Name: Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro. Ta metoda umożliwia charakteryzację dynamiki białek w zakrzywionych błonach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) i Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang (NTU) za wsparcie w tworzeniu nanostruktur i obrazowaniu SEM, Platformie Produkcji Białek (PPP) w School of Biological Sciences NTU za oczyszczanie białek oraz School of Chemical and Biomedical Engineering NTU za mikroskop konfokalny. Praca ta jest finansowana przez Ministerstwo Edukacji Singapuru (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 i MOE-T2EP30220-0009), Instytut Cyfrowej Analizy Molekularnej i Nauki (IDMxS) wspierany przez MOE w ramach programu Centrów Doskonałości Badawczej (W. Zhao), Fundację Programu Nauk Granicznych (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU za stypendium badawcze (X. Miao) oraz Chińska Rada Stypendialna za stypendium badawcze (J. Wu).

1. Czyszczenie nanochipa
<ol>
	<li>Umieść nanochip w zlewce o pojemności 10 ml wzorzystą stroną skierowaną do góry. 
	UWAGA: Ten kwarcowy nanochip został wytworzony za pomocą litografii wiązką elektronów, jak opisano wcześniej21. Geometria i rozmieszczenie nanostruktury na chipie mogą być zaprojektowane na zamówienie. Rozmiary zastosowanych tutaj nanoprętów gradientowych to 2000 nm długości, 600 nm wysokości i 100 do 1000 nm szerokości (zestaw kroków 100 nm).</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 1 ml 98% kwasu siarkowego do zlewki i upewnij się, że kwas całkowicie pokrywa przednią i tylną stronę wióra. 
	UWAGA: 98% kwas siarkowy jest wyjątkowo i może powodować szybkie niszczenie tkanek i poważne oparzenia chemiczne w kontakcie ze skórą lub oczami. Używaj go w dygestorium z odpowiednią ochroną.</li>
	<li>Powoli obracaj zlewkę i dodawaj kropla po kropli 200 μl 30% nadtlenku wodoru, aż cała zlewka stanie się gorąca. Upewnij się, że kwas siarkowy i nadtlenek wodoru są dobrze wymieszane, tworząc roztwór piranii do usuwania cząsteczek organicznych z nanochipa17. Istnieją alternatywne techniki generowania SLB na czystych powierzchniach hydrofilowych, takie jak światło UV i ekspozycja na ozon, jak opisano wcześniej23. 
	UWAGA: Reakcja jest niezwykle egzotermiczna i może spowodować wrzenie roztworu, więc dodawaj nadtlenek wodoru do kwasu siarkowego kropla po kropli i dalej obracaj.</li>
	<li>Umieść zlewkę w wtórnym szklanym pojemniku i trzymaj nanochip zanurzony w roztworze piranii przez noc, aby dokładnie oczyścić zanieczyszczenia. 
	UWAGA: Umieść zlewkę w dygestorium bez żadnej osłony na wypadek, gdyby reakcja mogła wytworzyć gaz.</li>
	<li>Wyjąć zlewkę i ostrożnie odpipetować roztwór piranii do pojemnika na odpady kwasowe.</li>
	<li>Załaduj 5 ml wody dejonizowanej do zlewki w celu rozcieńczenia pozostałego kwasu i wyrzuć go do kwaśnych odpadów. Powtórz ten krok pięć razy i użyj 5 M NaOH do zneutralizowania kwaśnych odpadów.</li>
	<li>Chwyć chip pęsetą i umyj go ciągłym strumieniem dejonizowanej wody, aby dokładnie usunąć resztki kwasu. Wysuszyć chip suszarką z 99,9% gazowym azotem do tworzenia SLB22.</li>
</ol>
2. Generowanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV)
<ol>
	<li>Dodać 100 μl chloroformu do bursztynowej fiolki. 
	UWAGA: Chloroform jest bardzo lotną, bezbarwną cieczą i może być toksyczny w przypadku wdychania lub połknięcia. Używaj go w dygestorium z założoną maską i rękawiczkami.</li>
	<li>Rozpuścić 500 μg mieszaniny lipidów w chloroformie. Skład zastosowanej tutaj mieszaniny lipidów to 89,5% mol fosfatydylocholiny jaj (PC), 10 mol% fosfatydyloseryny mózgu (PS) i 0,5 mol% soli 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy Texas Red (Texas Red DHPE).</li>
	<li>Wysuszyć mieszaninę lipidów w fiolce z 99,9% azotem gazowym, aż chloroform ulatnia się, a mieszanina lipidów wyschnie. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać w dygestorium. Unikaj rozprysków płynu podczas suszenia.</li>
	<li>Umieścić mieszaninę lipidów obecną w bursztynowej fiolce bez pokrywki w eksykatorze próżniowym pokrytym folią aluminiową. Następnie suszyć próżniowo próbkę za pomocą pompy przez 3 godziny, aby całkowicie ulatniać się chloroform.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do fiolki. Mieszaj roztwór, aż stanie się jednorodny. 
