Name: Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 38 s
Description: Poznaj szybką metodę wykrywania teofiliny opartą na aptamerach z izotermiczną amplifikacją sygnału. Protokół umożliwia wizualną lub spektrofotometryczną detekcję w jednej probówce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundusze na Rozwój i Rozwój od Aptagen LLC.

Zobacz Tabelę Uzupełniającą 1 (tabelę ustawień reakcji) dla przygotowania probówki, w tym konkretnych objętości i stężeń składników reakcji. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje wstępnie zmontowany zestaw platformy detekcyjnej, zgodnie z opisem w tabeli materiałów. Wszystkie elementy muszą być przechowywane na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
1. Przygotowanie rybozymu
UWAGA: Podstawowym składnikiem wykrywania jest allosteryczny (regulowany przez aptamer) rybozym rozpoznający teofilinę (patrz Tabela Uzupełniająca 2).
<ol>
	<li>Zbierz 5 U kinazy polinukleotydowej T4 (0,5 μl, patrz tabela materiałów) w probówce PCR, która zostanie użyta do aktywacji produktów rozszczepienia rybozymu. 
	UWAGA: Ten składnik jest dodawany jako pierwszy, aby użytkownik mógł zobaczyć prawidłowe dozowanie enzymu.</li>
	<li>Dodać 1 μl wstępnie przygotowanego 5x buforu rybozymu (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką (probówki do PCR).</li>
	<li>W celu wizualnego wykazania swoistości dodać 1,5 μl 2 mM teofiliny (tarcza) lub 2 mM kofeiny (kontrola) (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką jako próbki do badań. 
	UWAGA: W celu wyznaczenia krzywej wzorcowej zaleca się rozpoczęcie od analitu 3,125 mM i testowanie pięciokrotnych rozcieńczeń do 0,001 mM.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać każdą probówkę z próbką, pipetując 5-10 razy.</li>
	<li>Dodać 2 μl RNA o długości 600 nM zawierającego domenę aptameryczną specyficzną dla celu (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką, aby uzyskać końcowe stężenie 240 nM w 5 μl roztworu testowego, a następnie szybko wymieszać pipetując i umieścić na zimnym bloku, aby zminimalizować sygnał tła. 
	UWAGA: ważne jest, aby początkowo przygotować wszystkie reakcje bez rybozymu, ponieważ reakcja samorozszczepienia rozpocznie się natychmiast po połączeniu rybozymu z buforem rybozymu i może wytworzyć znaczne tło.</li>
	<li>Po przygotowaniu wszystkich probówek reakcyjnych inkubować każdą próbkę (5 μl) w temperaturze pokojowej (23 °C) dokładnie przez 3 minuty za pomocą timera. Po inkubacji natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodowisku (4 °C).</li>
</ol>
2. GQ-EXPAR
<ol>
	<li>Dodać 3,5 μl mieszaniny enzymatycznej niknazy i polimerazy (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszać. 
	UWAGA: Wymagane stężenia enzymów zależą od sekwencji rozpoznawania, typów enzymów i temperatur reakcji, których kombinację określono empirycznie.</li>
	<li>Dodać 31,5 μl mieszaniny reakcyjnej EXPAR zawierającej matrycę, nukleotydy i bufor reakcyjny (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i pipety, aby wymieszać. 
	UWAGA: Stężenia składników są optymalizowane w oparciu o enzymy i sekwencje produktów polimerazy.</li>
	<li>Po przygotowaniu wszystkich próbek każdą z przygotowanych próbek (40 μl) inkubować w temperaturze 55 °C dokładnie przez 5 minut, używając timera. Jeśli to możliwe, inkubuj na termocyklerze, chociaż podgrzewana pokrywka nie jest konieczna.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodowisku (4 °C).</li>
</ol>
3. Rozwój kolorów
<ol>
	<li>Dodać 2 μl roztworu Hemina (25 μM, patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Dodać 58 μl dostępnego w handlu roztworu TMB (patrz tabela materiałów) do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Inkubować reakcję rozwoju barwy (100 μl) w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 minuty i do 30 minut. 
	UWAGA: (Opcjonalnie) Rozwój koloru można zatrzymać, dodając 20 μl 2 M kwasu siarkowego.</li>
	<li>Odczytać próbki jakościowo na oko lub określić ilościowo wyniki za pomocą czytnika płytek absorbancji przy długości fali 450 nm, jeśli reakcje rozwoju barwy zostały zatrzymane przy użyciu kwasu siarkowego.</li>
</ol>

