Name: Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj technikę izolacji przepływającej limfy krezkowej u myszy, umożliwiającą ilościowe określenie wchłaniania lipidów i wydzielania chylomikronu. Metoda pozwala na pomiar metabolizmu pokarmowego in vivo w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Fundacji Mukowiscydozy (Nagroda za Pilotaż i Wykonalność 1810, dla ABK), Fundacji Rainin (Nagroda Synergii, dla PI GJ Randolpha i Co-I ABK) oraz National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 dla ABK) za wsparcie tych badań.

Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Wewnętrzną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu [Protokół # 20047008] i są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57BL6/J w wieku 8-14 tygodni. Myszy uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Wszystkie myszy trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do standardowej karmy i wody.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>W zależności od projektu eksperymentalnego, nakarm myszy lub pozwól im pościć. 
	UWAGA: Nocny post nie jest konieczny, chyba że istnieją obawy dotyczące różnic w tempie opróżniania żołądka.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie 5% gazem izofluranowym i zapewnić prawidłowe znieczulenie przez uszczypnięcie ogona i palców u nóg. Po znieczuleniu utrzymuj myszy w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia za pomocą 2%-3% izofluranu i umieść je za pomocą taśmy na platformie chirurgicznej.</li>
	<li>Utrzymuj myszy w cieple na podgrzewanej platformie chirurgicznej, która wykorzystuje krążącą ciepłą wodę (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Chirurgia i projektowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Rozpocznij operację od nałożenia maści weterynaryjnej na oczy, ogolenia brzucha i nałożenia antyseptycznego peelingu chirurgicznego (patrz tabela materiałów) na miejsce operowane. Powoduje to sterylizację nacięcia i zmniejsza wytwarzanie się futra unoszącego się w powietrzu podczas nacięcia w linii środkowej.</li>
	<li>Utrzymuj sterylne miejsce pracy, używając sterylnych narzędzi, zasłon oraz innego potrzebnego sprzętu i materiałów.</li>
	<li>Wstrzyknąć pierwszą dawkę karprofenu (patrz tabela materiałów) w celu złagodzenia bólu (i.p.) w dawce 5 mg/kg.</li>
	<li>Chwyć skórę pęsetą i wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej małymi nożyczkami. Przeciąć w kierunku mostka (nigdy powyżej) i przyciąć do tłuszczu pachwinowego. Następnie przetnij warstwę mięśniową osobno za pomocą nożyczek. 
	UWAGA: Wysterylizuj cały sprzęt przed użyciem. </li>
	<li>Za pomocą retraktora odsuń wnętrzności otrzewnej na bok, aż przewód limfatyczny będzie widoczny.</li>
	<li>Za pomocą patyczka higienicznego nasączonego solą fizjologiczną (patrz Tabela materiałów), przesuń wątrobę w kierunku prawej górnej strony ciała, a jelita i żołądek po lewej stronie zwierzęcia.</li>
	<li>Rozciągnij dwunastnicę w kierunku lewej poprzecznie, aby odsłonić tętnicę krezkową górną i przewód limfatyczny jelita.</li>
	<li>Przygotuj rurkę kaniuli o długości 30-40 cm, wkładając igłę do rurki kaniuli (patrz Tabela materiałów) i przepłucz niewielką ilość heparyny (1,000 U/L) przez rurkę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Przepływ limfy jest wspomagany grawitacyjnie, aby spływać w dół i do probówek zbiorczych mikrowirówek na lodzie. W zależności od tego, gdzie znajduje się pojemnik na lód w sąsiedztwie zestawu chirurgicznego, może być konieczne dostosowanie długości rurki kaniuli.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby wyciąć skos na końcu rurki kaniuli.</li>
	<li>Wykonaj płytkie nacięcie nożyczkami do tęczówki (patrz Tabela materiałów) w przewodzie limfatycznym około 5 mm od jego pojawienia się w jelicie cienkim.</li>
	<li>Przytrzymaj rurkę kaniuli za pomocą cienkich kleszczyków i delikatnie włóż końcówkę do kanału. 
	UWAGA: Ważne jest, aby nie wciskać kaniuli zbyt głęboko w przewód, ponieważ może to uniemożliwić przepływ limfy, gdy cofnięte narządy zostaną przywrócone do swojej pierwotnej pozycji.</li>
	<li>Przewód limfatyczny jest zbyt delikatny na manipulacje związane z wiązaniem cewnika za pomocą szwu. Zamiast tego użyj kropli kleju cyjanoakrylowego (patrz Tabela materiałów), aby przykleić kaniulę limfatyczną do krezkowego przewodu chłonnego.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma mlecznej, białej limfy (jeśli przed operacją użyto zgłębnika z oliwy z oliwek) lub czystej limfy (jeśli myszy pościły przed operacją), która zaczyna natychmiast przepływać przez kaniulę przetoki limfatycznej. 
	UWAGA: Sprawdź, czy kaniula limfatyczna została pomyślnie umieszczona i czy limfa płynie; Kontynuuj zakładanie kaniuli do dwunastnicy.</li>
	<li>Za pomocą igły 18 G nakłuć otwór w okolicy odźwiernika żołądka za zwieraczem odźwiernika.</li>
	<li>Wprowadzić rurkę do infuzji dwunastnicy (patrz Tabela materiałów) przez ten otwór w żołądku do około 1-2 mm poza zwieracz odźwiernika do dwunastnicy.</li>
	<li>Zabezpiecz podwiązką ze sznurka do torebki za pomocą jedwabnego szwu 5-0 (patrz Tabela Materiałów) za pomocą igły do żołądka i uszczelnij kroplą kleju cyjanoakrylowego, aby zapobiec wyciekom.</li>
	<li>Rozpocznij infuzję dodwunastniczą 5% glukozy-0,9% soli fizjologicznej w stężeniu 0,3 ml/h, 
	UWAGA: W przypadku korzystania z myszy o niewielkich różnicach masy ciała, które ważą około 25 g (~8 tygodni w wieku), odpowiedni jest wlew glukozy/soli fizjologicznej w ilości 0,3 ml / h. Jeśli myszy są znacznie większe, szybkość infuzji należy dostosować w górę, aby uwzględnić zmianę masy ciała i objętości krwi.</li>
	<li>Wymień narządy w jamie ciała i zszyj (5-0) osobno tkanki mięśniowe i skórne. 
	UWAGA: Kaniula limfatyczna i rurka do karmienia dodwunastnicy są zewnętrzne przez to samo nacięcie. Nie ma precedensu w oddzielaniu rurek szwem i nie ma preferencji co do kąta eksterioryzacji rurek.</li>
	<li>Po zabiegu, ale przed odstawieniem środka znieczulającego, delikatnie umieść myszy w ograniczeniach Snuggle (patrz Tabela materiałów), aby ograniczyć ruchliwość. 
	UWAGA: Ograniczniki przytuśniania uniemożliwiają myszom chwytanie lub obracanie głowy w celu żucia szwów i rurek. </li>
	<li>Następnie umieść myszy w przezroczystym pudełku z pleksiglasu na rotatorze z delikatnym kołysaniem i ogrzej je za pomocą dostępnej w handlu poduszki grzewczej dla/o kontrolowanej temperaturze, przyklejonej z boku skrzynki zabezpieczającej. Zapewnić nawilżanie również w postaci sterylnych pojemników na wodę dejonizowaną w rogach skrzynki zabezpieczającej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Po 30 minutach przed odstawieniem izofluranu należy podać myszom drugą dawkę przeciwbólową (Buprenex, 0,1 mg/kg mc., i.p.).</li>
	<li>W zależności od eksperymentu, należy zapewnić myszom ciągły wlew dodwunastniczy 5% glukozy-0,9% soli fizjologicznej w tempie 0,3 ml/h przez 1 h, 
	UWAGA: 5% roztwór glukozy-0,9% soli fizjologicznej przygotowuje się przy użyciu sterylnego worka z solą fizjologiczną (do stosowania u ludzi, pH 7,4) z apteki i sterylnej butelki do stosowania u ludzi z 50% dekstrozą, zgodnie ze ścisłymi wytycznymi dotyczącymi sterylności. Roztwór musi być świeży i wyrzucony, jeśli minęła data ważności podana na woreczku z solą fizjologiczną lub na butelce z dekstrozą.</li>
	<li>Podawać myszom jeden z lipidów wymienionych w Tabeli 1 jako lipid doświadczalny przez kaniulę dodwunastniczą (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Dla wszystkich danych pokazanych w Rysunek 1, SMOFlipid (20% emulsja lipidowa do wstrzykiwań, USP, patrz tabela materiałów) był podawany dodwunastnicznie. Ten wlew, zarówno przed, jak i po bolusie lipidowym dodwunastnicy, zastępuje utracony płyn drenujący przez przewód limfatyczny i jest bezwzględnym wymogiem. Myszy są teraz gotowe do podania eksperymentalnej dawki lipidów.</li>