	UWAGA: Bufor PBS składa się ze 150 mM NaCl, bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej; pH jest dostosowane do 7,2 w celu wytworzenia dwuwarstwy lipidowej PC i PS.</li>
	<li>Sonikować mieszaninę lipidów przez 30 minut z częstotliwością 50 kHz w sonikatorze kąpielowym. Następnie przenieś mieszaninę lipidów do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i uszczelnij parafilmem.</li>
	<li>Zamrozić mieszaninę lipidów w ciekłym azocie przez 20 s, a następnie rozmrażać w temperaturze 42 °C przez 2 minuty w łaźni wodnej. Powtórz cykle zamrażania i rozmrażania 30 razy. Następnie mieszanina lipidów wygląda jak klarowna ciecz. 
	UWAGA: Ciekły azot ma temperaturę wrzenia około −195.8 °C. Może powodować odmrożenia lub oparzenia kriogeniczne. Używaj go w nieograniczonej przestrzeni z założonymi rękawicami termoizolacyjnymi.</li>
	<li>Wypłucz dwie szklane, gazoszczelne strzykawki i złącze mini-ekstrudera odpowiednio etanolem, chloroformem i metanolem. Powtórz sekwencję płukania pięć razy, aby wstępnie wyczyścić urządzenie. Pozostaw je w dygestoriach do momentu całkowitego ulotnienia się rozpuszczalnika organicznego.</li>
	<li>Zmontuj mini-wytłaczarkę i przepuść 500 μl buforu PBS przez złącze, aby wstępnie zwilżyć urządzenie, a następnie wyrzuć bufor z innej strzykawki. Ten etap usuwa zanieczyszczenia i ułatwia wytłaczanie.</li>
	<li>Zmontuj mini-wytłaczarkę z poliwęglanową membraną filtracyjną o wielkości porów 100 nm. 
	UWAGA: Wielkość porów membrany filtracyjnej określa średnicę liposomów.</li>
	<li>Pobrać 500 μl buforu PBS za pomocą jednej ze strzykawek i delikatnie przepchnąć go przez filtr, aby napełnić drugą pustą strzykawkę na drugim końcu. Powtórz wytłaczanie tam i z powrotem trzy razy, aby sprawdzić szczelność aparatu i wyrzuć bufor z drugiej strzykawki.</li>
	<li>Przepuść mieszaninę lipidów przez mini ekstruder, aby zastąpić bufor PBS. Następnie wytłaczaj tam iz powrotem 20 razy, aby utworzyć SUV-y. Wielopłytkowy charakter pęcherzyków może zostać zachowany przy niewystarczającej liczbie czasów ekstruzji, co wpłynie na tworzenie SLB23.</li>
	<li>Zebrać SUV-y z drugiej strzykawki, aby zmniejszyć zanieczyszczenie większymi cząstkami i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Wyjąć strzykawkę bezpośrednio ze złącza w przypadku zerwania strzykawki.</li>
	<li>Owiń probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu lipidów znakowanych fluorescencyjnie i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Zwykle SUV-y mogą być przechowywane do 7 dni.</li>
</ol>
3. Tworzenie SLB na nanochipie
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjmij oczyszczony nanochip z wody dejonizowanej pęsetą i wysusz suszarką w 99,9% gazowym azocie.</li>
	<li>Czyszczenie powierzchni nanochipa za pomocą plazmy powietrznej należy wykonywać przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zmontuj nanochip w komorze polidimetylosiloksanu (PDMS), która składa się z dwóch części PDMS - środkowego PDMS i górnego PDMS (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). Środkowy PDMS jest cienki (~0,5 mm) z dużym owalnym otworem pośrodku, aby zapewnić wystarczającą ekspozycję na wzór nanopasków. Górny PDMS jest gruby (~4,0 mm) z dwoma małymi otworami w dużym owalnym otworze jako wlot i wylot do obsługi cieczy.
	<ol>
		<li>Umieść wiór na czystej powierzchni wzorem skierowanym do góry.</li>
		<li>Delikatnie przykryj środkowy PDMS chipem i upewnij się, że cały wzór jest odsłonięty w środkowej części dużego owalnego otworu w środkowym PDMS.</li>
		<li>Przykryj górny PDMS środkowym PDMS i utrzymuj jego dwa małe otwory w obszarze dużego owalnego otworu środkowego PDMS. Następnie montowana jest komora PDMS. 
		UWAGA: PDMS jest najczęściej stosowanym polimerem organicznym na bazie krzemu. Jest biokompatybilny, przezroczysty, a także odkształcalny, dzięki czemu można go zaprojektować jako niestandardowy kształt do montażu chipów i obrazowania pod mikroskopem. Co ważniejsze, po obróbce plazmowej może być kowalencyjnie przyklejony do innej warstwy PDMS lub szkła, dzięki czemu nadaje się jako komora do przygotowania SLB. Ten krok zapewnia, że każda warstwa PDMS jest ściśle dopasowana, aby uniknąć szczelin i wycieków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj SUV-y do komory PDMS z jednego z dwóch małych otworów w górnym PDMS za pomocą pipety i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć SLB.</li>
	<li>Delikatnie odpipetuj bufor PBS do komory PDMS z jednej strony małego otworu i usuń odpady wacikiem z drugiego otworu, aby zmyć niezwiązane SUV-y. Następnie należy pobrać SLB utworzony na nanochipie (jakość SLB jest testowana przez odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), jak pokazano w kroku 4.4 i omówiono w sekcji reprezentatywnych wyników). 
