Name: Kwantyfikacja i analiza komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Poznaj protokół kwantyfikacji komórek B mięśnia sercowego za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda zwiększa wydajność izolacji i zmniejsza zmienność wyników, umożliwiając dokładną analizę immunologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantów NHLBI 5K08HLO145108-03 i 1R01HL160716-01 przyznanych Luigiemu Adamo.
Cytometr przepływowy Aurora użyty do opracowania tego badania został sfinansowany przez NIH Grant S10OD026859. Dziękujemy za wsparcie rdzenia cytometrii przepływowej JHU Ross.

Wszystkie eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone za zgodą IACUC w Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj bufor FACS zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
	<li>Upewnij się, że jest wystarczająca ilość CO2 do eutanazji zwierząt.</li>
	<li>Przygotuj miejsce do preparacji (umieść podkładkę pod ławkę i umieść taśmę i narzędzia do preparowania w pobliżu).</li>
	<li>Oznacz probówki o pojemności 15 ml, umieść 3 ml HBSS z wapniem i magnezem w każdej probówce (patrz Tabela materiałów) i umieść je na lodzie (jedna probówka na serce i dodatkowa dla grupy referencyjnej/kontroli cytometrii przepływowej). Napełnij również małe (35 mm) szalki Petriego HBSS.</li>
	<li>Włączyć wytrząsarkę z regulowaną temperaturą, ustawić ją na 37 °C i wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przygotować pompę strzykawkową i ustawić natężenie przepływu na 3 ml/min. Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml HBSS, zalej przewód probówki buforem i usuń wszelkie pęcherzyki.</li>
</ol>
2. Wewnątrznaczyniowe barwienie komórek B (in vivo)
<ol>
	<li>Zważ 12-tygodniowego samca myszy szczepu C57BL/6J. Załadować strzykawkę insulinową o pojemności 3/10 ml ze 100 μl rozcieńczenia przeciwciała B220 (1:10, w PBS). Przykryć strzykawkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Znieczul jedną mysz.
	<ol>
		<li>Zastosować iniekcję dootrzewnową 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 400 mg/kg i odczekać 10-20 min. 
		UWAGA: Monitoruj oddech i ruch myszy. Gdy mysz przestanie się poruszać, stymuluj ból, szczypiąc palec u nogi; Brak odruchu odstawienia wskazuje na odpowiednie znieczulenie.</li>
		<li>Jeśli odpowiednie znieczulenie nie zostanie osiągnięte w ciągu 20 minut, można podać dodatkową dawkę środka znieczulającego w dawce 100 mg/kg, a co 5 minut należy dokonywać oceny kinetyki myszy, odruchu odstawienia i oddychania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz na stole laboratoryjnym na podkładce ławkowej pochylonej w jedną stronę, delikatnie pociągnij skórę pleców i lekko dociśnij ciało do ławki, aby oko wystawało.</li>
	<li>Wstrzyknąć rozcieńczone przeciwciało B220 z kroku 2.1 przez wstrzyknięcie zaoczodołowe.
	<ol>
		<li>Wprowadzić strzykawkę do oka pod kątem 45° od płaszczyzny strzałkowej głowy myszy. Powoli wstrzykiwać roztwór. Jeśli wyczuwalny jest opór, wyjąć strzykawkę i wprowadzić ją ponownie. Poczekaj 2 min. 
		UWAGA: Wydłużony czas inkubacji zagroziłby zdolności do rozróżnienia wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych komórek B, ponieważ dałby czas wstrzykniętemu przeciwciału na dyfuzję poza naczynia krwionośne. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji zgodnie z przepisami IACUC.
	<ol>
		<li>Otwórz przepływ CO2 do komory eutanazyjnej z szybkością 0,5 l/min lub zalecanym natężeniem przepływu w zależności od wielkości komory.</li>
		<li>Umieść mysz w komorze na zalecany czas, upewniając się, że już nie oddycha. Usuń go i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną metodę eutanazji.</li>
		<li>Gdy mysz zostanie poddana eutanazji, natychmiast przystąp do pobierania narządów i perfuzji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kolekcja serc
<ol>
	<li>Otwór na klatkę piersiową.
	<ol>
		<li>Przytrzymaj skórę myszy kleszczami w okolicy nadbrzusza. Wykonaj 2 mm otwór w skórze za pomocą nożyczek i użyj kleszczy, aby odkleić skórę, aby odsłonić warstwę powięzi, błyszczącą, półprzezroczystą warstwę klatki piersiowej i brzucha. Przeciąć w epigastrze przez powięź i otrzewną, aby otworzyć ścianę brzucha i odsłonić wyrostek mieczykowaty. Zacisnąć wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy hemostatycznych.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie przez ścianę klatki piersiowej na poziomie linii środkowej obojczyka z każdej strony i podnieś przednią ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić zawartość śródpiersia, używając kleszczy hemostatycznych jako ciężaru, aby utrzymać otwór.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja i ekstrakcja serca.
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy usuń tłuszcz lub tkankę grasicową otaczającą serce.</li>
		<li>Trzymaj aortę bezpiecznie od tyłu za pomocą kleszczy. Wprowadzić igłę strzykawki (25 G) do wierzchołka serca. Ukrwić z 3 ml HBSS z szybkością 3 ml/min. 
		UWAGA: Monitoruj perfuzję. Wątroba powinna się wypełnić, a krew w naczyniach wieńcowych powinna zostać całkowicie usunięta. Zaleca się stosowanie pompy strzykawkowej skalibrowanej na 1 ml / minutę w celu utrzymania stałego przepływu.</li>
		<li>Przetnij aortę nożyczkami i wyjmij serce. Umyj serce na szalce Petriego za pomocą HBSS, aby usunąć pozostałą krew. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń tłuszcz, tkankę łączną i grasicę, a następnie osusz serce. Zważ izolowane serce i zanotuj wagę w miligramach . Zmiel serce w temperaturze pokojowej na małe kawałki (1-2 mm) za pomocą ostrza. 