	<li>Wykonać klasyczną infuzję lipidową z 0,3 ml bolusa emulsji lipidowej (SMOFlipid 20% lipidowa emulsja do wstrzykiwań, USP) przez rurkę do infuzji dodwunastnicy (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu w bolusie lipidów dodwunastniczych należy zmienić infuzję z powrotem na 5% glukozy-0,9% soli fizjologicznej w dawce 0,3 ml/h w sposób ciągły do końca eksperymentu.</li>
	<li>Próbki limfy należy zebrać do wstępnie zważonych probówek do mikrowirówek przez 60 minut i utrzymywać limfę na lodzie. Zważ probówki po raz drugi, aby ustalić masę limfy, która jest wydzielana co 60 minut. 
	UWAGA: Spodziewaj się zebrać około 50-300 μl limfy na godzinę na mysz w ciągu ~ 6 godzin po 0,3 ml bolusa lipidowego.</li>
	<li>Limfa może płynąć do 6 godzin po wlewie lipidowym. W 6 godzinach należy poddać myszy eutanazji za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy. 
	UWAGA: Chirurg i/lub technik laboratoryjny powinni być obecni w celu monitorowania zwierząt przez cały czas trwania eksperymentu. Podczas obserwacji zwróć uwagę na skrzepy w drenażu limfatycznym i zmiany w zachowaniu zwierząt, które wskazują na ból/niepokój. Jeśli przewód limfatyczny zostanie zatkany w dowolnym momencie eksperymentu, eksperyment zostaje zakończony, a zwierzę zostaje poddane eutanazji. Technicznie rzecz biorąc, zwierzę może być utrzymywane przy życiu do 24 godzin po operacji (zgodnie z zasadami IACUC dotyczącymi operacji przeżycia). Jednak wskaźniki przeżycia zmniejszają się z czasem, a 6 godzin to powtarzalny okres przeżycia, w którym wchłanianie lipidów nadal naśladuje fizjologię in vivo, a zwierzę nie walczy o przeżycie. </li>
	<li>Wykonać pobranie tkanek końcowych po eutanazji (krok 3.1). 
	UWAGA: Różnica w profilach wchłaniania lipidów w diecie u myszy trzymanych przez 6 godzin lub 24 godziny po operacji została niedawno przetestowana44. Odkryliśmy, że 24-godzinna procedura zmniejsza wskaźniki przeżywalności zwierząt i skok lipidów z diety do limfy. Z tych powodów zdecydowanie zalecamy podejście 6-godzinne. Ta zaktualizowana konstrukcja chirurgiczna zmniejsza niepotrzebną śmierć zwierząt i potencjalne cierpienie zwierząt w okresie pooperacyjnym. Wspiera to główny cel Amerykańskiego Stowarzyszenia Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, którym jest "Wymiana, Redukcja, Udoskonalenie" zwierząt [ref PMID: 21595115].</li>
</ol>
3. Zbieranie zawartości światła i tkanki śluzówkowej
<ol>
	<li>Pod koniec 6-godzinnego okresu infuzji lipidów należy złożyć myszy w ofierze za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy. Zawiąż oba końce żołądka, jelita cienkiego i jelita ślepego szwami 5-0, aby uniknąć wycieku zawartości światła.</li>
	<li>Zbierz żołądek, jelito ślepe i okrężnicę i umieść je w szklanej probówce o pojemności 15 ml. Podziel jelito cienkie na trzy lub cztery segmenty i zbierz zawartość światła, spłukując tkankę w 2-3 ml zimnego PBS po rozcięciu wzdłużnym.</li>
	<li>Usuń błonę śluzową jelit zawierającą komórki nabłonka i związaną z nimi blaszkę właściwą z warstwy mięśniowej, zeskrobując każdy fragment w 2-3 ml zimnego PBS za pomocą zakrzywionej pęsety.</li>
	<li>Umieść wszystkie tkanki, izolaty światła i błony śluzowej oraz warstwę mięśniową w szklanych probówkach i dodaj 8 ml CHCl3:MeOH 2:1 obj. / obj. do każdej probówki.</li>
	<li>Określić radioaktywność i/lub stężenia lipidów za pomocą zliczania scyntylacyjnego cieczy i/lub zestawu do oznaczania triglicerydów (patrz tabela materiałów) po ekstrakcji Folch45.</li>
</ol>
4. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
<ol>
	<li>Ekstrakcja całkowitej ilości lipidów izolatów luminalnych i śluzówkowych za pomocą zmodyfikowanej ekstrakcji Folch45.</li>
	<li>Wysuszyć wyekstrahowane lipidy w rozpuszczalniku pod parownikiem azotu, a następnie ponownie zawiesić je w stosunku 2:1 obj./obj. CHCl3:MeOH przed załadowaniem ich na płytkę z żelu krzemionkowego TLC (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Oddzielić lipidy za pomocą układu rozpuszczalnikowego składającego się z eteru naftowego, eteru etylowego i lodowatego kwasu octowego (25:5:1 obj./obj.). Użyj oparów jodu do wizualizacji różnych lipidów, w tym wzorców.</li>
	<li>Zeskrobać plamki na płytce TLC odpowiadające monoglicerydom/fosfolipidom, diglicerydom, kwasom tłuszczowym, triglicerydom i estrom cholesterolu do indywidualnych fiolek scyntylacyjnych przed dodaniem 4 ml płynu scyntylacyjnego (patrz tabela materiałów) w celu zliczenia scyntylacyjnego.</li>
	<li>Wyrazić dane jako procent całkowitej dawki lipidów w bolusie lub jako ułamek całkowitej dawki lipidów wykrytych dla każdej próbki.</li>
</ol>
5. Izolacja i charakterystyka Chylomicron
<ol>
	<li>Przenieść połączone próbki limfy z 6-godzinnego bolusa po podaniu lipidów (krok 2.29) do probówek ultrawirówek, wymieszać z 0,9% NaCl (300-500 μL), a następnie ostrożnie nałożyć odpowiednią objętość 0,87% NaCl (300-500 μL).
	<ol>
		<li>Ultraodwirować (patrz tabela materiałów) próbki w temperaturze 110 000 x g w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Zebrać górną frakcję zawierającą wyizolowane chylomikrony i przenieść je do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ stężenia triglicerydów chylomikronu, cholesterolu i apoB, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Oznaczyć stężenia trójglicerydów i cholesterolu za pomocą zestawu do oznaczania triglicerydów i cholesterolu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Krótko inkubować 2 μl próbek z 200 μl odczynnika enzymatycznego w temperaturze 37 °C przez 5 minut na 96-dołkowej płytce. Odczytać tabliczkę za pomocą czytnika płytek przy długości fali 500 nm dla trójglicerydów i 600 nm dla cholesterolu. 
		UWAGA: Do obliczenia stężeń użyto wzorców i ślepych prób. Stężenia ApoB oznaczono za pomocą zestawu ELISA Mouse ApoB (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ wielkość cząstek chylomikronu.
	<ol>
		<li>Do obrazowania TEM należy użyć świeżych próbek chylomikronu o stężeniu trójglicerydów około 40 mg/dl. Na krótko umieścić 5-10 μl każdej próbki na siatce TEM i wysuszyć.</li>
		<li>Zbadaj siatkę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego i uchwyć obrazy. Zmierz rozmiary cząstek lipoprotein i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oryginalna procedura 2-dniowej przetoki limfatycznej została opisana przez Bollmana i wsp.25 i praktykowana przez laboratorium Patricka Tso przez ostatnie 45 lat26,27. Przedstawiony tutaj protokół jest potężnym dodatkiem do tej klasycznej, złotej metody identyfikacji, kwantyfikacji i zrozumienia unikalnej wydzieliny jelita cienkiego, a także dynamiki in vivo wchłaniania i metabolizmu składników odżywczych w diecie, hormonów jelitowych i odporności jelitowej.
Zalety tego modelu obejmują (1) możliwość ciągłego pobierania próbek limfy krezkowej przez cały okres karmienia i poposiłkowy, a nie statyczne pobieranie próbek w jednym punkcie czasowym podczas wchłaniania, trawienia lub wydzielania; (2) pomiar hormonów jelitowych i cytokin bezpośrednio w ich fizjologicznym kompartmencie, a nie we krwi, gdzie są one rozcieńczane i rozkładane enzymatycznie17,44; (3) zdolność do izolacji, oceny ilościowej i charakterystyki lipoprotein wydzielanych przez jelito cienkie po spożyciu posiłku lipidowego oraz brak lipaz śródbłonkowych w limfie krezkowej, która zachowuje stężenia triglicerydów chylomikronu i natywną strukturę chylomikronu 46,47; (4) Możliwość bezpośredniego pomiaru natężenia przepływu limfy, produkcji trójglicerydów i cholesterolu (lub innych związków z dwunastnicą), składu chylomikronu i stężeń hormonów jelitowych. Wreszcie, protokół ten pozwala na pobieranie stosunkowo dużych ilości >50 μl limfy co godzinę przez okres 6 godzin. Ponieważ płyn jest uzupełniany solą fizjologiczną do dwunastnicy i wlewem glukozy, model przetoki limfatycznej jest znacznie lepszy w porównaniu z innymi technikami pobierania limfy i skutkuje płynnymi, a nie statycznymi pulami limfy krezkowej. Ponieważ objętość jest główną przeszkodą dla podejść lipidomicznych, proteomicznych i metabolomicznych, jest to główna zaleta.
