebrate fertility.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized sperm quality assessment in small fish models, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Objectively quantifies sperm motility, progressivity, and concentration to clarify reproductive pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for evaluating environmental or compound effects on fertility.
- Analytics: Generates velocity, linearity, and motility indices for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges environmental, physiological, and genetic studies to preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for fertility assessment in diverse small vertebrate models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of sperm analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in fertility and ecotoxicology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of reproductive and environmental research programs.
Implementation Considerations
- Requires training in non-invasive and dissection-based sperm collection techniques.
- Needs access to computer-assisted sperm analysis instrumentation and software.
- Demands cross-team standardization of sample handling and analysis parameters.
- Adaptable to other small teleost or vertebrate models with protocol optimization.
- Careful technique is necessary to avoid sample contamination and ensure data integrity.