		UWAGA: Serca dorosłych myszy mogą ważyć od 0,090 do 0,210 mg.</li>
		<li>Zmierz masę tkanki serca i umieść 60 mg mielonego serca do wytrawienia w probówce o pojemności 15 ml z 3 ml HBSS. Zachować pozostałą tkankę serca i umieścić w probówce z napisem "Referencyjna tkanka kontrolna"; Zostanie to wykorzystane do kontroli kompensacji sygnału żywego i martwego oraz autofluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Trawienie serca i barwienie komórek
<ol>
	<li>Dodać enzymy do każdej probówki zawierającej tkankę mieloną (patrz Tabela 1). Dodać 0,5 μl / mg DNazy 1 (300 jednostek na 60 mg tkanki serca), 0,5 μl / mg kolagenazy II (625 jednostek na 60 mg tkanki serca) i 0,2 μl / mg hialuronidazy (50 jednostek na 60 mg tkanki serca) do probówki.</li>
	<li>Umieścić reakcję trawienia w wytrząsarce na 30 minut przy 300 obr./min. Ustaw ruszt wytrząsarki pod kątem około 25°.</li>
	<li>Dodać 7 ml HBSS do każdej z 15 ml probówek reakcyjnych i wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C z przyspieszeniem i łamaniem ustawionym na umiarkowane lub wolne. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 5 ml buforu do lizy ACK w celu usunięcia czerwonych krwinek. Inkubować w buforze do lizy ACK przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 10 ml PBS do każdej probówki, wymieszaj, a następnie przefiltruj do probówki o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 40 μm. Upewnij się, że wszystkie zanieczyszczenia znajdują się w komorze filtra. Rozbij wszelkie zanieczyszczenia na filtrze za pomocą tłoka strzykawki, aż zostanie całkowicie zawieszony w komorze filtra.</li>
	<li>Dodawać PBS przez filtr, aż objętość osiągnie 25 ml na serce; umożliwi to przejście zawieszonych komórek przez filtr. Dodać dodatkowe 25 ml PBS do referencyjnej probówki z tkankami kontrolnymi i podzielić objętość na różne probówki (po 25 ml każda). Oznacz jedną z probówek jako "Niepoplamioną", a drugą jako "Żywe-martwe". Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W tym momencie przygotuj rozcieńczenie do żywej martwej plamy (rozcieńczenie: 1:500 w 1x PBS).</li>
	<li>Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić osad w niebarwionej probówce w 100 μl PBS, a każdy z pozostałych granulek w 100 μl rozcieńczonej żywej martwej plamy. Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności, przykrywając wiadro z lodem folią aluminiową.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu FACS do każdej próbki i przenieść ją do oznakowanej probówki FACS przez filtr 40 μm. Odwirować probówki FACS o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 500 μl buforu FACS.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu blokującego Fc (patrz Tabela 1) do każdej probówki, z wyjątkiem probówek niebarwionych i żywych. Wymieszać i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu mieszaniny przeciwciał (patrz tabela 1) do każdej probówki, z wyjątkiem probówek niebarwionych i żywych trupów, i inkubować przez 30 minut w ciemności, przykrywając wiadro z lodem folią aluminiową.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu FACS do każdej probówki i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 300-500 μl buforu FACS.</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Konfiguracja ustawień sterowania instrumentem. 
	UWAGA: W tym protokole próbka jest analizowana za pomocą 4-laserowego cytometru przepływowego Cytek Aurora. Inny odpowiedni cytometr przepływowy może być użyty do wykrycia markerów będących przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu (patrz Tabela materiałów). W górnej części okna wybierz zakładkę Przejęcie i kliknij Nowy +. Zostanie wyświetlone okno o nazwie Utwórz nowy eksperyment.</li>
		<li>W sekcji Biblioteka, w polu Typ do filtrowania wpisz PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 i Zombie Aqua, klikając przycisk Dodaj po wpisaniu każdego z nich. Nazwy fluoroforów powinny być widoczne po prawej stronie. Następnie kliknij przycisk Dalej, aby przejść do zakładki Grupa.</li>
		<li>Na karcie Grupa kliknij symbol z rurą, aby dodać serce do analizy.</li>
		<li>Kliknij grupę + Referencja, a wyświetli się okno. W kolumnie znacznika fluorescencyjnego wybierz Zombie Aqua, a w kolumnie typu kontrolki wybierz Komórki, a następnie kliknij przycisk Zapisz.</li>
		<li>Kliknij Dalej> zakładkę Znaczniki; zostanie wyświetlona tabela z nazwami fluoroforów. Wpisz odpowiedni marker komórkowy w pierwszym wierszu każdej kolumny fluoroforowej i wpisz Enter: CD45 dla PerCP-Cy5.5; CD19 dla BV421; CD11b dla Alexa Fluor 700; B220 dla PE; i żywe trupy dla Zombie Aqua.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie przycisk Dalej, aby przejść do karty Pozyskiwanie. W polu Zdarzenia do zarejestrowania grupy eksperymentalnej wpisz 10 000 000, a w tym samym polu dla grupy referencyjnej wpisz wiersz 200 000. Kliknij Zapisz i otwórz. Pozostałe ustawienia powinny pozostać domyślne: Czas zatrzymania do 10 000 i Zatrzymanie głośności do 3 000.</li>
		<li>W lewym dolnym rogu kliknij Sterowanie instrumentem. Ustaw napięcie na FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Następnie wybierz kontrolkę Pozyskiwanie. W przypadku opcji Natężenie przepływu wybierz opcję Wysokie z menu rozwijanego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać próbki referencyjne za pomocą cytometru i rozmieszać w oprogramowaniu.