Opisany tutaj protokół 1-dniowej przetoki limfatycznej myszy ma kilka zalet w porównaniu z oryginalnym protokołem przetoki limfatycznej, w tym zmniejszenie całkowitej liczby zwierząt doświadczalnych w porównaniu z wcześniej opisanymi protokołami 2-dniowych przetok limfatycznych26,27 ze względu na wyższy wskaźnik przeżycia po operacji; skrócenie całkowitego czasu trwania eksperymentu z 2 dni do jednego dnia; I wreszcie, skrócenie okresu rekonwalescencji u myszy z nocy (>18 godzin), gdzie może wystąpić ból przebijający lub słabe wyniki pooperacyjne, do łatwiejszego do opanowania ~6 godzin okresu po operacji.
Cechą tego 1-dniowego protokołu jest skupienie się na względach humanitarnych i punktach końcowych. Muszą one mieć najwyższy priorytet: (1) zwierzęta muszą otrzymywać płyny dodwunastnicze lub dożylne płyny zastępcze; (2) muszą być utrzymywane w cieple i możliwie jak najmniej bolesne (pooperacyjnym lekiem Buprenex i/lub karprofenem, w zależności od projektu doświadczenia i potrzeby uniknięcia działania przeciwzapalnego); (3) Krwawienie, drżenie, biegunka lub oznaki niepokoju są istotnymi powodami dla humanitarnego punktu końcowego. Zgodnie ze ścisłymi wytycznymi IACUC, dobrym punktem końcowym jest izofluran, po którym następuje zwichnięcie szyjki macicy. Wskaźniki przeżycia chirurgicznego wynoszą ~70% w ciągu jednego dnia (w porównaniu do ~40% w przypadku oryginalnej operacji 2-dniowej), ale badacze nie powinni wahać się zakończyć eksperymentu przy oznakach niepokoju. Należy to wziąć pod uwagę przy planowaniu liczby zwierząt.
Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów z tą techniką, pomyślne umieszczenie kaniuli limfatycznej jest głównym wąskim gardłem w tej procedurze chirurgicznej. Podczas ćwiczenia zabiegu pomaga nabrać myszy 0,3 ml oliwy z oliwek na około 2 godziny przed zabiegiem. Spowoduje to wydzielanie chylomikronów do krezkowego przewodu chłonnego, dzięki czemu będzie on wyglądał na "mleczny" i bardziej widoczny. Można również stosować błękit metylenowy, ale często jest on mniej widoczny niż mleczny przewód limfatyczny. Jeśli po umieszczeniu kaniuli limfatycznej i umieszczeniu jej za pomocą kleju limfa krezkowa pomyślnie przepływa przez kaniulę do naczynia zbiorczego, można przystąpić do zakładania rurki do infuzji dwunastnicy. Czasami limfa może nie płynąć w sposób ciągły, ale może zacząć ponownie płynąć, gdy zwierzę zostanie umieszczone na stole obrotowym. Krytycznie należy uważać na skrzepy w rurkach limfatycznych. Należy je wymasować z rurek, aby zapobiec ciśnieniu zwrotnemu na przewód limfatyczny.
Oprócz wydzielania trójglicerydów i szybkości przepływu limfy, technikę tę można wykorzystać do określenia następującej kinetyki wchłaniania lipidów i charakterystyki chylomikronu:
Wydzielanie Chylomicron 45,48,49 Bezpośrednio po posiłku zawierającym tłuszcz następuje przejściowy wzrost krążących trójglicerydów w osoczu. Ponieważ trójglicerydy są z natury hydrofobowe, muszą najpierw zostać zemulgowane, aby były rozpuszczalne we krwi50. Enterocyty jelita cienkiego pełnią tę rolę i pakują dietetyczne trójglicerydy w cząstki emulsji chylomicron51. Chylomikrony zawierają cholesterol i trójglicerydy dietetyczne w swoim rdzeniu, otoczone fosfolipidami i apolipoproteinami, w tym apoB-48, apoA-I, apoA-IV i apoC-III 52,53,54,55. ApoB-48 jest niezbędnym białkiem strukturalnym, a inne apolipoproteiny pełnią różne funkcje wymagane do metabolizmu chylomikronu i klirensu z krwi. Aby określić kluczowe cechy chylomikronów, w tym zawartość trójglicerydów i apolipoprotein, należy zastosować przedstawioną tutaj technikę 1-dniowej przetoki limfatycznej. Szybkość wydzielania chylomikronu to procent3-triglicerydów H, które są wydzielane do limfy i mierzone przez scyntylację przez liczenie próbek limfy co godzinę. Można to połączyć ze szczegółową charakterystyką chylomikronu 48,49,56,57,58. Godzinowe próbki limfy mogą być łączone lub przechowywane oddzielnie. Limfę przenosi się do probówek ultrawirówek, miesza z 0,9% NaCl, a następnie ostrożnie nakłada 300-500 μl 0,87% NaCl. Próbki są następnie ultraodwirowywane w temperaturze 110 000 x g w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Górne frakcje zawierające wyizolowane chylomikrony są zbierane i badane pod kątem stężeń triglicerydów przy użyciu zestawu do oznaczania triglicerydów. Krótko mówiąc, 2 μl chylomikronu (rozcieńczenie 1:10) inkubuje się z 200 μl odczynnika enzymatycznego w temperaturze pokojowej przez 10 minut na 96-dołkowej płytce. Płytka jest odczytywana przez czytnik płytek przy długości fali 500 nm, a wzorce i ślepe próby służą do obliczania stężeń triglicerydów. Wielkość Chylomicron można następnie określić za pomocą barwienia ujemnego i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)14,29. Trójglicerydy i cholesterol można określić ilościowo za pomocą testu chemicznego i zawartości apolipoprotein (apoB-48, A-I, C-II, C-III) za pomocą zestawów ELISA lub Western blot.
Oznaczanie pierwotnego miejsca wchłaniania lipidów 48,59 Izolując przedziały komórek światła i nabłonka dwunastnicy, jelita czczego i jelita krętego po 6 godzinach od infuzji 3H-triglicerydów lub znakowanej radioizotopowo mieszanej mączki, zawartość jest ekstrahowana metodą Folch w celu określenia, ile 3H-triglicerydów jest wchłanianych przez błonę komórkową nabłonka (normalne) lub zatrzymywane w świetle (nieprawidłowe) na całej długości jelita cienkiego48. Badania te są szczególnie istotne, jeśli istnieją potencjalne różnice w ruchliwości przewodu pokarmowego 60,61,62, jeśli istnieje hipoteza dotycząca kwasów żółciowych (wysoce aktywnych podczas wchłaniania lipidów i ponownie wchłanianych w jelicie krętym)63,64,65,66 lub jeśli istnieje obawa, że składniki odżywcze są wchłaniane w niewłaściwym miejscu anatomicznym (jelito kręte lub nawet okrężnica)67,68,69,70.
Identyfikacja mechanizmów transportu 3H-triglicerydów do absorpcyjnych komórek nabłonka48 Odbywa się to poprzez obliczenie procentu 3-triglicerydów H-hydrolizowanych do 3wolnych kwasów tłuszczowych H w świetle jelita, wchłanianych do błony śluzowej i ponownie estryfikowanych do wewnątrzkomórkowego 3-trójglicerydu 3H przed wydzieleniem jako chylomikrony. Jest to silny marker defektów wchłaniania/wydzielania, ponieważ można go prześledzić, aby pokazać ruch dietetycznych trójglicerydów do produktów ich rozpadu, a następnie pakowanie w chylomikrony. Ekspresję mRNA maszynerii absorpcji kwasów tłuszczowych (CD36, FABP, ACSL), szlaku reestryfikacji (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) i apolipoprotein (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) można dalej oznaczać ilościowo za pomocą RT-PCR.
Przyszłe zastosowania tej techniki są ograniczone jedynie zainteresowaniem przesłuchami między jelitami a narządami, metabolizmem, odpornością, wchłanianiem składników odżywczych, zanieczyszczeniami środowiskowymi w diecie lub jakąkolwiek inną chorobą odgrywającą rolę w układzie pokarmowym. Jest prawdopodobne, że wiele przekonujących eksperymentów i hipotez zostało wstrzymanych z powodu trudności w dostępie do krytycznego układu limfatycznego krezki, a celem tego wizualizowanego protokołu jest ułatwienie dostępu do tej techniki. Wyizolowanie chylomikronów i limfy krezkowej, w której początkowo się znajdują, jest kluczowym elementem zrozumienia metabolizmu całego organizmu; 1-dniowy model przetoki limfatycznej myszy jest potężnym modelem fizjologicznym do badania tych zdarzeń.

