Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu
30 listopada 2022
Obecny protokół opisuje szczegółowy protokół chirurgiczny izolowania przepływającej limfy jelitowej w odpowiedzi na infuzje składników odżywczych dodwunastnicy u myszy. Pozwala to na fizjologiczne określenie całkowitego wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy i wydzielania chylomikronu w odpowiedzi na różne eksperymentalne składniki odżywcze.
Nasz protokół pozwala nam bezpośrednio mierzyć metabolizm poposiłkowy w przepływającej limfie krezkowej. Jest to potężne, ponieważ możemy ilościowo określić przepływ składników odżywczych z jelita cienkiego do limfy. Możemy też mierzyć cytokiny, lipidy w diecie, inne składniki diety i limfocyty.
Ta technika może pomóc nam przeanalizować dynamikę lipidów w diecie przemieszczających się do limfy, syntezę i wydzielanie chylomikronów. Prezentowany tutaj model jednodniowy ma kilka zalet. Po pierwsze, skraca czas eksperymentu.
Po drugie, zmniejsza stres zwierząt. Zwiększa przeżywalność zwierząt. I ogólnie rzecz biorąc, zmniejsza się liczba eksperymentalna.
Naszą technikę zademonstruje dziś nasz starszy chirurg laboratoryjny, pan Nick Dedousis. I nasz naukowiec, dr Lihong Teng. Po przygotowaniu myszy do zabiegu chwyć skórę pęsetą i wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej małymi nożyczkami.
Następnie przetnij w kierunku mostka i w dół do tłuszczu pachwinowego. Za pomocą retraktora odsuń wnętrzności otrzewnej na bok, aż przewód limfatyczny będzie widoczny. Używając patyczka higienicznego nasączonego solą fizjologiczną, przesuń wątrobę w kierunku prawej górnej strony ciała, a jelita i żołądek w lewo zwierzęcia.
Następnie odsłonić tętnicę krezkową górną i przewód limfatyczny jelita, rozciągając dwunastnicę poprzecznie w lewo. Przygotuj rurkę kaniuli o długości od 30 do 40 centymetrów, wkładając igłę. Następnie, za pomocą jednomililitrowej strzykawki, przepłucz niewielką ilość heparyny przez rurkę i naciąć skos na końcu rurki kaniuli za pomocą nożyczek.
Następnie wykonaj płytkie nacięcie i przewód limfatyczny za pomocą nożyczek do tęczówki, jak opisano w rękopisie. Przytrzymaj rurkę kaniuli za pomocą cienkich kleszczyków i delikatnie włóż skos końcówki do kanału. Ponieważ przewód limfatyczny jest delikatny, użyj kropli cyjanoakrylanu, aby przykleić kaniulę limfatyczną do limfy krezkowej zamiast wiązać cewnik szwem.
Teraz za pomocą igły o rozmiarze 18 przebij otwór przez obszar odźwiernika żołądka za zwieraczem odźwiernika i włóż rurkę infuzyjną dwunastnicy do żołądka jeden do dwóch milimetrów poza zwieracz odźwiernika do dwunastnicy. Następnie przymocuj rurkę do żołądka za pomocą podwiązania sznurka do torebki za pomocą jedwabnego szwu 5/0 i uszczelnij kroplą kleju cyjanoakrylowego, aby zapobiec wyciekom. Rozpocznij infuzję dodwunastnicy 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej.
Wymień narządy w jamie ciała i zszyj nacięcie w linii środkowej. Delikatnie umieść mysz w ciasnym uchwycie. Zapewnij myszom ciągły wlew soli fizjologicznej i glukozy do dwunastnicy przez godzinę.
Sprawdź kaniulę pod kątem przepływu limfy i zacznij doić kaniulę limfatyczną, aby utrzymać przepływ limfy. Wykonać klasyczny wlew lipidowy z 0,3 mililitra emulsji lipidowej w bolusie przez rurkę do infuzji dodwunastniczej. Następnie zmień napar z powrotem na 5% glukozy i 0,9% soli fizjologicznej w ilości 0,3 mililitra na godzinę nieprzerwanie do końca eksperymentu.
Zbierz próbki limfy i wstępnie zważyć mikroprobówki wirówkowe przez 60 minut i utrzymuj limfę na lodzie. Zważ probówki po raz drugi, aby ustalić wagę limfy wydzielanej co 60 minut. Zbierz żołądek, jelito ślepe i okrężnicę i umieść każdy narząd w szklanej probówce o pojemności 15 mililitrów.
Podziel jelito cienkie na trzy lub cztery segmenty. Rozetnij go wzdłużnie i zbierz zawartość światła, spłukując tkankę dwoma do trzech mililitrów zimnego PBS. Usuń błonę śluzową jelit składającą się z komórek nabłonka i związanej z nimi blaszki właściwej z warstwy mięśniowej, zeskrobując każdą sekcję w dwóch do trzech mililitrach zimnego PBS za pomocą zakrzywionej pęsety.
Umieść wszystkie tkanki, izolaty światła i błony śluzowej oraz warstwę mięśniową w szklanych rurkach. Stężenie trójglicerydów w limfie wzrosło w odpowiedzi na bolus dodwunastniczy wynoszący 300 mikrolitrów SMOFlipidu. Maksymalne stężenie trójglicerydów osiąga się po dwóch do trzech godzinach od bolusa i stale spada przez sześć godzin.