	<ol>
		<li>Spłukać niezabarwioną rurkę serca i umieścić ją bezpiecznie na porcie do wstrzykiwania próbki (SIP). Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę, a następnie kliknij przycisk Start w panelu sterowania akwizycją oprogramowania cytometru i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane. Zrób to samo z żywą martwą tkanką serca.</li>
		<li>Wybierz menu Unmix i ustaw następujące elementy sterujące:
		<ol>
			<li>Zaznacz pola wyboru PE, PerCP-Cy5.5, BV421 i Alexa Fluor 700 w kolumnie z biblioteki. Upewnij się, że pole Zombie Aqua nie jest zaznaczone w tej samej kolumnie. Na dole zaznacz opcję Autofluorescencja jako znacznik fluorescencyjny.</li>
			<li>Kliknij przycisk Dalej, aby przejść do karty Identyfikuj populacje pozytywne/negatywne. W tej zakładce zostanie wyświetlony wykres FSC-A vs. SSC-B-A. Kliknij i przeciągnij punkty wielokąta, aby zaznaczyć obszar o wysokości od 1,0 m do 4,0 m na osi FSC-A oraz od 0,2 m do 3,0 m na osi SSC-B-A.</li>
			<li>Na następnym wykresie po prawej stronie V5-A zostanie wyświetlony na osi X. Przesuń bramki, aby wybrać połowę piku po prawej stronie jako dodatnią, a region po lewej stronie wykresu jako ujemny. Na wykresie zatytułowanym Grupa odniesienia — niebarwiona wybierz populację w podobnym zakresie. W tym celu nie trzeba ustawiać niezabarwionego dodatnio-ujemnego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek eksperymentalnych.
	<ol>
		<li>Dla każdej probówki zawierającej próbkę dla pojedynczej myszy, należy wymieszać rurkę i umieścić ją bezpiecznie na SIP. Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę, a następnie kliknij przycisk Start w panelu sterowania akwizycją oprogramowania cytometru i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strategia bramkowania.
	<ol>
		<li>Wybierz kartę Domyślny arkusz niemieszany. Utwórz wykres FSC-A i SSC-A za pomocą narzędzia Wykres punktowy na górze. Wybierz zdarzenia wyższe niż 0,4 m na osi FSC-A i wyższe niż 0,8 m na osi SSC-A za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów. Kliknij dwukrotnie w tym zaznaczeniu, a zostanie wyświetlony nowy wykres.</li>
		<li>Na nowo utworzonym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi X i wybierz AF-A; kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi Y i wybierz opcję Żywa plama. Kliknij narzędzie do zaznaczania prostokąta u góry i zaznacz wszystkie zdarzenia poniżej 105 na osi żywe-martwe, które odpowiadają dolnemu sygnałowi żywe-martwe. Kliknij dwukrotnie w tym zaznaczeniu, a zostanie wyświetlony nowy wykres.</li>
		<li>Na nowym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać PerCP-Cy5.5-A dla osi X i SSC-A dla osi Y. Korzystając z narzędzia Zaznaczanie prostokąta, zaznacz zdarzenia wyższe niż 104 na osi PerCP-Cy5.5-A, które odpowiadają dodatnim komórkom CD45. Kliknij dwukrotnie na zaznaczenie, a wyświetli się nowy wykres.</li>
		<li>Na nowym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać FSC-A dla osi X i FSC-H dla osi Y. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów wybierz zdarzenia, które podążają za trendem, w których wartość FSC-A i wartość SSC-A są takie same; Dzięki temu dublety komórkowe zostaną usunięte, a populacja w zaznaczeniu będzie określana jako populacja CD45+. Kliknij dwukrotnie zaznaczenie, aby wyświetlić nową działkę z populacją CD45+.</li>
		<li>Na wykresie populacji CD45+ kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać BV421 na osi X vs. SSC-A na osi Y. Za pomocą narzędzia Wybór wielokąta wybierz populację po prawej stronie osi BV421. To jest populacja komórek B. Kliknij dwukrotnie dwukrotnie w tej populacji, aby utworzyć dwa nowe wykresy z populacją komórek B.
		<ol>
			<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby skonfigurować pierwszy wykres komórek B z PE-A na osi X i BV421-A na osi Y. Populacja po prawej stronie odpowiada wewnątrznaczyniowym komórkom B, a populacja po lewej reprezentuje śródmiąższowe komórki B. Użyj narzędzia Zaznaczanie wielokątów, aby zaznaczyć oba te elementy.</li>
			<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby skonfigurować drugi wykres komórek B z Alexa Fluor 700-A na osi X i SSC-A na osi Y. Populacja po lewej odpowiada komórkom CD11b, a zdarzenia po prawej (jeśli występują) odpowiadają komórkom CD11b +.</li>
			<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy każdy wybór, a następnie kliknij Właściwości bramy. Kliknij pozycję Liczba i % elementu nadrzędnego, aby wyświetlić rozmiary i wartości procentowe. Rejestruj liczbę zdarzeń i wartości procentowe w celu dalszej analizy danych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li>
<li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li>
<li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li>
<li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li>
<li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2%28-%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li>
<li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta%281%29-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li>
<li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li>
<li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).</li>
<li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li>
<li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%28gamma%29+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li>
<li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li>
<li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li>
<li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+knowledge+on+aetiology%2C+diagnosis%2C+management%2C+and+therapy+of+myocarditis%3A+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis%2C+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%3A+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li>
<li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li>
<li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction%3A+an+experimental+medicine+safety+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li>
<li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4%2B+T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li>
</ol>

Luigi Adamo jest współzałożycielem i-Cordis, LLC, firmy zajmującej się opracowywaniem cząsteczek immunomodulujących do leczenia niewydolności serca, ze szczególnym zainteresowaniem pochodnymi pirfenidonu, leku modulującego limfocyty B. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Coraz więcej dowodów wskazuje, że limfocyty B odgrywają ważną rolę w kontekście fizjologii mięśnia sercowego i przebudowy/adaptacji mięśnia sercowegodo urazu 7,8,9,10,11,12,13,36. Cytometria przepływowa jest doskonałym narzędziem do badania populacji komór...