Fizjologiczne znaczenie krezkowego układu limfatycznego 
Limfa krezkowa została opisana w jakiejś formie od ~300 r. p.n.e., kiedy Herofilos opisał system wrotny wątroby i wszystkie "żyły absorpcyjne w jelitach"1,2,3,4,5. Przez ponad 1700 lat po tym początkowym opisie, cechą charakterystyczną limfy jelitowej była obecność mlecznego płynu w limfie krezkowej krótko po posiłku3. Obecnie wiadomo, że mleczna limfa zawierająca chylomikron (limfa "chylous") nie spływa do żyły wrotnej i wątroby, ale zamiast tego przemieszcza się przez cisterna chyli do przewodu piersiowego i ostatecznie łączy się z krwią w lewej żyle podobojczykowej6. Ze względu na ten anatomiczny układ limfa chylous najpierw przemieszcza się przez serce i płuca, zanim zacznie krążyć po reszcie ciała. Oznacza to, że serce i płuca otrzymują "pierwsze przejście" przez wydzieliny do krezki limfy7.
Główną rolą limfów krezkowych jest transport lipidów z jelita cienkiego z diety8,9,10. Anatomicznie, chylomikrony, jelitowe komórki odpornościowe11,12,13,14, hormony jelitowe15,16,17,18, antygeny19,20,21, niechylomikronowe związki lipofilowe22,23, a nadmiar płynu dostaje się do mleka leżącego poniżej błony podstawnej enterocytów, a następnie jest zagęszczany przez naczynia włosowate limfatyczne do krezkowych węzłów chłonnych. Prawdopodobnie istnieje wiele nieznanych składników limfatycznych krezki, w tym metabolity, antygeny, zanieczyszczenia środowiska, składniki odżywcze i cząsteczki sygnałowe.
Składniki limfy krezkowej nie były systematycznie identyfikowane, głównie z powodu trudności w wyizolowaniu limfy krezkowej. Dostęp do limfy krezkowej zawsze był poważnym wyzwaniem, ponieważ przewody limfatyczne są bezbarwne i z wyjątkiem tłustego posiłku, kiedy stają się tłuste i mleczne, limfy krezkowe zawierają bezbarwny płyn limfatyczny6,8,9,10.
Obecne i powszechne metody izolacji limfy jelitowej 
Dostęp do limfy krezkowej u ludzi nie jest możliwy (z wyjątkiem rzadkich i ekstremalnych okoliczności, w których doszło do poważnego urazu przewodu pokarmowego)24. Pobieranie limfy in vivo jest chirurgicznie skomplikowane i wymagające. Oryginalna procedura 2-dniowej przetoki limfatycznej została opisana przez Bollmana i wsp.25 i została ulepszona i sprofesjonalizowana przez laboratorium Patricka Tso przez ostatnie 45 lat26,27. Zabieg przetoki limfatycznej pozwala badaczom na pobranie płynącej limfy od przytomnych zwierząt podczas 6-godzinnego okresu infuzji lipidów z dwunastnicy.
Model przetoki limfatycznej był głównie używany u szczurów do pomiaru szybkości przepływu limfy, produkcji trójglicerydów i cholesterolu (lub innych związków z dwunastnicą), składu chylomikronu i stężenia hormonów jelitowych. W mniejszym stopniu technika ta może być również stosowana u myszy, chociaż cierpi na tym przeżycie chirurgiczne i objętość limfy. Ze względu na trudności w widzeniu krezkowych przewodów chłonnych, historyczne metody obejmowały kaniulowanie limfy krezkowej u większych zwierząt, takich jak mini-pigs28, sheep29, pigs30, dogs31 i rats17. Praca z tymi większymi modelami wymaga dużych zasobów i nie pozwala na badania w modelach knock-in lub knock-out.
Alternatywne podejścia również zostały użyte. Chylomikrony można wyizolować z krwi w stanie poposiłkowym (choć będą one częściowo hydrolizowane przez lipazę lipoproteinową osocza)32,33,34,35. Przewód piersiowy może być również kaniulowany, chociaż zebrana tam limfa zawiera domieszkę limfy krezkowej i drenaż limfy zewnątrzjelitowej26,36. In vitro komórki Caco-2 wydzielają cząsteczkę podobną do chylomikronu w odpowiedzi na leczenie kwasami tłuszczowymi, a komórki te mogą być hodowane wspólnie z odpowiednimi komórkami śródbłonka limfatycznego lub naczyń krwionośnych37,38. Wykazano, że hodowle organoidów jelitowych ludzi i myszy przetwarzają lipidy wierzchołkowe i wydzielają chylomikrony39,40,41,42. Modele te są bardzo korzystne i umożliwiają mechanistyczny wgląd w fizjologię jelita cienkiego, ale nie są w stanie odtworzyć złożoności, gradientów fizykochemicznych ani dynamicznego przepływu limfy krezkowej in situ.
Zalety modelu przetoki limfatycznej myszy na 1 dzień prezentowany tutaj 
W odniesieniu do tych innych metod izolowania lipoprotein jelitowych, technika przetoki limfatycznej Tso Lab jest tradycyjnie uważana za złoty standard pomiaru wchłaniania składników odżywczych w diecie do limfy krezkowej. Ta technika in vivo ma tę zaletę, że pozwala uchwycić kluczowe fizjologiczne aspekty wchłaniania lipidów w diecie - dynamiczne pojawianie się związków w okresie wchłaniania, co wymaga wielokrotnego pobierania próbek przepływającej limfy krezkowej u żywych zwierząt ze składnikami odżywczymi dwunastnicy. Ta technika chirurgiczna mierzy również hormony jelitowe i cytokiny bezpośrednio w ich fizjologicznym kompartmencie, a nie we krwi, gdzie są rozcieńczane i enzymatycznie degradowane17,43.
Jeśli pytanie eksperymentalne wymaga zrozumienia dynamiki wydzielania lipidów lub dynamicznej absorpcji i metabolizmu jakiegokolwiek hydrofobowego związku GI lub leku, to ta technika jest nie tylko odpowiednia, ale jest również jedynym podejściem, które interpoluje ruch zawartości światła od bliższego do dystalnego jelita (żołądek do okrężnicy) i od powierzchni wierzchołkowej do podstawno-bocznej (zawartość światła przez enterocyty do mleczonów i krążenia wrotnego). Ponieważ technika ta wykorzystuje dostarczanie składników odżywczych w świetle przez cewnik dodwunastniczy, a płynąca limfa krezkowa jest kierowana i zbierana, cały aparat absorpcyjny jest pod kontrolą eksperymentalną i może być wykorzystany do jakościowej oceny profili wchłaniania w jelicie cienkim.
Prezentowany tutaj wizualnie po raz pierwszy jest duża aktualizacja modelu przetoki limfatycznej Tso Lab, która (1) skraca czas eksperymentu do 1-dniowego okresu implantacji chirurgicznej i eksperymentalnego pobierania danych; (2) poprawia przeżywalność myszy i względy dobrostanu zwierząt; oraz (3) zwiększa powtarzalność podejścia u myszy w celu wykorzystania mocy mysich modeli genetycznych. Technika ta musi być uważana za złoty standard dla wszystkich eksperymentalnych pytań dotyczących wydzielin jelitowych, lipoprotein lub wchłaniania lipidów w diecie i jest najlepszą techniką do precyzyjnego określania kinetyki wchłaniania lipidów i chylomikronów.