	UWAGA: Podczas pipetowania buforu PBS do komory, końcówka pipety powinna być wypełniona buforem i stykać się z powierzchnią cieczy, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wiązania białka SLB i czujnika krzywizny na nanochipie
UWAGA: Ta sekcja będzie zależeć od systemu mikroskopu dostępnego dla eksperymentu. W tym miejscu zostaną opisane ogólne wytyczne dotyczące sposobu wykonywania obrazowania. Szczegółowe ustawienia można zmieniać między różnymi ustawieniami mikroskopu.
<ol>
	<li>Skonfiguruj laserową skaningową mikroskopię konfokalną za pomocą obiektywu olejowego 100x (N.A.1.4). Otwórz oprogramowanie ZEN, aby wybrać moc lasera wzbudzającego, która może wzbudzić fluorescencję lipidów i białek. Wybierz tryb akwizycji > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.</li>
	<li>Dostosuj ostrość za pomocą pokrętła ostrości, aby zlokalizować nanopaski na chipie, aż krawędzie nanopasków będą ostre pod kanałem lipidowym.</li>
	<li>Ustaw parametry skanowania jak poniżej, aby uzyskać obraz kontrolny kanału lipidowego przed dodaniem białka: Rozmiar klatki = 512 pikseli x 512 pikseli (512 pikseli x 512 pikseli, rozmiar piksela 124 nm), Bity na piksel = 16 (głębia 16-bitowa), Szybkość skanowania = 5 i Uśrednianie = 4 (tryb uśredniania cztery razy / linię).</li>
	<li>Przeprowadź test FRAP, wybielając znakowaną fluorescencyjnie dwuwarstwę lipidową na losowym obszarze z pojedynczym nanoprętem.
	<ol>
		<li>Zaznacz pola wyboru Regiony eksperymentu i Wybielanie. Narysuj okrągły obszar o średnicy 5 μm, który może zawierać cały nanopasek w środku (rozmiar nanopręta wynosi 2 μm) i dodaj do regionów eksperymentalnych. Wprowadź parametry obrazowania poklatkowego w poniższym przykładzie: wybierz Szybkość skanowania = 9 i Uśrednianie = 1. Wybierz Szeregi czasowe > Czas trwania = 100 cykli i Interwał = 2 s. Wprowadź parametry wybielania w następujący przykład: zaznacz pole wyboru Rozpocznij po # obrazach i wybierz trzy obrazy.</li>
		<li>Zaznacz pola wyboru lasera, które wykonują FRAP i zmień moc na 100.0%. Kliknij przycisk Start Experiment (Rozpocznij eksperyment) dla eksperymentu FRAP. 
		UWAGA: FRAP jest powszechną metodą charakteryzowania ruchliwości cząsteczek komórkowych. Jeśli SLB ma dobrą płynność, fluorescencja w wybielonym obszarze będzie stopniowo odzyskiwana, gdy bielone fluorofory dyfundują, a niebielone fluorofory z innych obszarów dyfundują do środka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj roztwór białkowy do komory PDMS i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie białka z SLB. 
	UWAGA: Białka używane w klasie <strong="xfig">Rysunek 2G,H w celu wykazania składu lipidowego ułatwiającego wiązanie białek na zakrzywionych nanobarach SLB to 74 μM GFP i 79 μM GFP-His. Te dwa białka są białkami zielonej fluorescencji bez lub z tagiem His. Białka używane do badania wykrywania krzywizny w <silna klasa="xfig">Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5 to 16 μM F-BAR, 16 μM IDRFBP17 i 16 μM FBAR+IDRFBP17. Te trzy białka są domenami FBP17, który jest typowym białkiem BAR, które intuicyjnie przyjmuje się zarówno jako generatory krzywizny, jak i czujniki. Każda objętość białka wynosi 20 μl.</li>
	<li>Ponownie ustaw ostrość nanopasków i powtórz krok 4.3, aby wykonać obrazy kanałów lipidowych i białkowych w celu wykrywania krzywizny białek.</li>
	<li>Powtórz krok 4.4, aby przeprowadzić test FRAP zarówno na kanałach lipidowych, jak i białkowych oraz wykonaj obrazowanie poklatkowe w celu scharakteryzowania ruchliwości białka wykrywającego krzywiznę.</li>
</ol>
5. Ponowne wykorzystanie nanochipa
<ol>
	<li>Chwyć nanochip pęsetą i ostrożnie odłącz go od komory PDMS w zlewce o pojemności 50 ml wypełnionej wodą dejonizowaną. 