Limfocyty B to wysoce wyspecjalizowane komórki odpornościowe, które odgrywają ważną rolę zarówno w adaptacyjnych, jak i wrodzonych odpowiedziach immunologicznych1. Istnieją dwie główne populacje komórek B: mniejsza populacja komórek B1, które są w większości wytwarzane podczas życia embrionalnego, oraz przeważająca populacja komórek B2, które są wytwarzane w dorosłym życiu w szpiku kostnym1. Po dojrzewaniu w szpiku kostnym limfocyty B migrują do pierwotnych i wtórnych narządów limfatycznych. Stamtąd nieprzerwanie krążą między narządami limfatycznymi, przemieszczając się przez naczynia krwionośne i naczynia limfatyczne2. Limfocyty B wyrażają na swojej powierzchni specyficzne przeciwciała, które działają jako receptory. Kiedy limfocyty B napotykają antygen, który wiąże się z ich receptorem, może zostać wyzwolony sygnał aktywujący. Aktywowane limfocyty B albo migrują do tkanki, w której znaleziono antygen, albo wracają do szpiku kostnego, gdzie mogą dojrzeć do komórek plazmatycznych wytwarzających przeciwciała3,4.
Ostatnio doceniono, że w sercu znajduje się spora populacja komórek B. Badania na gryzoniach wykazały, że limfocyty B kolonizują serce we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego5, oraz że komórki B związane z mięśniem sercowym są w większości wewnątrznaczyniowymi, naiwnymi komórkami B2 przylegającymi do śródbłonka6,7, z niewielkim procentem komórek B17. Nadal istnieje wiele obszarów niepewności, ale dostępne dane wskazują, że limfocyty B odgrywają ważną rolę zarówno w nieleczonym sercu, jak i w kontekście adaptacji mięśnia sercowego do urazu.
Badania na naiwnym mysim sercu wykazały, że na początku badania komórki B mięśnia sercowego są głównie zlokalizowane w przestrzeni wewnątrznaczyniowej, przylegającej do śródbłonka (>95% mysich komórek B serca stwierdzono zlokalizowane w przestrzeni wewnątrznaczyniowej). Stwierdzono, że te limfocyty B mają wzorce ekspresji genów inne niż te z krążących komórek B wyizolowanych z krwi obwodowej. Analiza naiwnych serc od zwierząt z niedoborem komórek B i kontroli syngenicznej wykazała, że zwierzęta pozbawione komórek B miały mniejsze serca i wyższą frakcję wyrzutową6. Wszystkie te dowody sugerują, że limfocyty B mogą modulować wzrost mięśnia sercowego i / lub funkcję mięśnia sercowego, i że nie tylko śródmiąższowe, ale także wewnątrznaczyniowe komórki B mogą być odpowiedzialne za takie obserwacje. Stwierdzono również, że limfocyty B modulują fenotyp makrofagów rezydujących w mięśniu sercowym8.
Kilka badań wykazało, że limfocyty B odgrywają ważną rolę w kontekście adaptacji mięśnia sercowego do urazu8,9,10,11,12,13. Limfocyty B gromadzą się przejściowo w uszkodzonym sercu, prawdopodobnie poprzez mechanizm zależny od CXCL13-CXCR511,13. Stamtąd limfocyty B sprzyjają niekorzystnej przebudowie serca poprzez kilka mechanizmów, które obejmują rekrutację monocytów za pośrednictwem cytokin9,12. Ponadto limfocyty B mogą wytwarzać przeciwciała przeciwko białkom serca, które mogą sprzyjać rozszerzaniu się uszkodzenia serca i niekorzystnej przebudowie serca poprzez kilka mechanizmów14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25. Limfocyty B mogą również wywierać działanie ochronne na uszkodzone serce poprzez wydzielanie IL-1010.
Wraz ze wzrostem liczby grup badających rolę limfocytów B w naiwnym i uszkodzonym sercu, coraz ważniejsze staje się zdefiniowanie wspólnych protokołów, aby prawidłowo określić ilościowo i ocenić komórkę B mięśnia sercowego, a tym samym uniknąć niespójności, które już zaczęły pojawiać się w literaturze. Do tej pory doniesiono, że limfocyty B są jednymi z najbardziej rozpowszechnionych komórek odpornościowych w sercu gryzoni7 i są obecne znacznie rzadziej niż komórki szpikowe26,27, lub są dość rzadkie28. Podobnie, kilka grup opisało, że liczba komórek B mięśnia sercowego wzrasta po ostrym niedokrwiennym uszkodzeniu mięśnia sercowego7,9,13, ale jedna grupa nie zgłosiła żadnych zmian w liczbie limfocytów B uszkodzonego mięśnia sercowego29. Badania na komórkach odpornościowych serca rzadko podają szczegóły dotyczące warunków perfuzji i nie ma zgody co do warunków trawienia. Ponieważ w sercu gryzoni duża część limfocytów B jest wewnątrznaczyniowa, a ekstrakcja komórek odpornościowych z mięśnia sercowego jest w dużym stopniu zależna od zastosowanej metody trawienia, różnice opisane w literaturze mogą być wynikiem różnic w perfuzji narządowej i trawieniu tkanek.
Przedstawiona tutaj jest szczegółowa metoda ilościowego oznaczania mysich komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej, która maksymalizuje wydajność odzyskiwania komórek B poprzez optymalizację warunków perfuzji i trawienia oraz pozwala na rozróżnienie wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych komórek B mięśnia sercowego6. Ten protokół jest adaptacją i optymalizacją innych podobnych protokołów, które rozróżniają wewnątrznaczyniowe i śródmiąższowe komórki odpornościowe28,30,31.