<table><tbody><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, USP&nbsp; sterylny</td><td>Hospira, Lake Forest, IL, US</td><td>NDC 0409-4888-06</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml probówki Eppendorf</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>7200184</td><td></td></tr><tr><td>14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0,1mCi/ mL)</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US</td><td>ARC 0857</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td> <td>18 GBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>2 kleszcze do mikropreparacji Dumont</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, US</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>2 Kleszcze</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>3H-TAG:&nbsp; Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL)</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US</td><td>ART0199</td><td></td></tr><tr><td>3H-TG Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG)</td><td>American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>50% Dextrode Injection, USP 25gram/50 mL&nbsp; sterylne</td><td>Hospira, Lake Forest, IL, US</td><td>NDC-0409-6648-16</td><td></td></tr><tr><td>Analtech TLC Uniplates: matryca z żelu krzemionkowego Z265500-1PAK</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>11-101-0007</td><td></td></tr><tr><td>Swasztag BD CareFusion ChloraPrep</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>14-910-501</td><td></td></tr><tr><td>Peeling chirurgiczny Betadine</td><td>Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula</td> <td>skośnaBraintree Naukowe.,&nbsp; Braintree , MA, US</td><td>MRE025</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina HCl do wstrzykiwań Carpuject PFS 0,3 mg / ml 10 / Bx (Buprenex)</td> <td>HenrySchein, Warrendale, PA, USA</td><td>1278184</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6 / J samce myszy</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChloraPrep</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US</td><td>260100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania cholesterolu</td><td>FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td>99902601</tr><tr><td>Cholesterol-[4-14C]</td><td>American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste pudełko z pleksi dł. 43 cm x szer. 26 x wys. 21 z poduszką grzewczą o kontrolowanej temperaturze i nawilżaniem</td><td></td><td></td><td>nasz własny projekt i modyfikacje</td></tr><tr><td>dostępne na rynku&nbsp; Poduszka grzewcza dla/</td><td>ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, Chiny</td><td>XHC-F035D</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>22363156</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do infuzji dwunastnicy - canuala</td><td>Braintree Scientific, Braintree , MA, US</td><td>MRE037</td><td></td></tr><tr><td>Ensure</td><td>Abbott Nutrition, Columbus, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma chirurgiczna z pompą cyrkulacyjną ciepłej wody</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, US</td><td>Gaymar T/ Pompa Klasyczny</td><td></td></tr><tr><td>wstrzykiwanie hetaryny sodu, USP 1,000 jednostek/ml sterylny</td><td>Mylan, Morgantown, WV, US</td><td>NDC-67457-384-31</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>National Institute of Health, Bethesda, Maryland,</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do indukcji izofluranu i aparat anestezjologiczny</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, amerykańska</td><td>komora</td><td></td>indukcyjna dla myszy</tr><tr><td>Klej Krazy</td><td>Produkty firmy Elmer's Inc., Columbus, OH, USA</td><td>KG484</td><td></td></tr><tr><td>Liposyn III 20% lipidów do wstrzykiwań</td><td>Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 Wielofunkcyjny licznik scyntylacyjny</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Mysz apoB ELISA Kit</td><td>ABCAM Inc., Waltham, MA, US</td><td>ab230932-1</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, US</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Retraktory</td><td>Kent Scientific Co., Torrington, CT, US</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofen)</td><td>Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US</td><td>4019449</td><td></td></tr><tr><td>Stół obrotowy Barnstead Thermolyne</td><td>Labquake, Z&uuml; bogaty, Szwajcaria</td><td>Barnstead Thermolyne</td><td></td></tr><tr><td>SMOFlipid 20% lipidowa emulsja do wstrzykiwań, USP</td><td>Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US</td><td>NDC-63323-820-01</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'&Icirc; le-Perrot, QC J7V 7M4, Kanada</td><td>MS 02.5PM</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Szew (jedwab 5-0 z igłą)</td> <td>DemeTECH, Miami Lakes, FL, US</td><td>DT-719</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy (JEOL 1400-FLASH 120KV)</td> <td>JEOL, Peabody, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania trójglicerydów</td><td>Randox Laboratories, Crumlin, Wielka Brytania</td><td>TR210</td><td></td></tr><tr><td>ULTIMA GOLD XR Płyn scyntylacyjny</td><td>Perkin Elmer, Hebron, KY, USA</td><td>6013119</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka, wirnik S100AT4-497</td><td>SORVALL RC M120 GX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