<ol><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tang, J., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+allosteric+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Rational design of allosteric ribozymes.</a> Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX--A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Liao, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+colorimetric+system+for+detecting+target+antigens+by+a+three-stage+signal+transformation-amplification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy.</a> Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).</li>
<li>Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+molecular+recognition+of+RNA+aptamers+by+allosteric+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection.</a> Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).</li>
<li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li>
<li>Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+peroxidase+activity+of+G-quadruplex-hemin+complexes+and+its+application+in+ligand+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening.</a> Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).</li>
<li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-triggered+isothermal+exponential+amplification+strategy+in+ultrasensitive+homogeneous+label-free+electrochemical+nucleic+acid+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing.</a> Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).</li>
<li>Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free riboswitches.</a> RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).</li>
<li>Ao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+an+expression+platform+in+the+SELEX+cycle+to+select+DNA+aptamer+binding+to+a+disease+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker.</a> ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).</li>
</ol>

Aptagen, LLC produkuje i sprzedaje zestaw demonstracyjny GQ-EXPAR dla tych, którzy chcą mieć bezpośrednie doświadczenie z systemem wykrywania opartym na aptamie.

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje przejście między początkowo nieuporządkowaną strukturą drugorzędową w rybozymie allosterycznym a dodatkową stabilnością uzyskaną poprzez wiązanie celu z domeną aptameryczną w celu aktywacji rybozymu młota rozszczepiającego cis. Stabilność rybozymu została dostosowana w celu zminimalizowania aktywności katalitycznej pod nieobecność celu, jednocześnie umożliwiając wiązanie celu w celu przywrócenia aktywnej struktury. Ponadto należy zwrócić uwagę na zrównoważenie wielu enzymów wymagan...

Aptamery to zazwyczaj jednoniciowe DNA lub RNA wybrane w procesie ewolucyjnym o wysokim powinowactwie wiązania i swoistości do pożądanych celów1. Oprócz zdolności wiązania, aptamery mogą być połączone z motywami i sterować nimi za pomocą funkcji wyjścia sygnału2,3, wzmacniając wspomniany sygnał i poprawiając czułość systemu. System izotermicznej reakcji wykładniczego wzmocnienia G-quadruplex (GQ-EXPAR) jest trzyczęściowym systemem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), który wytwarza sygnał wizualny, gdy kolejne składniki są dodawane do pojedynczego naczynia reakcyjnego w celu wytworzenia wizualnego wyjścia4. System ten pozwala na wykrycie określonego celu, w tym teofiliny, w danej próbce w ciągu 15 minut przy użyciu usprawnionego przepływu pracy, aby umożliwić szybkie, specyficzne wykrycie interesującego celu. Metodę tę należy uwzględnić w odniesieniu do próbek, w przypadku których specyficzne oznaczanie ilościowe stężenia docelowego stanowi mniejsze zagrożenie niż wysoka swoistość odpowiedzi w krótkim czasie.
Ryboprzełącznik allosteryczny, cząsteczka RNA (rybozym) zmieniająca strukturę, która ulega samodzielnemu rozszczepieniu, wytwarza początkowy sygnał. Konstrukt ten oparty jest na rybozymie młota, z domeną aptameryczną wprowadzoną w Stem II jako regulator aktywności rozszczepienia. Jego funkcja samorozszczepienia jest aktywowana, gdy jego domena aptameryczna jest ustabilizowana podczas wiązania z target5. W przeciwnym razie przełącznik jest nieaktywny w swoim stanie natywnym.
Następująca po sobie reakcja amplifikacji wykładniczej (EXPAR) wykorzystuje uwolnienie samorozszczepionej nici RNA z pierwszego etapu do zapoczątkowania izotermicznej reakcji amplifikacji6. Produkt amplifikacji EXPAR ma aktywność peroksydazy7, działając jako podstawa dla ostatniego etapu systemu. Kiedy niektóre podłoża są utleniane w połączeniu z rozpadem nadtlenków, wytwarzają one fluorescencyjną moc wyjściową, którą można zmierzyć na różnych instrumentach. Inne popularne podłoża można zastąpić w celu wytworzenia kolorowego produktu do wykrywania wizualnego. EXPAR i aktywność peroksydazy w jego produktach wzmacniających działają jak 2-stopniowy wzmacniacz sygnału, zwiększając czułość do wyższych poziomów w porównaniu z konwencjonalnymi strategiami7,8.
Wykrycie teofiliny w porównaniu z kofeiną jest używane jako przykład specyficzności tej platformy wykrywania, ponieważ różnią się one tylko jedną grupą metylową (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Ta demonstracja systemu daje wynik kolorymetryczny do wizualnego wykrywania teofiliny o długości co najmniej 500 nM.

<table><tbody><tr><td>Roztwór dichlorowodorku 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) z H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"</td><td>PerkinElmer</td><td>FOOD-1806-1000</td><td>Odczynnik do rozwoju koloru. Zminimalizuj ekspozycję na światło i atmosferę. Poprzednio numer katalogowy BIOO Scientific 1806. Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rura 3-2.</td></tr><tr><td>5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC CCC TCC CTC CCA GA-Biotyna-3</td>'<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>Niestandardowa</td><td>, zoptymalizowana matryca DNA QtQ47 dla EXPAR do produkcji G-quadruplex, zagruntowanej przez G-quadruplex. Jest to wykorzystywane w "wykładniczej" części EXPAR, aby szybko zwiększyć ilość DNAzymu używanego do opracowywania koloru w kroku 3. Szablon zawiera 3'-biotynę, aby zapobiec niezamierzonemu rozszerzeniu przez polimerazę DNA Bst 2.0 podczas EXPAR. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.</td></tr><tr><td>5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG UUG UUG UAG GUU GUA UAG UU-3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td> <td>Niestandardowa</td><td>sekwencja rybozymu allosterycznego rozpoznająca teofilinę (samorozszczepiający się rybozym regulowany przez domenę aptamerową RNA dla teofiliny) zmodyfikowana z Soukup et al. Soukup, GA, Emilsson, GAA i Breaker, RR (2000) Zmiana molekularnego rozpoznawania aptamerów RNA przez selekcję allosteryczną, Journal of molecular biology 298, 623-632. Dostarczana w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rurka 1-3.</td></tr><tr><td>5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotyna-3</td>'<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>Niestandardowa</td><td>zoptymalizowana matryca DNA P3tQ49 dla EXPAR do produkcji G-quadruplex, zagruntowana produktem rozszczepienia P3. Jest to używane w Kroku 2 do translacji produktu rozszczepienia na DNAzyme używany do opracowywania koloru w Kroku 3. Szablon zawiera 3'-biotynę, aby zapobiec niezamierzonemu rozszerzeniu przez polimerazę DNA Bst 2.0 podczas EXPAR. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.</td></tr><tr><td>5x Bufor rybozymowy</td><td>Aptagen, LLC</td><td>N/A</td><td>5x skład: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Używany w kroku 1. dostarczany w zestawie demonstracyjnym apta-beacon jako rura 1-4.</td></tr><tr><td>Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Zestaw demonstracyjny</td><td>Aptagen, LLC</td><td>GQ-EXPAR-TMB</td><td>Zestaw demonstracyjny przedstawia specyfikę testu kolorymetrycznego poprzez wykrywanie trudnych celów małocząsteczkowych, teofiliny i kofeiny, które różnią się tylko jedną grupą metylową.</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Bst 2.0</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td><td>Polimeraza z amplifikacją izotermiczną o aktywności przemieszczenia nici. Część mieszanki nikkazy i polimerazy, przygotowana w 9,375 U/uL. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-1.</td></tr><tr><td>Bufor 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6003SVIAL</td><td>W połączeniu z 2 μl 10-krotnego buforu do amplifikacji izotermicznej i 27,5 μl wody wolnej od nukleaz w celu wytworzenia 1,11-krotnego buforu EXPAR w EXPAR Mix. Ten produkt zastępuje poprzednio używany B7203SVIAL, który był częścią początkowego rozwoju systemu (ten sam skład, z wyjątkiem nierekombinowanego BSA). Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.</td></tr><tr><td>Kofeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-100G</td><td>Przeciwtarcza aptamerowa (kontrolna), przygotowana z wodą wolną od nukleaz. Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako tuba 1-1.</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td>Część mieszaniny reakcyjnej EXPAR. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.</td></tr><tr><td>EXPAR mieszanina reakcyjna</td><td>Aptagen, LLC</td><td>N/A</td><td>0,44 mM dNTPs, 0,38 &mu; M P3tQ49, 0,38 &mu; M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 i mu; g / ml BSA, 0,0635 % Tween 20, Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td>Zawieszony w DMF do końcowego stężenia 25 uM. Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rura 3-1.</td></tr><tr><td>Izotermiczny bufor amplifikacyjny</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537SVIAL</td><td>W połączeniu z 2 μl 10x buforu 3,1 i 27,5 i mikro; L wody wolnej od nukleaz do wytworzenia 1,11x buforu EXPAR w EXPAR Mix. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-2.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Amresco (VWR)</td><td>E525-500ML</td><td>Kofaktor rybozymu Hammerhead, niezbędny do samodzielnego rozszczepienia. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 1-3.</td></tr><tr><td>Termocykler MJ PTC-100</td><td>MJ Research, Inc.</td><td>PTC-100</td><td>Termocykler do kontroli temperatur inkubacji. Można użyć dowolnego termocyklera lub gorącego bloku.</td></tr><tr><td>N, N-dimetyloformamid (DMF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056-100ML</td><td>Służy do ponownego zawieszenia heminy i maksymalizacji okresu przydatności do spożycia w zamrażarce. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 3-1.</td></tr><tr><td>Mieszanka niktazy-polimerazy</td><td>Aptagen, LLC</td><td>N/A</td><td>NT.BstNBI (9.375 jednostek/&mu; L) i polimeraza DNA Bst 2,0 (0,5 jednostki/&mu; L). Dostarczany w zestawie demonstracyjnym apta-beacon jako rura 2-1.</td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0607S</td><td>Enzym nacinający umożliwiający ciągłą amplifikację izotermiczną. Część mieszanki niknazy i polimerazy, przygotowana w temperaturze 0,5 U/uL. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 2-1.</td></tr><tr><td>Bufor kinazy T4 New</td><td>England Biolabs</td><td>B0201SVIAL</td><td>Bufor dla enzymu niezbędnego do usuwania cyklicznego fosforanu. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 1-4.</td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td>Usuwa cykliczne fosforany po rozszczepieniu, aby umożliwić produktowi rozszczepienia przygotowanie reakcji amplifikacji izotermicznej. Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako probówki PCR.</td></tr><tr><td>Tecan GENios FL</td><td>Tecan</td><td>Genios-FL TWT</td><td>Czytnik płytek do pomiaru sygnału absorbancji z wyników kroku 3.</td></tr><tr><td>Theophylline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633-50G</td><td>Cel aptamerowy, przygotowany z wodą wolną od nukleaz. Dostarczany w zestawie demonstracyjnym Apta-beacon jako rurka 1-2.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB14043-01000</td><td>Aptamer binding buffer. Część zestawu demonstracyjnego Apta-beacon Tube 1-4.</td></tr></tbody></table>

wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej g-quadruplex

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamery to cząsteczki rozpoznające cele, które wiążą się z wysokim powinowactwem i specyficznością. Cechy te można wykorzystać do kontrolowania innych cząsteczek ze zdolnością generowania sygnału. W przypadku opisanego tutaj systemu, rozpoznawanie celu za pomocą domeny aptamerycznej, Stem II zmodyfikowanego rybozymu młota, aktywuje samorozszczepiający się rybozym poprzez stabilizację początkowo nieustrukturyzowanego konstruktu. Cis-rozszczepiający RNA działa na styku łodygi III i łodygi I, tworząc dwa produkty rozszczepienia. Dłuższy produkt rozszczepienia przygotowuje izotermiczną reakcję wykładniczej amplifikacji (EXPAR) dwóch podobnych katalitycznie aktywnych G-kwadrupleksów. Te powstałe produkty amplifikacji katalizują redukcję peroksydazy, która jest sprzężona z redukcją substratu kolorymetrycznego z wyjściem, które można wykryć gołym okiem. 3-częściowy system opisany w niniejszym badaniu ulepsza metody wykrywania, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), wytwarzając wizualnie wykrywalny sygnał wskazujący na obecność teofiliny już o 0,5 μM w ciągu zaledwie 15 minut.

Przedstawiona platforma detekcyjna w Rycina 1 przekształca rozpoznawanie celu przez aptamer w wyraźne wizualnie różnice między preparatami próbek (cel a brak celu, Rycina 2) w krótkim czasie. Rybozym allosteryczny zidentyfikowany przez zespół Soukupa i wsp.5 posłużyło jako punkt wyjścia do stworzenia sekwencji o niższym poziomie szumów, wykazującej odpowiedź na próbkę docelową w stosunku do próbki kontrolnej i negatywnej. Zoptymalizowany ...