W tym protokole standaryzujemy perfuzję mięśnia sercowego, aby wyeliminować limfocyty B unoszące się w przestrzeni wewnątrznaczyniowej bez usuwania biologicznie istotnych komórek B przylegających do śródbłonka mikronaczyniowego. Ponadto, opierając się na wcześniejszych protokołach, które opisywały stosowanie dożylnego wstrzykiwania przeciwciał w celu odróżnienia wewnątrznaczyniowych od śródmiąższowych komórek odpornościowych32, i wykorzystując fakt, że limfocyty B wyrażają marker powierzchniowy B22033, pokazujemy, jak odróżnić wewnątrznaczyniowe i zewnątrznaczyniowe komórki B mięśnia sercowego poprzez donaczyniowe wstrzyknięcie przeciwciała specyficznego dla B220 bezpośrednio przed uśmierceniem zwierzęcia i sercem Perfuzji. Protokół ten jest istotny dla badań każdego naukowca zainteresowanego włączeniem analizy limfocytów B mięśnia sercowego w naiwnym i uszkodzonym sercu. Powszechne wdrożenie tego protokołu zmniejszy niespójności między grupami badawczymi, umożliwi analizę zmian w wewnątrznaczyniowych i zewnątrznaczyniowych pulach komórek B mięśnia sercowego, a tym samym przyczyni się do postępu odkryć w dziedzinie immunologii serca.
Podsumowując, protokół przedstawia zoptymalizowany przepływ pracy do ilościowego oznaczania i analizy komórek B mięśnia sercowego za pomocą cytometrii przepływowej, a jednocześnie rozróżniania komórek znajdujących się w przestrzeni pozanaczyniowej i wewnątrznaczyniowej.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 przeciwciało przeciw myszy/ludzkiemu CD11b</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro; G 200 &MIKRO; L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) Sitko do komórek, 40 & mikro; m, Niebieskie</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Naturalna probówka do mikrowirówek</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań, USP</td><td>114-055-101</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>0,90%</td></tr><tr><td>1,5 ml Naturalna probówka do mikrowirówek</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; l Końcówki filtrujące TipOne z podziałką</td><td>11213810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>1000 i mikro; L Końcówki filtra z podziałką TipOne</td><td>11267810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówka wirówkowa, zatyczka uszczelniająca, polipropylen, 1-drogowy zawór odcinający Corning bez RNaz/DNaz</td><td>430052</td><td></td>, poliwęglanowy SVPT951 ECT Produkcja 2,2,2-tribromoetanolu T48402 Sigma-Aldrich 200 &micro;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L Końcówki filtra TipOne z podziałką</td><td>11208810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy zawór odcinający, poliwęglan</td><td>SVPT953</td><td>ECT Produkcja</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka z okrągłym dnem z polistyrenu, 12 x 75 mm 352054</td><td></td> Falcon, probówka <td>wirówkowa marki</td><td></td>Corning</tr><tr><td>o pojemności 50 ml, zatyczka uszczelniająca, polipropylen, bez RNaz/DNaz</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK ( Bufor lizujący chlorek amonu i potasu</td><td>118-156-101</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>osmolalność: 290 + lub -5% mOsm/kg H20</td></tr><tr><td>Adapter 4x50ml, do wiadra prostokątnego 250 mL w rotorze A-4-63</td><td>5810759005</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adapter do probówek wirówkowych 15 mL, 9 probówek w adapterze, stożkowe dno do użytku z wirnikiem Model A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adapter do 15 rur okrągłodennych 2,6 &ndash; 7 ml, do prostokątnego wiadra 250 ml w Rotor A-4-62</td><td>22638246</td><td>Folia aluminiowa Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Rolka 12 cali x 75' .0007</td> Komora indukcyjna anestezjologiczna <td>UPC 109153</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td></tr><tr><td>- Mysz</td><td>RWD-AICMV-100</td><td>Strzykawka Conduct Science</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer z dołączoną igłą 25 G x 5/8 cala, sterylna, jednorazowego użytku, 1 ml</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Brandzig Ultra-Fine Insulina Strzykawki 29G 1cc 1/2" 100-Pack</td><td>CMD 2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Przeciwciało przeciw myszom CD19</td><td>115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>CAPS do rurek przepływowych z siatką siatkową 35 i mikro; m, Dwupozycyjny do probówek 12 x 75 mm, sterylny</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>Dwutlenek węgla USP E CGA 940&nbsp;</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials Zlewka o niskiej formie, szkło, 500 ml</td><td>UX-34502-46</td><td>Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2</td><td>LS004176</td> Złącze <td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>mosiądz chromowany 1/4" żeński NPT x 1/4" zadzior</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora Cytometr</td><td></td> przepływowy <td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Diss 1080 Nypel 1/4 BARB CP</td><td>M-08-12</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Easypet&nbsp; 3 - Elektroniczny kontroler pipet</td><td>4430000018</td><td>Elektroniczna waga Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>, AX223/E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5810R</td><td>5810R</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Research plus 1-kanałowe</td><td></td> pipety zmienne <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.1</td><td></td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>GLACIERbrand, miska do lodu o potrójnej gęstości (IPAN-3100)</td><td>Z740287</td><td>Heathrow Scientific</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td><td>14025076</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostats, Straight</td><td>13018-14</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>Luer Slip Strzykawka sterylna, jednorazowa, 20 ml</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>McKesson