	UWAGA: Jest to krytyczny krok. Nie dopuszczaj do tego, aby pęseta dotykała nanostruktury i nie zmuszaj chipa do oddzielania się, aby uniknąć pęknięć.</li>
	<li>Dokładnie umyj nanochip bezwodnym etanolem, aby usunąć pozostałości organiczne przyczepione do powierzchni. 
	UWAGA: Użyj czystej bibuły, aby usunąć wodę z powierzchni przed umyciem bezwodnym etanolem. 
	UWAGA: Etanol bezwodny jest wysoce lotną i lekko niebezpieczną substancją chemiczną. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Używaj go w dygestorium z założoną maską i rękawiczkami.</li>
	<li>Dokładnie umyj chip dużą ilością wody dejonizowanej, aby usunąć resztki etanolu. Następnie wysuszyć frytki suszarką z 99,9% azotem. 
	UWAGA: Ważne jest, aby usunąć wszelkie ślady etanolu z chipa przed przejściem do następnego kroku, ponieważ kwas pirania może gwałtownie reagować z rozpuszczalnikiem organicznym i powodować eksplozje.</li>
	<li>Umieść chip w czystej zlewce o pojemności 10 ml stroną ze wzorem skierowaną do góry i wyczyść chip roztworem piranii do ponownego użycia, wykonując te same czynności, co "czyszczenie nanochipa".</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja obrazu
<ol>
	<li>Obróć obrazy uzyskane przez mikroskop tak, aby matryca nanoprętów znalazła się w pozycji pionowej w celu późniejszej analizy w oprogramowaniu Fidżi.</li>
	<li>Użyj specjalnie napisanego kodu MATLAB "c_pillarmask_averaging", aby zlokalizować pojedynczy nanopasek za pomocą kwadratowej maski (51 pikseli x 51 pikseli) zarówno w kanale lipidowym, jak i białkowym. 
	UWAGA: Ten kod MATLAB jest specjalnie zaprojektowany dla nanochipa. Można go uzyskać na GitHub za pośrednictwem linku: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.</li>
	<li>Odejmij sygnały tła każdego obrazu z trzema ROI (5 pikseli x 5 pikseli) w rogach obrazu za pomocą funkcji meshgrid w kodzie MATLAB "BarGra_avg". Ta operacja ma na celu skorygowanie potencjalnych nierównych szumów tła spowodowanych ustawieniem mikroskopu lub poziomowaniem chipów na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Wygeneruj średnie obrazy nanoprętów tej samej wielkości za pomocą kodu MATLAB "BarGra_avg", gdzie każdy punkt jest średnią wartości w tym punkcie we wszystkich pojedynczych nanoprętowych maskach kwadratowych. Generuj wykresy powierzchni 3D średnich obrazów w oprogramowaniu Fidżi, aby intuicyjnie pokazać średni rozkład sygnału wokół nanoprętów. Wybierz pozycję Analizuj > powierzchni > Wprowadź 100 dla mnożnika wielokąta, a następnie zaznacz pola wyboru Cień, Rysuj oś i Wygładzanie.</li>
	<li>Podziel każdy nanopasek na trzy obszary, które obejmują dwa obszary końcowe nanoprętów i jeden obszar środka nanopręta, aby wyodrębnić ich intensywność fluorescencji odpowiednio za pomocą kodu MATLAB "avg_nanobar_quantification". Rozmiary nanoprętów ROI są dostosowywane zgodnie z wymiarami nanoprętów za pomocą pliku "position".</li>
	<li>Podziel intensywność białka przez intensywność lipidów wyekstrahowaną z kodu MATLAB "avg_nanobar_quantification" w obszarze końca pręta, aby uzyskać gęstość końca nanopręta, która wyklucza efekt powierzchni.</li>
	<li>Wykreśl gęstość końca nanopręta o różnych stężeniach w pryzmacie GraphPad, aby uzyskać krzywą wiązania. Otwórz menu Analizuj. Wybierz opcję Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) > Wiązanie - Nasycenie > Specyficzne powiązanie z funkcją nachylenia wzgórza, aby dopasować krzywą do równania nachylenia, a następnie oblicz wartość współczynnika KD i wzgórza.</li>
	<li>Intensywność lipidów i białek jest normalizowana do odpowiadających im intensywności w centrum nanobarów 600 nm uzyskanym na tym samym obrazie przy użyciu kodu MATLAB "avg_nanobar_quantification".</li>
	<li>Użyj najjaśniejszych dziewięciu pikseli znormalizowanej intensywności białka w obszarze końca nanopręta podzielonego przez obszar środka pręta, aby określić ilościowo wykrywanie krzywizny białka za pomocą nanoprętów tej samej wielkości, wartość ta jest nazywana "stosunkiem końca do środka". Użyj stosunku znormalizowanej intensywności białka, aby znormalizować intensywność lipidów, aby określić ilościowo zakres wykrywania krzywizny białka za pomocą nanopasków o różnych rozmiarach, wartość ta jest nazywana jako "Znormalizowana gęstość końcowa nanobarów". Wartości te są obliczane przez kod MATLAB "avg_nanobar_quantification".</li>
	<li>Załaduj obraz stosu FRAP w oprogramowaniu Fidżi. Wybierz obszar FRAP i wygeneruj ROI. Wybierz funkcję More > Multi measure, aby za każdym razem mierzyć intensywność obszaru FRAP. Wykreśl intensywność w GraphPad Prism, aby wygenerować krzywą odzysku FRAP.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnego interesu finansowego w tej pracy.