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Metoda ta oferuje sposób na wzmocnienie sygnału ze zdarzeń wiązania do postaci, która jest wykrywalna wizualnie przy niskim zużyciu zasobów lub może być określona ilościowo za pomocą oprzyrządowania opartego na absorbancji. Jest to stosunkowo szybki, jednoetapowy protokół do określenia obecności celu aptamera w próbce będącej przedmiotem zainteresowania. Wyniki można porównać ze standardową krzywą kalibracyjną, jeśli pożądane jest określenie ilościowe.Osoby muszą być bardzo precyzyjne podczas przenoszenia i mieszania roztworów, ponieważ niewystarczające wymieszanie doprowadzi do negatywnych wyników. Upewnij się również, że odczynniki i roztwory są przechowywane w chłodzie do czasu użycia, aby zminimalizować sygnał tła. Rozpocznij od aktywacji produktów rozszczepienia rybozymu poprzez dodanie pięciu jednostek kinazy polinukleotydowej T4 w probówce PCR.Następnie dodaj jeden mikrolitr wstępnie przygotowanego buforu rybozymu 5X do każdej probówki z próbką. Aby wizualnie zademonstrować specyficzność, dodaj 1,5 mikrolitra dwumilimolowej teofiliny lub dwóch milimolowych kofein do każdej probówki jako próbki testowe i dokładnie wymieszaj każdą próbkę, pipetując od pięciu do 10 razy. Następnie dodaj dwa mikrolitry 600 nanomolowego RNA zawierającego specyficzną dla celu domenę aptameryczną do każdej probówki z próbką, a następnie pipetuj w celu szybkiego wymieszania składników.Teraz umieść rurkę na zimnym bloku, aby zminimalizować sygnał tła. Po przygotowaniu wszystkich probówek reakcyjnych inkubować każdą próbkę w temperaturze pokojowej dokładnie przez trzy minuty. Pod koniec inkubacji należy natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodzie.Dodaj 3,5 mikrolitra mieszaniny enzymów polimerazy kazazy do każdej probówki z próbką i dobrze wymieszaj. Następnie dodać 31,5 mikrolitra mieszaniny reakcyjnej EXPAR zawierającej nukleotydy matrycowe i bufor reakcyjny do każdej probówki z próbką i wymieszać pipetując. Po przygotowaniu wszystkich próbek należy inkubować przygotowaną próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez pięć minut za pomocą timera.Po inkubacji natychmiast umieścić probówki z próbkami w lodzie. Dodaj dwa mikrolitry roztworu heminy do każdej probówki z próbką w celu opracowania koloru i dobrze wymieszaj. Następnie dodaj 58 mikrolitrów dostępnego w handlu roztworu TMB do każdej probówki z próbką, dobrze wymieszaj i inkubuj w celu uzyskania koloru.Odczytać próbki jakościowo na oko lub określić ilościowo wyniki za pomocą czytnika płytek absorbancyjnych, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Zoptymalizowany konstrukt jest w stanie rozpoznać zaledwie 500 nanomolowych teofilin w ciągu 30 minut. Preparaty próbek wystawione na działanie celu mają niebieski kolor, podczas gdy próbki niezawierające celu pozostają bezbarwne.Krzywa wzorcowa została przygotowana na podstawie sygnału zmierzonego w A450 po 30 minutach wywoływania koloru. Ważne jest, aby trzymać próbki na lodzie, gdy nie przeprowadza się inkubacji, ponieważ nawet zoptymalizowane RNA nadal będzie wykazywać niski poziom aktywności tła.

aptamer-based-target-detection-facilitated-3-stage-g-quadruplex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji starożytnego DNA, którą wykorzystaliśmy do rekonstrukcji kompletnych genomów mitochondrialnych pięciu osobników neandertalczyków. Porównanie tych sekwencji z genomami współczesnych ludzi sugeruje, że neandertalczycy przez długi czas charakteryzowali się niską efektywną wielkością populacji.

Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Źródło: Barber, A. E., et al. Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje wykrywanie określonych analitów za pomocą biosensora bakteryjnego. Pobiera się kulturę bakteryjną zawierającą plazmid z genem białka czerwonej fluorescencji (RFP) pod promotorem wrażliwym na analit. Po dokładnym wytarciu powierzchni testowej niewielką część chusteczki zanurza się w kulturze i...

Wykrywanie docelowego analitu za pomocą biosensora bakteryjnego

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie premiksowanej, liofilizowanej amplifikacji izotermicznej opartej na rekombinazie i reakcji opartych na Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), które mogą być wykorzystane do wykrywania biomarkerów kwasów nukleinowych patogenów chorób zakaźnych lub innych markerów genetycznych.

Diagnostyka oparta na CRISPR w miejscu opieki nad pacjentem z wstępnie zmieszanymi i liofilizowanymi odczynnikami

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.

Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Poznaj szybką metodę wykrywania teofiliny opartą na aptamerach z izotermiczną amplifikacją sygnału. Protokół umożliwia wizualną lub spektrofotometryczną detekcję w jednej probówce.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Przeglądaj więcej filmów