Lipoproteiny jelitowe, zwłaszcza chylomikrony bogate w trójglicerydy, są głównym motorem metabolizmu, stanów zapalnych i chorób sercowo-naczyniowych. Jednak wyizolowanie lipoprotein jelitowych jest bardzo trudne in vivo, ponieważ są one najpierw wydzielane z jelita cienkiego do limfy krezkowej. Limfa zawierająca chylomikron jest następnie opróżniana do żyły podobojczykowej z przewodu piersiowego, aby dostarczyć składniki posiłku do serca, płuc i ostatecznie do krążenia w całym ciele. Wyizolowanie naiwnych chylomikronów z krwi jest niemożliwe, ponieważ trójgliceryd chylomikronu ulega hydrolizie natychmiast po interakcji z lipazą lipoproteinową i innymi receptorami lipoprotein w krążeniu. Dlatego oryginalna 2-dniowa procedura przetoki limfatycznej, opisana przez Bollmana i wsp. u szczurów, była historycznie stosowana do izolowania świeżej limfy krezkowej przed jej wejściem do żyły piersiowej. Protokół ten został ulepszony i sprofesjonalizowany przez laboratorium Patricka Tso przez ostatnie 45 lat, co pozwala na analizę tych krytycznych lipoprotein i wydzielin z jelit. Procedura przetoki limfatycznej Tso została teraz zaktualizowana i po raz pierwszy została tutaj przedstawiona wizualnie. Ta zmieniona procedura jest jednodniową techniką chirurgiczną polegającą na zainstalowaniu sondy do karmienia dwunastnicy, kaniulacji kanału limfatycznego krezki i zbieraniu limfy po posiłku u przytomnych myszy. Do głównych korzyści płynących z tych nowych technik należą: zdolność do powtarzalnego pobierania limfy od myszy (co wykorzystuje moc genetycznych modeli myszy); skrócony czas znieczulenia u myszy podczas implantacji rurki infuzyjnej dwunastnicy i kaniuli limfatycznej; zdolność do ciągłego pobierania próbek limfy przez cały okres karmienia i poposiłkowy; zdolność do ilościowego pomiaru hormonów i cytokin przed ich rozcieńczeniem i hydrolizą enzymatyczną we krwi; oraz zdolność do zbierania dużych ilości limfy w celu izolowania lipoprotein jelitowych. Technika ta jest potężnym narzędziem do bezpośredniego i ilościowego pomiaru wchłaniania składników odżywczych w diecie, syntezy lipoprotein jelitowych i wydzielania chylomikronu.

Rysunek 2 przedstawia wydzielanie trójglicerydów do chłonki krezkowej oraz średnie prędkości przepływu chłonki u ostatnich n = 17 myszy typu dzikiego (WT), u których przeprowadzono opisany tutaj jednodniowy zabieg przetoki chłonnej. Jak pokazano na Rysunku 2A, stężenie trójglicerydów w chłonce wzrasta w odpowiedzi na podanie do dwunastnicy bolusa 300 µL SMOFLipid. Szczytowe stężenie trójglicerydów zostaje osiągnięte około 2-3 h po podaniu bolusa i stopniowo spada w ciągu 6 h (bezpośrednio przed eutanazją). Równolegle z wydzielaniem trójglicerydów, prędkość przepływu chłonki wzrasta od momentu podania bolusa w czasie 0 aż do końca eksperymentu (Rysunek 2B).
Wyniki te wykazują, że implantacja chirurgiczna zarówno przewodu chłonnego krezkowego, jak i kaniuli dwunastniczej przebiegła pomyślnie i stanowią one pozytywną kontrolę, w odniesieniu do której można analizować inne składniki limfy (hormony, peptydy, składniki odżywcze). Brak zmiany stężenia triglicerydów w limfie w odpowiedzi na bolus lipidów podany do dwunastnicy sygnalizuje, że zabieg chirurgiczny spowodował znaczne uszkodzenie jelita cienkiego, w wyniku czego utracono zdolność do wchłaniania lipidów, lub w przypadku wcześniej niefenotypowanych modeli genetycznych, sugeruje to, że mysz posiada fizjologicznie istotny defekt wchłaniania lipidów.
<img alt="Schemat osi czasu zabiegu chirurgicznego u myszy; bolus składników odżywczych, pobieranie chłonki, proces podawania glukozy/soli fizjologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proponowany harmonogram dla modelu mysiego z przetoką chylną. T-4, T-3, T-2: Podwójna kaniulacja trwa około 2-4 h, po czym myszy są umieszczane w komorach rekonwalescencyjnych. T-1: Po przejściu myszy w okres rekonwalescencji, otrzymują one ciągłą infuzję dwunastniczą 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej. T0: Ciągła infuzja wewnątrzdwunastnicza zostaje zmieniona z 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej na infuzję eksperymentalnych składników odżywczych. T0-T6: Myszy otrzymują ciągłe wewnątrzdwunastnicze podawanie 5% glukozy w soli fizjologicznej lub alternatywnie ciągłe podawanie składników odżywczych. Chłonka jest pobierana co godzinę w tym okresie. Punkt końcowy: Myszy są uśmiercane, a następnie można pobrać tkanki. Rysunek został stworzony za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy poziomu triglicerydów i szybkości przepływu limfy krezkowej; infuzja lipidów u myszy typu dzikiego w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Stężenie triglicerydów i szybkość przepływu limfy krezkowej. Myszy typu dzikiego wyposażono w zgłębnik do żywienia wewnątrzdwunastniczego oraz kaniulę do limfy krezkowej. Myszy otrzymały bolus 300 µL lipidów. Limfę zbierano przez 6 h w godzinnych aliquotach i przechowywano w lodzie. (A) Zawartość triglicerydów w limfie określono za pomocą testu chemicznego w każdej godzinnej aliquocie limfy. (B) W ciągu 6 h po infuzji bolusa przepływ limfy przedstawiono jako gramy wydzielonej limfy na godzinę. Punkty oznaczają średnie ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metody dostarczania lipidów</td>
			<td colspan="6">Zalecenia/Instrukcje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolus mieszanej emulsji lipidowej</td>
			<td colspan="6">Dawka 0,3 ml jednego z dwóch środków (A) Liposyn III 20% emulsja tłuszczowa dożylna lub (B) Można zastosować sterylną emulsję lipidową do wstrzykiwań SMOFlipid 20%, USP, podawaną przez rurkę do infuzji wewnątrzdwunastniczej. Lipidy emulgowane są użyteczne, ponieważ nie wymagają wcześniejszego przygotowania, pozostają w formie płynnej w temperaturze pokojowej, są sterylne oraz zawierają „łatwo przyswajalną” mieszaninę wolnych kwasów tłuszczowych, triglicerydów, fosfolipidów i taurocholanu sodu. Jest to odpowiednia infuzja początkowa dla myszy, u których mogą występować niewydolności trzustki lub dróg żółciowych.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolus trójglicerydów</td>
			<td colspan="6">0,3 ml delikatnie podgrzanej oliwy z oliwek (lub oczyszczonej trioleiny) jako neutralnego lipidu odzwierciedlającego dietę bogatą w nienasycone kwasy tłuszczowe, smalcu (odzwierciedlającego dietę o wysokiej zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych) lub oleju kokosowego (odzwierciedlającego dietę o wysokiej zawartości średniołańcuchowych trójglicerydów) można podać za pomocą rurki do infuzji wewnątrzdwunastniczej lub poprzez zgłębnik doustny. Jeśli badany trójgliceryd jest nasycony, należy go podgrzać, aby był płynny w temperaturze pokojowej. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolus mieszanego posiłku</td>
			<td colspan="6">0,3 ml preparatu Ensure o składzie zawierającym 0,075 g tłuszczu (21,6%), 0,5 g węglowodanów (64,0%) i 0,1125 g białka (14,4%), który odzwierciedla niskotłuszczowy mieszany posiłek, może być podany za pomocą infuzji wewnątrzdwunastniczej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolus lipidów znakowanych promieniotwórczo</td>
			<td colspan="6">5.0 µCi 3trioleinian glicerolu znakowany H i/lub 1.0 µCi 14C-cholesterol w ilości 0,3 ml oliwy z oliwek można podać za pomocą infuzji wewnątrzdwunastniczej. 14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] o aktywności właściwej 55 Ci/mmol i stężeniu 0,1 mCi/ml. 3H-TG Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG) o aktywności właściwej 60 Ci/mmol i stężeniu 1 mCi/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dawka ciągła</td>
			<td colspan="6">Wlew dowolnej z powyższych eksperymentalnych formulacji składników odżywczych z prędkością 0,3 ml/h (zamiast jednorazowego bolusa o objętości 0,3 ml) spowoduje stałe wydzielanie triglicerydów do limfy. Różni się to od wlewu bolusowego, w którym stężenie triglicerydów w limfie osiąga szczyt po około 2–3 h, a następnie powraca do wartości bazowych po około 6–8 h.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela infuzji lipidów.