Opisany tutaj system nanobar-SLB oferuje unikalne połączenie zalet kilku istniejących testów in vitro. Skutecznie ujawnia preferencyjne wiązanie białek z wysoce zakrzywionymi błonami, jak test flotacji liposomów lub sedymentacji, ale wymaga znacznie mniejszej liczby próbek i oferuje dokładniej zdefiniowaną krzywiznę na poszczególnych nanoprętach 8,29. Oferuje również szeroki zakres precyzyjnie kontrolowanej krzywizny do jednoczesnego porównania z testem ...

Krzywizna błony to krytyczny parametr fizyczny komórki, który występuje w różnych procesach komórkowych, takich jak morfogeneza, podział komórki i migracja komórek1. Obecnie powszechnie uznaje się, że krzywizna błony wykracza poza prosty wynik zdarzeń komórkowych; Zamiast tego okazał się skutecznym regulatorem interakcji białkowych i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Na przykład stwierdzono, że kilka białek zaangażowanych w endocytozę za pośrednictwem klatryny preferencyjnie wiąże się z zakrzywioną błoną, co powoduje powstanie gorącego miejsca dla endocytozy2. Istnieje wiele różnych przyczyn deformacji błony, takich jak ciągnięcie błony przez siły cytoszkieletu, obecność asymetrii lipidów z grupami głowy o różnych rozmiarach, istnienie białek transbłonowych o stożkowym kształcie, akumulacja białek kształtujących błonę, takich jak białka domeny BAR (nazwane tak od białek Bin, amfifizyny i Rvs) oraz wprowadzenie domeny helis amfipatycznych do błony1. Co ciekawe, te białka i lipidy nie tylko deformują błonę, ale mogą również wyczuwać krzywiznę błony i wykazywać preferencyjną akumulację1. Dlatego tak ważne jest zbadanie, czy i w jaki sposób błony o różnych krzywiznach zmieniają rozmieszczenie i dynamikę przyłączonych do nich białek i lipidów oraz potencjalny wpływ na powiązane procesy wewnątrzkomórkowe.
Opracowano wiele technik do analizy interakcji między zakrzywioną błoną a białkami zarówno w żywych komórkach, jak i w systemach in vitro. Żywy system komórkowy zapewnia rzeczywiste środowisko komórkowe z bogatą różnorodnością lipidów i dynamiczną regulacją sygnalizacji białek2,3,4,5,6,7. Jednak tak wyrafinowany system jest trudny do zbadania ze względu na niepewność i wahania w środowisku wewnątrzkomórkowym. W związku z tym testy in vitro z wykorzystaniem sztucznej membrany złożonej ze znanych gatunków lipidów i oczyszczonych białek stały się potężnymi systemami rekonstytucji w celu scharakteryzowania relacji między białkami a zakrzywionymi błonami. Tradycyjnie, liposomy o różnych średnicach są generowane przez wytłaczanie w celu wykrycia białek wrażliwych na krzywiznę za pomocą testu kosedymentacji przy użyciu siły odśrodkowej lub testu koflotacji z gradientem gęstości, aby uniknąć agregacji białek8,9. Jednak krzywizna wytłaczanych liposomów jest ograniczona przez dostępną wielkość porów filtra membranowego stosowanego w ekstruderze 10. Udowodniono, że test krzywizny pojedynczego liposomu (SLiC) przezwycięża to ograniczenie, w którym liposomy o różnych średnicach są znakowane fluorescencyjnie i unieruchamiane na powierzchni, dzięki czemu krzywiznę można oznaczyć za pomocą intensywności fluorescencji11. Jednak w małych pęcherzykach zaobserwowano dużą zmienność składu lipidowego, co wpływa na dokładność pomiaru krzywizny12. Eksperymenty z ciągnięciem uwięzi zapewniają dokładniejszy pomiar krzywizny przejściowej linki wyciągniętej z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) za pomocą pęsety optycznej, gdzie krzywizna może być dobrze kontrolowana przez generowane napięcie membrany13,14. Metoda ta jest odpowiednia do badania białek o dodatniej lub ujemnej krzywiźnie, ale jest ograniczona przepustowością generacji lamp10. Test z rurkami membranowymi (SMrT) umożliwia jednoczesne generowanie wielu rurek membranowych, które są wytłaczane z tego samego zbiornika lipidów za pomocą przepływów mikroprzepływowych. Niemniej jednak krzywizna membrany zmienia się wewnętrznie wzdłuż nanorurki, co pogarsza dokładność pomiaru krzywizny na podstawie intensywności fluorescencji15,16. Dla porównania, użycie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV, średnica <100 nm17) do utworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej (SLB) na powierzchniach zawierających zaprojektowane topografie wygenerowało pojedynczą dwuwarstwową membranę o krzywiznach wstępnie określonych przez nanofabrykację lub nanomateriały z dużą dokładnością18,19,20.