Underpads, Umiarkowany</td><td>4033- CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>Navigator Wielofunkcyjna przenośna waga</td><td>NV2201</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr> PE przeciwciało <tr><td>przeciw myszy/ludzkiemu CD45R/B220</td><td>103208</td><td>BioLegend</td><td>200 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>PerCP/cyjanina 5,5 Przeciwciało przeciw mysim CD45</td><td>103132</td><td>BioLegend</td><td>100 i mikro; g 500 uL</td></tr><tr><td>szalka Petriego, sterylny polistyren 35 mm x 10 mm</td><td>FB0875711YZ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Pkgd: Diss 1080 Nakrętka/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Potężny 6-watowy podwójny oświetlacz LED na gęsiej szyi</td><td>LED-6W</td><td>Igła AmScope</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 25 G x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)</td><td>305122</td><td>BD Becton, Dickinson i spółka</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (mysi blok BD Fc) klon 2.4G2 (RUO)</td><td>553141</td><td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0,5 mg / ml</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td> Żyletki <td>Fundacji R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>9501250000</td><td>Accutec Blades Inc</td><td></td></tr><tr><td>Regulator analityczny dwustopniowy dopływ 0-25 psi CGA320 3500 psi wlot</td><td>Y12244A320-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Rotor A-4-62, z 4 x 250 ml prostokątne wiadra</td><td>Rotor A-4-62</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, zatkana, 10 mL, sterylna, niepirogenna/bez endotoksyn, niecytotoksyczna, 1 szt./blister</td><td>86.1254.001</td><td>Sarstedt AG & Co KG</td><td></td></tr><tr><td>Taśma etykietowa Sigma</td><td>L8394</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo 3.0.0</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Spex VapLock Luer Złączka, PP, Prosta, Męska Luer Lock x 1/8" Króciec węża; 1/EA</td><td>MTLL230-6005</td><td>Spex</td><td></td></tr><tr><td>Std Ścienne rurki laboratoryjne, rozmiar S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Ścianka x 50' Długa</td><td>CG-730-003</td><td>Laboratorium Excelon</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka PP/PE bez igły, 3 ml</td><td>Z683566</td><td>Millipore Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>55-1199 (95-240)</td><td>Aparat</td><td></td>Harvard</tr><tr><td>Thomas 3-kanałowy zegar alarmowy TM10500</td><td>9371W13</td><td></td> Thomas Scientific <td></td></tr><tr><td>Stojak na probówki, 12&nbsp; pozycje, 6 dla 5.0&nbsp; ml oraz 15&nbsp; probówki ml i 6 na 25&nbsp; mL oraz 50&nbsp; Probówki mL, polipropylenowe, pozycje numerowane, do autoklawowania</td><td>30119835</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rack, 12&nbsp; stanowiska, dla 5.0&nbsp; ml oraz 15&nbsp; Probówki mL, polipropylenowe, pozycje numerowane, autoklawowalne</td><td>30119827</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>TYGON R-3603 Rurki laboratoryjne, ID & czasy; Średnica zewnętrzna 1/4 cala i razy; 3/8 cala</td><td>T8913 (Millipore Sigma)</td><td>Tygon, Saint-Gobain</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne VWR z trzpieniem prowadzącym z zakrzywionymi końcówkami</td><td>89259-946</td><td>Avantor, firmy VWR</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne VWR, ostra końcówka, 4&frac12; "</td><td>82027-578</td><td>Avantor, firmy VWR</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna do inkubacji VWR, model 3500I</td><td>12620-946</td><td>Avantor, firmy VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>423102</td><td>BioLegend</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja i analiza komórek b mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Coraz więcej dowodów pokazuje, że limfocyty B odgrywają ważną rolę w kontekście fizjologii mięśnia sercowego i adaptacji mięśnia sercowego do urazu. Jednak w literaturze pojawiają się sprzeczne dane dotyczące częstości występowania limfocytów B mięśnia sercowego. Doniesiono, że limfocyty B są zarówno jednymi z najbardziej rozpowszechnionych komórek odpornościowych w sercu gryzoni, jak i obecnymi, ale znacznie rzadziej niż komórki szpikowe lub są dość rzadkie. Podobnie kilka grup opisało, że liczba komórek B mięśnia sercowego wzrasta po ostrym niedokrwiennym uszkodzeniu mięśnia sercowego, ale jedna grupa nie zgłosiła żadnych zmian w liczbie komórek B uszkodzonego mięśnia sercowego. Wdrożenie wspólnej, powtarzalnej metody oceny częstości występowania komórek B mięśnia sercowego ma kluczowe znaczenie dla harmonizacji obserwacji z różnych grup badawczych, a tym samym promowania postępu w badaniach nad interakcjami komórek B w mięśniu sercowym. Opierając się na naszym doświadczeniu, pozornie kontrastujące obserwacje przedstawione w literaturze prawdopodobnie wynikają z faktu, że mysie komórki B mięśnia sercowego są w większości wewnątrznaczyniowe i połączone ze śródbłonkiem mikronaczyniowym. Dlatego liczba limfocytów B odzyskanych z mysiego serca jest wyjątkowo wrażliwa na warunki perfuzji stosowane do oczyszczania narządu i na zastosowaną metodę trawienia. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który w określony sposób uwzględnia te dwie krytyczne zmienne. Protokół ten umożliwia powtarzalną, opartą na cytometrii przepływowej analizę liczby mysich komórek B mięśnia sercowego i pozwala naukowcom odróżnić pozanaczyniowe i wewnątrznaczyniowe komórki B mięśnia sercowego.

Po zakończeniu akwizycji i zebraniu wszystkich zdarzeń, dane należy przeanalizować zgodnie ze standardową praktyką cytometrii przepływowej. Zakres analizy będzie zależał od indywidualnego celu każdego eksperymentu. W tym przypadku przeprowadzono ilościowe oznaczenie limfocytów B wewnątrz- i zewnąktkankowych, a wynik wyrażono jako liczba komórek na mg tkanki.
Podczas korzystania ze spektralnego cytometru zaleca się rozpoczęcie analizy od wstępnego bramkowania w celu usunięcia debris o rozmiarac...

