Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex
6 października 2022
Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.
Metoda ta oferuje sposób na wzmocnienie sygnału ze zdarzeń wiązania do postaci, która jest wykrywalna wizualnie przy niskim zużyciu zasobów lub może być określona ilościowo za pomocą oprzyrządowania opartego na absorbancji. Jest to stosunkowo szybki, jednoetapowy protokół do określenia obecności celu aptamera w próbce będącej przedmiotem zainteresowania. Wyniki można porównać ze standardową krzywą kalibracyjną, jeśli pożądane jest określenie ilościowe.
Osoby muszą być bardzo precyzyjne podczas przenoszenia i mieszania roztworów, ponieważ niewystarczające wymieszanie doprowadzi do negatywnych wyników. Upewnij się również, że odczynniki i roztwory są przechowywane w chłodzie do czasu użycia, aby zminimalizować sygnał tła. Rozpocznij od aktywacji produktów rozszczepienia rybozymu poprzez dodanie pięciu jednostek kinazy polinukleotydowej T4 w probówce PCR.
Następnie dodaj jeden mikrolitr wstępnie przygotowanego buforu rybozymu 5X do każdej probówki z próbką. Aby wizualnie zademonstrować specyficzność, dodaj 1,5 mikrolitra dwumilimolowej teofiliny lub dwóch milimolowych kofein do każdej probówki jako próbki testowe i dokładnie wymieszaj każdą próbkę, pipetując od pięciu do 10 razy. Następnie dodaj dwa mikrolitry 600 nanomolowego RNA zawierającego specyficzną dla celu domenę aptameryczną do każdej probówki z próbką, a następnie pipetuj w celu szybkiego wymieszania składników.
Teraz umieść rurkę na zimnym bloku, aby zminimalizować sygnał tła. Po przygotowaniu wszystkich probówek reakcyjnych inkubować każdą próbkę w temperaturze pokojowej dokładnie przez trzy minuty. Pod koniec inkubacji należy natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodzie.
Dodaj 3,5 mikrolitra mieszaniny enzymów polimerazy kazazy do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszaj. Następnie dodać 31,5 mikrolitra mieszaniny reakcyjnej EXPAR zawierającej nukleotydy matrycowe i bufor reakcyjny do każdej probówki z próbką i wymieszać pipetując. Po przygotowaniu wszystkich próbek należy inkubować przygotowaną próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez pięć minut za pomocą timera.
Po inkubacji natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodzie. Dodaj dwa mikrolitry roztworu heminy do każdej probówki z próbką w celu opracowania koloru i dobrze wymieszaj. Następnie dodaj 58 mikrolitrów dostępnego w handlu roztworu TMB do każdej probówki z próbką, dobrze wymieszaj i inkubuj w celu uzyskania koloru.
Odczytać próbki jakościowo na oko lub określić ilościowo wyniki za pomocą czytnika płytek absorbancyjnych, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Zoptymalizowany konstrukt jest w stanie rozpoznać zaledwie 500 nanomolowych teofilin w ciągu 30 minut. Preparaty próbek wystawione na działanie celu mają niebieski kolor, podczas gdy próbki niezawierające celu pozostają bezbarwne.
Krzywa wzorcowa została przygotowana na podstawie sygnału zmierzonego w A450 po 30 minutach wywoływania koloru. Ważne jest, aby trzymać próbki na lodzie, gdy nie przeprowadza się inkubacji, ponieważ nawet zoptymalizowane RNA nadal będzie wykazywać niski poziom aktywności tła.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół demonstruje szybki, 3-etapowy, oparty na aptamerach test eksponencjalnej amplifikacji do wykrywania takich substancji jak teofilina. Obejmuje przygotowanie próbki, amplifikację sygnału i wykształcanie koloru.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biochemia
- Chemia analityczna
- Biotechnologia
Tło
- Aptamery to krótkie, pojedyncze łańcuchy RNA lub DNA, które mogą wiązać się ze specyficznymi celami.
- Amplifikacja sygnału jest kluczowa dla wykrywania substancji o niskiej obecności.
- Metody detekcji wizualnej mogą być przydatne w warunkach o ograniczonych zasobach.
- Precyzyjne postępowanie z reagentami jest niezbędne dla dokładnych wyników.
Cel badania
- Rozwój szybkiej metody wykrywania teofiliny w porównaniu z kofeiną.
- Dostarczenie protokołu jedno-pojemnikowego do amplifikacji sygnału.
- Możliwość ilościowego określenia wyników za pomocą krzywej kalibracyjnej.
Zastosowane metody
- Aktywacja produktów rozszczepienia rybozymu za pomocą kinazy polinukleotydowej T4.
- Wizualna detekcja zdarzeń wiązania.
- Ilościowe określenie za pomocą instrumentacji opartej na absorpcji.
- Staranne mieszanie i chłodzenie reagentów w celu zminimalizowania sygnału tła.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na wykrywanie teofiliny w próbkach.
- Wyniki mogą być interpretowane wizualnie lub ilościowo.
- Precyzja w obsłudze roztworów jest krytyczna dla udanych wyników.
- Sygnały tła mogą być zminimalizowane dzięki właściwemu zarządzaniu reagentami.
Wnioski
- Test oparty na aptamerach jest szybką i efektywną metodą wykrywania celu.
- Może być przystosowany do różnych zastosowań w środowiskach o ograniczonych zasobach.
- Przyszłe badania mogą obejmować dodatkowe cele i optymalizację protokołu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Aptamer-based detection systems with isothermal exponential amplification offer rapid, sensitive, and visually interpretable outputs for target validation in early discovery workflows. This three-stage G-quadruplex amplification protocol enables both qualitative and quantitative readouts, supporting robust decision-making at the assay development and screening inflection points. The approach enhances predictive confidence for target engagement and specificity, directly impacting portfolio triage and downstream assay readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular recognition events using aptamer specificity.
- Supports functional validation of target binding through visually detectable outputs.
- Facilitates rapid assessment of target engagement for mechanistic de-risking.
- Improves confidence in target selectivity by distinguishing closely related analytes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, one-pot protocol for reproducible assay setup.
- Delivers quantitative outputs via absorbance measurement for reliable compound evaluation.
- Enables rapid screening of samples with minimal instrumentation requirements.
- Supports calibration curve-based quantification for assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Offers potential for adaptation to disease-relevant biomarkers when supported by aptamer design.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation through scalable detection formats.
- Reduces risk of false positives by minimizing background signal with optimized protocols.
Pipeline & Workflow Integration
This aptamer-EXPAR system fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge from molecular recognition to quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming target presence and specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput or resource-limited settings.
- Analytics: Enables absorbance-based measurement and standard curve generation for comparative analysis.
- Translational Research: Can be adapted for biomarker detection if aptamer specificity is established.
- Enterprise Reuse: Protocol modularity allows adaptation to new targets by substituting aptamer domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with a rapid, standardized, and scalable protocol.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient assay development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative detection data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aptamer design and nucleic acid handling.
- Needs access to basic molecular biology instrumentation and absorbance plate readers for quantification.
- Demands precise reagent handling and temperature control to minimize background signal.
- Protocol can be adapted to different targets by modifying the aptameric domain.
- Careful optimization is necessary to ensure specificity and minimize false positives.