Natężenie przepływu limfy wzrasta od czasu infuzji bolusa zerowego do końca eksperymentu. Głównym celem tego protokołu było zmniejszenie stresu zwierząt, zwiększenie przeżywalności i skrócenie czasu znieczulenia. Aby to osiągnąć, zamieniliśmy klatki przytrzymujące Bollmana na przytulne i dodaliśmy wilgotność, ciepło i uzupełnianie płynów.
Nasz jednodniowy protokół wiotkiej przetoki pozwala nam mierzyć w czasie rzeczywistym, in vivo, dynamikę wchłaniania lipidów. Pozwala nam również badać przesłuchy narządów jelitowych, metabolizm, wchłanianie składników odżywczych w diecie i fenotypy immunologiczne.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół izolacji płynącej limfy jelitowej u myszy, umożliwiający precyzyjny pomiar całkowitego wchłaniania lipidów jelitowych oraz syntezy chylomikronów po wlewach składników odżywczych do dwunastopalcznicy. Metoda ta ma na celu zrozumienie dynamiki wchłaniania lipidów oraz odpowiedzi immunologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Metabolizm
- Fizjologia układu trawiennego
- Immunologia
Wstęp
- Metabolizm poposiłkowy ma kluczowe znaczenie dla wchłaniania składników odżywczych.
- Pomiar przepływu limfy pozwala na poznanie dynamiki lipidów pokarmowych.
- Redukcja stresu u zwierząt i poprawa przeżywalności są kwestiami nadrzędnymi w projekcie eksperymentalnym.
Zastosowane metody
- Techniki chirurgiczne kanulacji przewodów chłonnych u myszy
- Model poposiłkowy z wykorzystaniem infuzji składników odżywczych do dwunastnicy
- Pomiar przepływu chłonki i stężeń lipidów w czasie rzeczywistym
Główne wyniki
- Infuzja lipidów wykazuje szczytowe stężenia triglicerydów w ciągu trzech godzin.
- Szybkość przepływu limfy znacznie wzrasta po infuzji.
- Protokół skutecznie skraca czas znieczulenia i zwiększa wskaźniki przeżywalności.
Wnioski
- Jednodniowy protokół umożliwia obserwację dynamiki wchłaniania lipidów w czasie rzeczywistym in vivo.
- Badania te są istotne dla zrozumienia metabolizmu oraz interakcji immunologicznych w jelitach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia kwantyfikacja wchłaniania lipidów z diety oraz wydzielania chylomikronów in vivo wypełnia istotną lukę w badaniach nad chorobami metabolicznymi i walidacją celów terapeutycznych. Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczy pomiar przepływu składników odżywczych oraz mediatorów odpornościowych przed ich rozcieńczeniem systemowym, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad wczesnym wykrywaniem oraz w badaniach translacyjnych. Podejście to usprawnia proces podejmowania decyzji w zakresie rozwoju portfela badawczego, zapewniając przejrzystość mechanizmów interakcji między jelitami a lipidami oraz czynników ryzyka metabolicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę dynamiki wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy chylomikronów.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do szlaków metabolicznych i zapalnych istotnych dla chorób sercowo-naczyniowych i metabolicznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe określanie przepływu składników odżywczych i cytokin w czasie rzeczywistym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny system in vivo do oceny interwencji genetycznych lub farmakologicznych w procesie wchłaniania lipidów.
- Dostarcza ilościowych, rozdzielonych w czasie wyników, co pozwala na standaryzację analizy i porównywalność między badaniami.
- Umożliwia skalowalny pobór limfy do późniejszych analiz lipidów, hormonów i cytokin.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla danej choroby poprzez wykorzystanie genetycznych szczepów myszy w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną walidację oddziaływań między jelitami, lipidami a układem odpornościowym.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój programów badawczych nad chorobami metabolicznymi i zapalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etap wczesnego odkrywania z walidacją modeli przedklinicznych, łącząc badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w ramach procesów opracowywania leków na choroby metaboliczne.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie wchłaniania składników odżywczych i wydzielania chylomikronów w celu wyjaśnienia szlaków metabolicznych i walidacji celów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych, ilościowych wyników do oceny interwencji i opracowywania testów analitycznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar poziomu lipidów, hormonów i cytokin w nierozcieńczonej limfie dla zapewnienia rzetelnych analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i zachowanie ciągłości mechanistycznej pomiędzy etapem odkryć a fazą przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę in vivo do badań metabolicznych i immunologicznych w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pobieranie próbek in vivo, redukuje stres zwierząt i poprawia powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji typu go/no-go oraz efektywne kapitałowo rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów w obszarze chorób metabolicznych i zapalnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza chirurgiczna w zakresie kanulacji przewodów chłonnych oraz infuzji dwunastniczej u myszy.
- Niezbędna jest infrastruktura analityczna do oznaczania ilości lipidów, hormonów i cytokin w próbkach chłonki.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie pobierania próbek i analizy danych.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność techniczną oraz konieczność specjalistycznej opieki nad zwierzętami.