Tutaj prezentujemy protokół tworzenia SLB na spreparowanych powierzchniach nanochipów z układami nanobarów i jak można go użyć do badania wrażliwości białek in vitro na krzywiznę. Jak pokazano na Rysunek 1, istnieje sześć podstawowych elementów testu: A) Czyszczenie i montaż chipa z komorą mikroprzepływową; B) Przygotowanie SUV-ów o określonym składzie lipidowym; C) Tworzenie SLB na nanochipie i wiązanie się z białkami wrażliwymi na krzywiznę; D) Obrazowanie i charakterystyka białek wrażliwych na SLB i krzywiznę w mikroskopii fluorescencyjnej; E) Czyszczenie chipa do ponownego użycia; F) Przetwarzanie obrazu w celu ilościowej analizy zdolności wykrywania krzywizny białka. Szczegółowy protokół został opisany krok po kroku poniżej.

<table><tbody><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Diament</td><td>RN0879999FU</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynowa fiolka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27115-U</td><td></td></tr><tr><td>Mózg PS: L-&alfa;-fosfatydyloseryna (mózg, świnia) (sól sodowa)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840032</tr><tr><td>10 ml zlewki</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211060804</td><td></td></tr><tr><td>50 ml zlewki</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211061706</td><td></td></tr><tr><td>1000 ml zlewki</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211065408</td><td>Drugi pojemnik&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V800117</td><td></td></tr><tr><td>Patyczki</td><td>kosmetyczne Watsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-[(Kwas N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet)sukcynyl] (sól niklowa)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>790404</tr><tr><td>Egg PC: L-&alfa;-fosfatydylocholina (jajko, kurczak)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840051</tr><tr><td>Plaftorm do produkcji białek F-BAR, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur</td><td></td><td>Produkcja białek i peptydów</td><td></td></tr><tr><td>F-BAR+IDR</td><td>Plaftorm, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur</td><td></td><td>Białka i peptyd</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Plaftorm do produkcji białek, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur</td><td></td><td>Białka i peptydy</td></tr><tr><td>GFP-His</td><td>Plaftorm do produkcji białek, Szkoła Nauk Biologicznych, Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur</td><td></td><td>Białka i peptydy</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>V9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30% (certyfikowany ACS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>IDR od człowieka FBP17</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.50d</td><td></td></tr><tr><td>Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM 800 z obiektywem olejowym Airyscan</td><td>100x (N.A.1.4).</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>naukowy 10010240</td><td></td></tr><tr><td>Mini-eksfuder&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówki</td><td>Greiner</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018b</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofilowa membrana nuklerowa, 0,1 i mu; m</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Saline (PBS)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) Baza</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) Środek sieciujący</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>HARRICK PLASMA</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>Nanochip kwarcowy</td><td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, sól trietyloamonowa Life</td><td>Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td></td><td></td>T1395MP</tr><tr><td>Pęseta</td><td>Gooi</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>Myjki ultradźwiękowe</td><td>Elma</td><td>D-78224</td><td></td></tr><tr><td>Voterx</td><td>Scientific Industries</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>NUCERITE</td><td>5312</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Julabo</td><td>TW8</td><td></td></tr></tbody></table>

dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Krzywizna błony odgrywa ważną rolę w różnych istotnych procesach komórek, takich jak migracja komórek, podział komórek i transport pęcherzyków. Jest nie tylko biernie generowany przez aktywność komórkową, ale także aktywnie reguluje interakcje białkowe i bierze udział w wielu sygnalizacjach wewnątrzkomórkowych. W związku z tym bardzo cenne jest zbadanie roli krzywizny błony w regulacji dystrybucji i dynamiki białek i lipidów. Ostatnio opracowano wiele technik badania związku między zakrzywioną błoną a białkiem in vitro. W porównaniu z tradycyjnymi technikami, nowo opracowana dwuwarstwa lipidowa (SLB) oparta na nanoprętach oferuje zarówno wysoką przepustowość, jak i lepszą dokładność w generowaniu krzywizny błony poprzez tworzenie ciągłej dwuwarstwy lipidowej na wzorzystych układach nanoprętów z predefiniowaną krzywizną membrany i lokalną płaską kontrolą. Zarówno płynność lipidów, jak i wrażliwość białek na zakrzywione błony można scharakteryzować ilościowo za pomocą obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu przedstawiono szczegółową procedurę tworzenia SLB na wytworzonych powierzchniach szklanych zawierających matryce nanoprętów oraz charakterystykę białek wrażliwych na krzywiznę na takich SLB. Ponadto omówiono protokoły ponownego wykorzystania nanochipów i przetwarzania obrazu. Poza nanobar-SLB, protokół ten można łatwo zastosować do wszystkich typów nanostrukturalnych chipów szklanych do badań wykrywania krzywizny.

Konstrukcja nanopaska jest zalecana do badania białek wykrywających dodatnią krzywiznę; nanopasek ten posiada półokrąg na każdym końcu o krzywiźnie zdefiniowanej przez szerokość nanopaska oraz jedną płaską kontrolę o zerowej krzywiźnie zlokalizowaną w centrum (Ryc. 2A,B). Pomyślne utworzenie SLB na nanopaskach skutkuje równomiernym rozkładem sygnałów markerów lipidowych na całej powierzchni nanopaska, co przedstawiono na Ryc. 2C. Sygnały z wielu...

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Ten dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanoprętach może być wykorzystany do badania roli krzywizny błony w regulacji dynamiki i dystrybucji białek i lipidów podczas aktywności komórek. Technika ta oferuje zarówno wysoki podkorzeń, jak i zły w generowaniu krzywizny błony poprzez tworzenie ciągłej dwuwarstwy lipidowej na opatentowanych błędach nanoprętów z krzywizną membrany predefiniowaną przez nanowytwarzanie w wysokiej rozdzielczości. Aby rozpocząć, umieść nano chip w 10-mililitrowej zlewce stroną ze wzorem skierowaną do góry.Ostrożnie dodaj jeden mililitr 98% kwasu siarkowego do zlewki i upewnij się, że kwas całkowicie pokrywa przednią i tylną stronę chipa. Powoli obracaj zlewkę i dodawaj kropla po kropli 200 mikrolitrów 30% nadtlenku wodoru, aż cała zlewka stanie się gorąca. Upewnij się, że kwas siarkowy i nadtlenek wodoru są dobrze wymieszane, tworząc roztwór piranii do usuwania cząsteczek organicznych z nano chipa.Umieść zlewkę w wtórnym szklanym pojemniku i trzymaj nano chip zanurzony w roztworze Piranha przez noc, aby dokładnie oczyścić zanieczyszczenia. Wyjmij zlewkę i ostrożnie odpipetuj roztwór piranii do pojemnika na odpady kwasowe. Załaduj pięć mililitrów dejonizowanej wody do zlewki, aby rozcieńczyć pozostały kwas i wyrzuć go do kwaśnych odpadów.Powtórz ten krok pięć razy. Chwyć chip pęsetą i umyj go ciągłym strumieniem dejonizowanej wody, aby dokładnie usunąć resztki kwasu. Wysuszyć chip 99,9% azotem w celu utworzenia SLB.Sonikować mieszaninę lipidów przez 30 minut. Zamroź mieszaninę lipidów w ciekłym azocie na 20 sekund, a następnie rozmrażaj w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez dwie minuty w łaźni wodnej. Powtórz cykle zamrażania/rozmrażania 30 razy.Następnie mieszanina lipidów wygląda jak klarowna ciecz. Przepuść mieszaninę lipidów przez mini wytłaczarkę i wytłaczaj tam iz powrotem 20 razy. Zbierz SUV-y ze strzykawki po drugiej stronie, aby zmniejszyć zanieczyszczenie większymi cząstkami lub ciałami obcymi, i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.Ostrożnie wyjmij oczyszczony nano chip z wody dejonizowanej za pomocą pęsety i wysusz suszarką z 99,9% azotem. Wykonuj czyszczenie powierzchni nano chipa za pomocą obróbki plazmą powietrzną przez godzinę. Zamontuj nano chip w komorze PDMS.Zacznij od umieszczenia chipa na czystej powierzchni wzorem skierowanym do góry. Delikatnie przykryj środkowy PDMS chipem i upewnij się, że cały wzór jest odsłonięty w środkowej części dużego owalnego otworu w środkowym PDMS. Przykryj górny PDMS środkowym PDMS i utrzymuj jego dwa małe otwory w obszarze dużego owalnego otworu środkowego PDMS.Następnie montowana jest komora PDMS. Załaduj SUV-y do kanału PDMS z jednego z dwóch małych otworów w górnym PDMS za pomocą pipety i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć SLB. Delikatnie odpipetuj bufor PBS do kanału PDMS z jednej strony małego otworu i usuń odpady wacikiem z drugiego otworu, aby zmyć niezwiązane SUV-y.Następnie zdobądź SLB utworzony na nano chipie. Skonfiguruj laserową skaningową mikroskopię konfokalną za pomocą obiektywu olejowego 100x. Otwórz oprogramowanie Zen, aby wybrać moc lasera wzbudzającego, która może wzbudzić fluorescencję lipidów i białek.Wybierz tryb pozyskiwania. Następnie kliknij Smart Setup, a następnie Texas Red. Wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła ostrości, aby zlokalizować nano paski na chipie, aż krawędzie nano pasków będą ostre pod kanałem lipidowym.Ustaw parametry skanowania, aby uzyskać kontrolny obraz kanału lipidowego przed dodaniem białka. Przeprowadź test FRAP przez wybielanie dwuwarstwą lipidową znakowaną fluorescencyjnie na losowym obszarze z pojedynczym nanoprętem. Zaznacz pola wyboru Regiony eksperymentu i Wybielanie.Narysuj okrągły obszar o średnicy pięciu mikrometrów, który może zawierać cały nanopasek w środku, i dodaj do obszarów eksperymentu. Wprowadź parametry obrazowania TimeLapse. Wybierz pozycję Szeregi czasowe.Następnie kliknij Czas trwania. Wybierz 100 cykli i interwał równy dwóm sekundom. Wprowadź parametry bielenia.Zaznacz pola wyboru lasera, które wykonują FRAP i zmień moc na 100%Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby przeprowadzić eksperyment FRAP. Załaduj roztwór białka do kanału PDMS i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie białka z SLB. Ponownie ustaw ostrość nanopasków i ustaw parametry skanowania, aby wykonywać obrazy zarówno kanałów lipidowych, jak i białkowych w celu wykrywania krzywizny białek.Wybierz regiony eksperymentu i przeprowadź test FRAP zarówno na kanałach lipidowych, jak i białkowych, a następnie wykonaj obrazowanie TimeLapse, aby scharakteryzować ruchliwość białka wykrywającego krzywiznę. Oba wykazują zwiększoną akumulację na końcu pojedynczych nanoprętów pokrytych SLB o szerokości 300 nanometrów. W tym przypadku SLB zawiera 10% PS, aby elektrostatycznie zwiększyć wiązanie białek.Oba białka mają wyższy stosunek końca do środka niż lipidy, który wynosi około jednego. Porównując IDR FBP17 i F-Bar, wyższy stosunek końca do środka IDR FBP17 wskazuje na silniejsze wykrywanie krzywizny niż F-Bar. Wszystkie trzy białka wykazywały preferencyjną akumulację w miejscach zakrzywionej błony na końcach nanoprętów, gdy krzywizna zmniejszyła się poniżej 400 nanometrów średnicy.Spośród tych trzech domen białkowych, IDR FBP17 daje najwyższy nano bar i gęstość, co wskazuje na jego najsilniejszą zdolność wykrywania krzywizny, podczas gdy F-Bar wykazuje najniższą wartość. Krzywą wiązania białek można wykreślić, stopniowo zwiększając stężenie białka, co pokazuje, że IDR FBP17 ma silną zdolność do kooperatywnego wykrywania krzywizny. W porównaniu z szybkim odzyskiwaniem sygnałów lipidowych na nanoprętach, F-Bar nie może się zregenerować w ciągu dwóch minut, co sugeruje jego znacznie zmniejszoną ruchliwość błony i dynamikę asocjacji w zakrzywionych miejscach błony.Co zaskakujące, w odróżnieniu od zachowania F-Bar, sygnały IDR FBP17 wykazały oczywiste odzyskanie w tym samym czasie, co wskazuje na dynamiczną naturę IDR FBP17 nagromadzonego na zakrzywionych membranach. Jednak po wypłukaniu niezwiązanego IDR FBP17 w roztworze, nie można było zaobserwować takiego samego powrotu do wartości w kanale IDR FBP17 jak wcześniej. Jakość SLB jest bardzo ważna podczas badania interakcji między zakrzywioną błoną a białkiem.Tak więc test FRAP jest niezbędny w naszym eksperymencie, aby potwierdzić ruchliwość błony. System ten pomoże naukowcom w badaniu różnych parametrów wpływających na interakcję białka z zakrzywioną błoną, takich jak domeny wykrywania krzywizny i skład lipidów, a także w prowadzeniu dynamicznych badań nad zakrzywioną membraną, takich jak zachowania związane z separacją twarzy.

a-nanobar-supported-lipid-bilayer-system-for-study-membrane-curvature

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

W tym filmie demonstrujemy procedurę badania organizacji septyny na dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Planarny dwuwarstwowy test lipidowy: oparta na mikroskopii technika in vitro do badania składania septyny na mimikach błon biologicznych

Ten film opisuje technikę badania składania białek septyny na mikrosferach pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta pomaga w zrozumieniu zależnych od krzywizny zespołów białek na zakrzywionych powierzchniach.

Test dwuwarstwowy lipidów ze sferycznym wsparciem: technika obserwacji składania się septyny na mikrosferach

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Septyny to białka cytoszkieletu. Oddziałują z błonami lipidowymi i mogą wykrywać, ale także generować krzywiznę błony w skali mikronów. W tym protokole opisujemy oddolne metodologie in vitro do analizy deformacji błony, wrażliwego na krzywiznę wiązania septyny i ultrastruktury włókien septyny.

Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro. Ta metoda umożliwia charakteryzację dynamiki białek w zakrzywionych błonach komórkowych.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Przeglądaj więcej filmów