Tutaj przedstawiamy protokół do kwantyfikacji i różnicowania limfocytów B mięśnia sercowego na podstawie ich lokalizacji w przestrzeni wewnątrznaczyniowej lub śródbłonkowej za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja i analiza komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

W literaturze pojawiają się sprzeczne dane dotyczące częstości występowania limfocytów B mięśnia sercowego. Prawdopodobnie wynika to ze zmienności technik perfuzji i trawienia. Nasz protokół umożliwia odtwarzalną analizę opartą na cytometrii przepływowej na komórkach B mięśnia sercowego.Technika ta maksymalizuje wydajność odzyskiwania limfocytów B i zmniejsza zmienność liczby komórek B wśród komórek B i innych populacji z próbek serca. Ta zoptymalizowana metoda trawienia i izolacji może być łatwo zmodyfikowana w celu wdrożenia rozszerzonego panelu przeciwciał do badania różnych typów komórek odpornościowych w sercu. Protokół może być również stosowany do innych narządów, takich jak płuca lub wątroba, w celu zbadania komórek B związanych z tymi narządami.Na początek zważ 12-tygodniowego samca myszy. Załaduj strzykawkę insulinową o pojemności 310 ml ze 100 mikrolitrami roztworu przeciwciała B220. Wstrzyknąć rozcieńczone przeciwciało B220 przez wstrzyknięcie zaoczodołowe i natychmiast przystąpić do pobrania narządów i perfuzji.Po eutanazji przytrzymaj skórę myszy kleszczami w okolicy nadbrzusza. Wykonaj dwumilimetrowy otwór w skórze za pomocą nożyczek i użyj kleszczy, aby oderwać skórę, aby odsłonić warstwę powięzi. Przeciąć na epigasterii przez powięź i otrzewną.Zacisnąć wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy hemostatycznych. Wykonaj pionowe nacięcie przez ścianę klatki piersiowej na poziomie linii środkowej obojczyka po każdej stronie i podnieś przednią ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić zawartość śródpiersia. Trzymaj aortę bezpiecznie od tyłu za pomocą kleszczy.Wprowadzić igłę strzykawki do wierzchołka serca. Perfuzjowany trzema mililitrami HBSS z szybkością trzech mililitrów na minutę. Przetnij aortę i usuń serce.Umyj serce na szalce Petriego za pomocą HBSS. Zważ izolowane serce i zanotuj wagę w miligramach . Zmiel serce w temperaturze pokojowej na małe kawałki za pomocą ostrza.Kawałki serca powinny mieć rozmiar około 1,5 milimetra. Zmierz masę tkanki serca za pomocą wagi i umieść 60 miligramów mielonego serca do strawienia w 15-mililitrowej probówce na lodzie z trzema mililitrami HBSS. Powtórz ten proces dla myszy, która nie otrzymała wstrzyknięcia przeciwciała B220 i umieść ją w probówce z trzema mililitrami referencyjnej tkanki kontrolnej znakowanej HBSS.Dodaj enzymy do każdej probówki zawierającej tkanki mielone. Dodaj 0,5 mikrolitra na miligram DNazy I, jeden 0,5 mikrolitra na miligram kolagenazy II i 0,2 mikrolitra na miligram hialuronidazy. Umieść reakcję trawienia w wytrząsarce na 30 minut z prędkością 300 obrotów na minutę.Rurki umieszcza się w wytrząsarce pod małym kątem, pod kątem około 25 stopni. Dodać siedem mililitrów HBSS do każdej z 15-mililitrowych probówek reakcyjnych i odwirować przy 250 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po zdekantacji supernatantu ponownie zawiesić każdą osadkę w pięciu mililitrach buforu do lizy ACK.Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 10 mililitrów PBS do każdej probówki, wymieszaj i przefiltruj do 50-mililitrowej probówki z sitkiem o średnicy 40 mikrometrów. Zmiażdż wszelkie zanieczyszczenia na filtrze za pomocą tłoka strzykawki, aby upewnić się, że cały materiał przechodzi przez filtr.Po dodaniu PBS przez filtr, aż objętość osiągnie 25 mililitrów na serce, dodaj dodatkowe 25 mililitrów PBS do referencyjnej probówki z tkanką kontrolną i podziel objętość na dwie różne probówki. Oznacz jedną z probówek jako niepoplamioną, a drugą żywą/martwą. Po odwirowaniu w temperaturze 250 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić niebarwioną probówkę w 100 mikrolitrach PBS, a każdą z pozostałych granulek w 100 mikrolitrach roztworu żywej/martwej barwie.Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. Po dodaniu 500 mikrolitrów buforu FACS do każdej próbki, przenieś ją do probówki FACS przez filtr 40 mikrometrów. Po odrzuceniu probówek FACS o stężeniu 250 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu FACS.Dodaj 50 mikrolitrów roztworu blokującego FC do każdej probówki, z wyjątkiem probówek niebarwionych i żywych/martwych. Wymieszaj i inkubuj przez pięć minut. Po dodaniu 50 mikrolitrów roztworu mieszaniny przeciwciał do każdej probówki, z wyjątkiem niebarwionych i żywych/martwych probówek, inkubować przez 30 minut w ciemności, przykrywając wiadro z lodem folią aluminiową.Podobnie jak w przypadku żywej/martwej plamy, ponownie przemyć 500 mikrolitrami buforu FACS i ponownie zawiesić w 300 do 500 mikrolitrach buforu FACS. Otwórz oprogramowanie sterujące instrumentem. W górnej części okna wybierz zakładkę Przejęcie i kliknij Nowy.W sekcji biblioteki, w polu Typ do filtrowania, wpisz PE, PerCP-Cy5.5, brylantowy fiolet 421, Alexa Fluor 700 i Zombie Aqua, wybierając fluoro-4 i klikając Dodaj po wpisaniu każdego z nich. Następnie kliknij przycisk Dalej, aby przejść do zakładki Grupy. Teraz kliknij symbol z rurką, aby dodać serce do analizy.Kliknij grupę referencyjną, a wyświetli się okno. W kolumnie znaczników fluorescencyjnych wybierz Zombie Aqua jako znacznik fluorescencyjny, usuwając wszystkie inne, klikając czerwoną ikonę kosza obok każdego z nich. Następnie na ikonie Typ formantu wybierz pozycję Komórki.Następnie kliknij Zapisz. Kliknij Dalej. Następnie kliknij kartę Znaczniki.Zostanie wyświetlona tabela. Wpisz odpowiedni znacznik komórki w pierwszym wierszu każdej kolumny fluoro-4 i naciśnij Enter. Kliknij dwukrotnie przycisk Dalej, aby przejść do karty Akwizycja.W polu Zdarzenia do rekordu próbek eksperymentalnych wpisz 10 milionów, a w tym samym polu dla wiersza grupy referencyjnej wpisz 200 000. Kliknij Zapisz i otwórz. W lewym dolnym rogu kliknij Sterowanie instrumentami.Ustaw napięcie na FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Wybierz formant pozyskiwania. W przypadku opcji natężenia przepływu wybierz opcję Wysokie z menu rozwijanego.Odwirować niezabarwioną rurkę serca i umieścić ją bezpiecznie na porcie wstrzykiwania próbki. Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę. Następnie kliknij przycisk Nagraj i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane.Zrób to samo dla żywej/martwej poplamionej tkanki serca. Wybierz menu Rozmieszaj i ustaw elementy sterujące. Zaznacz pole wyboru Autofluorescencja jako znacznik fluorescencyjny.Następnie kliknij przycisk Dalej, aby przejść do zakładki Identyfikuj populacje pozytywne/negatywne. Na tej karcie zostanie wyświetlony wykres obszaru punktowego z przodu w stosunku do bocznego obszaru punktowego. Kliknij i przeciągnij punkty wielokąta, aby zaznaczyć obszar o wielkości od 1 do 4 milionów na przedniej osi obszaru punktowego i od 0,2 do 3 milionów na bocznej osi obszaru punktowego.Na następnym wykresie po prawej stronie V5-A zostanie wyświetlony na osi X. Przesuń bramki, aby wybrać połowę piku po prawej stronie jako dodatnią, a region po lewej stronie wykresu jako ujemny. Na wykresie zatytułowanym Grupa odniesienia — niebarwiona wybierz populację w podobnym zakresie.W przypadku niebarwionych nie wolno wybierać żadnego pozytywu/negatywu. Kliknij przycisk Live Unmixing (Na żywo rozłączanie). Teraz pobierz próbki eksperymentalne, zwiruj probówkę i umieść ją bezpiecznie na SIP.Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę. Następnie kliknij przycisk Record (Nagrywaj) w panelu Acquisition Control (Sterowanie akwizycją) oprogramowania cytometru i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane. Wybierz kartę Domyślny niemieszany arkusz.Utwórz wykres FCS-A i SSC-A za pomocą narzędzia do wykresu kropkowego na górze. Wybierz zdarzenia wyższe niż 0,4 miliona na osi FSC-A i wyższe niż 0,8 miliona na osi SSC-A za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów. Utwórz nowy wykres, klikając dwukrotnie zaznaczenie, a następnie na tym nowym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi Y i wybierz żywą/martwą plamę.Kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi X i wybierz Autofluorescencja A. Zaznacz wszystkie zdarzenia poniżej 10 do piątego na osi żywy/martwy. To są żywe komórki. Kliknij dwukrotnie w tym zaznaczeniu.Na nowym wykresie wybierz PerCP-Cy5.5A dla osi X i SSC-A dla osi Y. Wybierz populacje po prawej stronie PerCP-Cy5.5A. To są komórki odpornościowe.Kliknij dwukrotnie zaznaczenie. Na nowym wykresie wybierz FSC-A dla osi X i wysokość rozproszenia do przodu dla osi Y. Wybierz zdarzenia, które podążają za trendem, w którym wartość FSC-A i wartość SSC-A są takie same.To zaznacza pojedyncze komórki i eliminuje dublety. Kliknij dwukrotnie to zaznaczenie, aby wyświetlić nowy wykres w populacji pojedynczych komórek CD45-dodatnich. Z wykresu populacji pojedynczej komórek CD45-dodatnich wybierz brylantowy fiolet 421 na osi X w porównaniu z SSC-A na osi Y.Wybierz populację po prawej stronie na osi 421 w kolorze jaskrawego fioletu. To jest populacja komórek B. Kliknij dwukrotnie dwukrotnie w tej populacji, aby utworzyć dwa nowe wykresy z populacją komórek B.Ustaw pierwszy wykres komórek B z PEA na osi X i brylantowo fioletowym 421A na osi Y. Populacja po prawej stronie odpowiada międzynaczyniowym komórkom B, a populacja po lewej reprezentuje śródmiąższowe komórki B. Zaznacz oba.Skonfiguruj drugi wykres komórek B z Alexa Fluor 700A na osi X i SSC-A na osi Y. Populacja po lewej stronie odpowiada komórkom CD11b-ujemnym, a zdarzenia po prawej odpowiadają komórkom CD11b-dodatnim. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdą sekcję, a następnie kliknij Właściwości bramy.Kliknij pozycję Liczba i Nadrzędny, aby wyświetlić liczbę zdarzeń i wartości procentowe populacji rodzicielskich. Rejestruj liczbę zdarzeń i wartości procentowe w celu dalszej analizy danych. Oczekuje się, że po usunięciu dubletów w naiwnym, nieuszkodzonym sercu, około 20% komórek CD45-dodatnich będzie limfocytami B CD19-dodatnimi.Spośród tych komórek średnio 5,5% znajduje się w przestrzeni śródmiąższowej. 94,5% znajduje się w przestrzeni wewnątrznaczyniowej. Z całej populacji komórek B znajdujących się w sercu tylko około 1,6% odpowiada komórkom B1 na podstawie markera powierzchniowego CD11b, a pozostałe 98,4% odpowiada komórkom B2.Podczas analizy limfocytów B mięśnia sercowego za pomocą cytometrii przepływowej ważne jest, aby prawidłowo wykonać perfuzję i zmielić serce zgodnie z protokołem. Właściwa filtracja strawionego serca jest również niezbędna, aby zmaksymalizować regenerację komórek odpornościowych.

flow-cytometry-based-quantification-and-analysis-of-myocardial-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Ten film ilustruje rekonstrukcję syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich zastosowanie w ocenie wydajności synaptycznej generowanej przez aktywowane limfocyty T.

Wykorzystanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki do badania wyjścia synaptycznego z limfocytów T

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Ten protokół przedstawia prostą i efektywną metodę izolacji, identyfikacji i ilościowego oznaczania komórek odpornościowych znajdujących się w mięśniu sercowym myszy podczas stanu stacjonarnego lub zapalnego. Protokół łączy trawienie enzymatyczne i mechaniczne w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, która może być dalej analizowana za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i identyfikacja pozanaczyniowych komórek odpornościowych serca

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Poznaj protokół kwantyfikacji komórek B mięśnia sercowego za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda zwiększa wydajność izolacji i zmniejsza zmienność wyników, umożliwiając dokładną analizę immunologiczną.

Kwantyfikacja i analiza komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów