Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Ten dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanoprętach może być wykorzystany do badania roli krzywizny błony w regulacji dynamiki i dystrybucji białek i lipidów podczas aktywności komórek. Technika ta oferuje zarówno wysoki podkorzeń, jak i zły w generowaniu krzywizny błony poprzez tworzenie ciągłej dwuwarstwy lipidowej na opatentowanych błędach nanoprętów z krzywizną membrany predefiniowaną przez nanowytwarzanie w wysokiej rozdzielczości. Aby rozpocząć, umieść nano chip w 10-mililitrowej zlewce stroną ze wzorem skierowaną do góry.

Ostrożnie dodaj jeden mililitr 98% kwasu siarkowego do zlewki i upewnij się, że kwas całkowicie pokrywa przednią i tylną stronę chipa. Powoli obracaj zlewkę i dodawaj kropla po kropli 200 mikrolitrów 30% nadtlenku wodoru, aż cała zlewka stanie się gorąca. Upewnij się, że kwas siarkowy i nadtlenek wodoru są dobrze wymieszane, tworząc roztwór piranii do usuwania cząsteczek organicznych z nano chipa.

Umieść zlewkę w wtórnym szklanym pojemniku i trzymaj nano chip zanurzony w roztworze Piranha przez noc, aby dokładnie oczyścić zanieczyszczenia. Wyjmij zlewkę i ostrożnie odpipetuj roztwór piranii do pojemnika na odpady kwasowe. Załaduj pięć mililitrów dejonizowanej wody do zlewki, aby rozcieńczyć pozostały kwas i wyrzuć go do kwaśnych odpadów.

Powtórz ten krok pięć razy. Chwyć chip pęsetą i umyj go ciągłym strumieniem dejonizowanej wody, aby dokładnie usunąć resztki kwasu. Wysuszyć chip 99,9% azotem w celu utworzenia SLB.

Sonikować mieszaninę lipidów przez 30 minut. Zamroź mieszaninę lipidów w ciekłym azocie na 20 sekund, a następnie rozmrażaj w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez dwie minuty w łaźni wodnej. Powtórz cykle zamrażania/rozmrażania 30 razy.

Następnie mieszanina lipidów wygląda jak klarowna ciecz. Przepuść mieszaninę lipidów przez mini wytłaczarkę i wytłaczaj tam iz powrotem 20 razy. Zbierz SUV-y ze strzykawki po drugiej stronie, aby zmniejszyć zanieczyszczenie większymi cząstkami lub ciałami obcymi, i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.

Ostrożnie wyjmij oczyszczony nano chip z wody dejonizowanej za pomocą pęsety i wysusz suszarką z 99,9% azotem. Wykonuj czyszczenie powierzchni nano chipa za pomocą obróbki plazmą powietrzną przez godzinę. Zamontuj nano chip w komorze PDMS.

Zacznij od umieszczenia chipa na czystej powierzchni wzorem skierowanym do góry. Delikatnie przykryj środkowy PDMS chipem i upewnij się, że cały wzór jest odsłonięty w środkowej części dużego owalnego otworu w środkowym PDMS. Przykryj górny PDMS środkowym PDMS i utrzymuj jego dwa małe otwory w obszarze dużego owalnego otworu środkowego PDMS.

Następnie montowana jest komora PDMS. Załaduj SUV-y do kanału PDMS z jednego z dwóch małych otworów w górnym PDMS za pomocą pipety i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć SLB. Delikatnie odpipetuj bufor PBS do kanału PDMS z jednej strony małego otworu i usuń odpady wacikiem z drugiego otworu, aby zmyć niezwiązane SUV-y.

Następnie zdobądź SLB utworzony na nano chipie. Skonfiguruj laserową skaningową mikroskopię konfokalną za pomocą obiektywu olejowego 100x. Otwórz oprogramowanie Zen, aby wybrać moc lasera wzbudzającego, która może wzbudzić fluorescencję lipidów i białek.

Wybierz tryb pozyskiwania. Następnie kliknij Smart Setup, a następnie Texas Red. Wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła ostrości, aby zlokalizować nano paski na chipie, aż krawędzie nano pasków będą ostre pod kanałem lipidowym.

Ustaw parametry skanowania, aby uzyskać kontrolny obraz kanału lipidowego przed dodaniem białka. Przeprowadź test FRAP przez wybielanie dwuwarstwą lipidową znakowaną fluorescencyjnie na losowym obszarze z pojedynczym nanoprętem. Zaznacz pola wyboru Regiony eksperymentu i Wybielanie.

Narysuj okrągły obszar o średnicy pięciu mikrometrów, który może zawierać cały nanopasek w środku, i dodaj do obszarów eksperymentu. Wprowadź parametry obrazowania TimeLapse. Wybierz pozycję Szeregi czasowe.

Następnie kliknij Czas trwania. Wybierz 100 cykli i interwał równy dwóm sekundom. Wprowadź parametry bielenia.

Zaznacz pola wyboru lasera, które wykonują FRAP i zmień moc na 100%Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby przeprowadzić eksperyment FRAP. Załaduj roztwór białka do kanału PDMS i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie białka z SLB. Ponownie ustaw ostrość nanopasków i ustaw parametry skanowania, aby wykonywać obrazy zarówno kanałów lipidowych, jak i białkowych w celu wykrywania krzywizny białek.

Wybierz regiony eksperymentu i przeprowadź test FRAP zarówno na kanałach lipidowych, jak i białkowych, a następnie wykonaj obrazowanie TimeLapse, aby scharakteryzować ruchliwość białka wykrywającego krzywiznę. Oba wykazują zwiększoną akumulację na końcu pojedynczych nanoprętów pokrytych SLB o szerokości 300 nanometrów. W tym przypadku SLB zawiera 10% PS, aby elektrostatycznie zwiększyć wiązanie białek.

Oba białka mają wyższy stosunek końca do środka niż lipidy, który wynosi około jednego. Porównując IDR FBP17 i F-Bar, wyższy stosunek końca do środka IDR FBP17 wskazuje na silniejsze wykrywanie krzywizny niż F-Bar. Wszystkie trzy białka wykazywały preferencyjną akumulację w miejscach zakrzywionej błony na końcach nanoprętów, gdy krzywizna zmniejszyła się poniżej 400 nanometrów średnicy.

Spośród tych trzech domen białkowych, IDR FBP17 daje najwyższy nano bar i gęstość, co wskazuje na jego najsilniejszą zdolność wykrywania krzywizny, podczas gdy F-Bar wykazuje najniższą wartość. Krzywą wiązania białek można wykreślić, stopniowo zwiększając stężenie białka, co pokazuje, że IDR FBP17 ma silną zdolność do kooperatywnego wykrywania krzywizny. W porównaniu z szybkim odzyskiwaniem sygnałów lipidowych na nanoprętach, F-Bar nie może się zregenerować w ciągu dwóch minut, co sugeruje jego znacznie zmniejszoną ruchliwość błony i dynamikę asocjacji w zakrzywionych miejscach błony.

Co zaskakujące, w odróżnieniu od zachowania F-Bar, sygnały IDR FBP17 wykazały oczywiste odzyskanie w tym samym czasie, co wskazuje na dynamiczną naturę IDR FBP17 nagromadzonego na zakrzywionych membranach. Jednak po wypłukaniu niezwiązanego IDR FBP17 w roztworze, nie można było zaobserwować takiego samego powrotu do wartości w kanale IDR FBP17 jak wcześniej. Jakość SLB jest bardzo ważna podczas badania interakcji między zakrzywioną błoną a białkiem.

Tak więc test FRAP jest niezbędny w naszym eksperymencie, aby potwierdzić ruchliwość błony. System ten pomoże naukowcom w badaniu różnych parametrów wpływających na interakcję białka z zakrzywioną błoną, takich jak domeny wykrywania krzywizny i skład lipidów, a także w prowadzeniu dynamicznych badań nad zakrzywioną membraną, takich jak zachowania związane z separacją twarzy.