Obecny protokół opisuje szczegółowy protokół chirurgiczny izolowania przepływającej limfy jelitowej w odpowiedzi na infuzje składników odżywczych dodwunastnicy u myszy. Pozwala to na fizjologiczne określenie całkowitego wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy i wydzielania chylomikronu w odpowiedzi na różne eksperymentalne składniki odżywcze.

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...

Nasz protokół pozwala nam bezpośrednio mierzyć metabolizm poposiłkowy w przepływającej limfie krezkowej. Jest to potężne, ponieważ możemy ilościowo określić przepływ składników odżywczych z jelita cienkiego do limfy. Możemy też mierzyć cytokiny, lipidy w diecie, inne składniki diety i limfocyty.Ta technika może pomóc nam przeanalizować dynamikę lipidów w diecie przemieszczających się do limfy, syntezę i wydzielanie chylomikronów. Prezentowany tutaj model jednodniowy ma kilka zalet. Po pierwsze, skraca czas eksperymentu.Po drugie, zmniejsza stres zwierząt. Zwiększa przeżywalność zwierząt. I ogólnie rzecz biorąc, zmniejsza się liczba eksperymentalna.Naszą technikę zademonstruje dziś nasz starszy chirurg laboratoryjny, pan Nick Dedousis. I nasz naukowiec, dr Lihong Teng. Po przygotowaniu myszy do zabiegu chwyć skórę pęsetą i wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej małymi nożyczkami.Następnie przetnij w kierunku mostka i w dół do tłuszczu pachwinowego. Za pomocą retraktora odsuń wnętrzności otrzewnej na bok, aż przewód limfatyczny będzie widoczny. Używając patyczka higienicznego nasączonego solą fizjologiczną, przesuń wątrobę w kierunku prawej górnej strony ciała, a jelita i żołądek w lewo zwierzęcia.Następnie odsłonić tętnicę krezkową górną i przewód limfatyczny jelita, rozciągając dwunastnicę poprzecznie w lewo. Przygotuj rurkę kaniuli o długości od 30 do 40 centymetrów, wkładając igłę. Następnie, za pomocą jednomililitrowej strzykawki, przepłucz niewielką ilość heparyny przez rurkę i naciąć skos na końcu rurki kaniuli za pomocą nożyczek.Następnie wykonaj płytkie nacięcie i przewód limfatyczny za pomocą nożyczek do tęczówki, jak opisano w rękopisie. Przytrzymaj rurkę kaniuli za pomocą cienkich kleszczyków i delikatnie włóż skos końcówki do kanału. Ponieważ przewód limfatyczny jest delikatny, użyj kropli cyjanoakrylanu, aby przykleić kaniulę limfatyczną do limfy krezkowej zamiast wiązać cewnik szwem.Teraz za pomocą igły o rozmiarze 18 przebij otwór przez obszar odźwiernika żołądka za zwieraczem odźwiernika i włóż rurkę infuzyjną dwunastnicy do żołądka jeden do dwóch milimetrów poza zwieracz odźwiernika do dwunastnicy. Następnie przymocuj rurkę do żołądka za pomocą podwiązania sznurka do torebki za pomocą jedwabnego szwu 5/0 i uszczelnij kroplą kleju cyjanoakrylowego, aby zapobiec wyciekom. Rozpocznij infuzję dodwunastnicy 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej.Wymień narządy w jamie ciała i zszyj nacięcie w linii środkowej. Delikatnie umieść mysz w ciasnym uchwycie. Zapewnij myszom ciągły wlew soli fizjologicznej i glukozy do dwunastnicy przez godzinę.Sprawdź kaniulę pod kątem przepływu limfy i zacznij doić kaniulę limfatyczną, aby utrzymać przepływ limfy. Wykonać klasyczny wlew lipidowy z 0,3 mililitra emulsji lipidowej w bolusie przez rurkę do infuzji dodwunastniczej. Następnie zmień napar z powrotem na 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej w ilości 0,3 mililitra na godzinę nieprzerwanie do końca eksperymentu.Zbierz próbki limfy i wstępnie zważyć mikroprobówki wirówkowe przez 60 minut i utrzymuj limfę na lodzie. Zważ probówki po raz drugi, aby ustalić wagę limfy wydzielanej co 60 minut. Zbierz żołądek, jelito ślepe i okrężnicę i umieść każdy narząd w szklanej probówce o pojemności 15 mililitrów.Podziel jelito cienkie na trzy lub cztery segmenty. Rozetnij go wzdłużnie i zbierz zawartość światła, spłukując tkankę dwoma do trzech mililitrów zimnego PBS. Usuń błonę śluzową jelit składającą się z komórek nabłonka i związanej z nimi blaszki właściwej z warstwy mięśniowej, zeskrobując każdą sekcję w dwóch do trzech mililitrach zimnego PBS za pomocą zakrzywionej pęsety.Umieść wszystkie tkanki, izolaty światła i błony śluzowej oraz warstwę mięśniową w szklanych rurkach. Stężenie trójglicerydów w limfie wzrosło w odpowiedzi na bolus dodwunastniczy wynoszący 300 mikrolitrów SMOFlipidu. Maksymalne stężenie trójglicerydów osiąga się po dwóch do trzech godzinach od bolusa i stale spada przez sześć godzin.Natężenie przepływu limfy wzrasta od czasu infuzji bolusa zerowego do końca eksperymentu. Głównym celem tego protokołu było zmniejszenie stresu zwierząt, zwiększenie przeżywalności i skrócenie czasu znieczulenia. Aby to osiągnąć, zamieniliśmy klatki przytrzymujące Bollmana na przytulne i dodaliśmy wilgotność, ciepło i uzupełnianie płynów.Nasz jednodniowy protokół wiotkiej przetoki pozwala nam mierzyć w czasie rzeczywistym, in vivo, dynamikę wchłaniania lipidów. Pozwala nam również badać przesłuchy narządów jelitowych, metabolizm, wchłanianie składników odżywczych w diecie i fenotypy immunologiczne.

the-isolation-flowing-mesenteric-lymph-mice-to-quantify-vivo-kinetics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Tutaj opisujemy technikę kannuacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów, która umożliwia ilościowe określenie transportu lipidów i leków przez układ limfatyczny po porodzie jelitowym. Technika ta może być dostosowana do oceny stężenia limfy krezkowej i/lub transportu płynu, komórek odpornościowych, peptydów, białek i cząsteczek lipofilowych.

Model szczura kaniulowanego kaniulowanego w krezkowym przewodzie chłonnym: zastosowanie do oceny transportu leków limfatycznych w jelitach

Komórki Caco-2 mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków/witamin. Przepuszczalny system błonowy oddziela przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego, podczas gdy system ekspresji lentiwirusa oferuje skuteczną metodę nadekspresji genów. Izolacja lipoprotein jest potwierdzona przez TEM.

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

Przedstawiamy zabieg chirurgiczny polegający na cewnikowaniu jelitowego pnia limfatycznego u nowonarodzonych świń w celu pobrania dużych ilości składników metabolizmu lipidów z odprowadzającej limfy.

Długotrwałe cewnikowanie pnia limfatycznego jelit i pobieranie limfy u nowonarodzonych świń

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

Poznaj technikę izolacji przepływającej limfy krezkowej u myszy, umożliwiającą ilościowe określenie wchłaniania lipidów i wydzielania chylomikronu. Metoda pozwala na pomiar metabolizmu pokarmowego in vivo w czasie rzeczywistym.

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

Przeglądaj więcej filmów