Kwantyfikacja i analiza komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej

W literaturze pojawiają się sprzeczne dane dotyczące częstości występowania limfocytów B mięśnia sercowego. Prawdopodobnie wynika to ze zmienności technik perfuzji i trawienia. Nasz protokół umożliwia odtwarzalną analizę opartą na cytometrii przepływowej na komórkach B mięśnia sercowego.

Technika ta maksymalizuje wydajność odzyskiwania limfocytów B i zmniejsza zmienność liczby komórek B wśród komórek B i innych populacji z próbek serca. Ta zoptymalizowana metoda trawienia i izolacji może być łatwo zmodyfikowana w celu wdrożenia rozszerzonego panelu przeciwciał do badania różnych typów komórek odpornościowych w sercu. Protokół może być również stosowany do innych narządów, takich jak płuca lub wątroba, w celu zbadania komórek B związanych z tymi narządami.

Na początek zważ 12-tygodniowego samca myszy. Załaduj strzykawkę insulinową o pojemności 310 ml ze 100 mikrolitrami roztworu przeciwciała B220. Wstrzyknąć rozcieńczone przeciwciało B220 przez wstrzyknięcie zaoczodołowe i natychmiast przystąpić do pobrania narządów i perfuzji.

Po eutanazji przytrzymaj skórę myszy kleszczami w okolicy nadbrzusza. Wykonaj dwumilimetrowy otwór w skórze za pomocą nożyczek i użyj kleszczy, aby oderwać skórę, aby odsłonić warstwę powięzi. Przeciąć na epigasterii przez powięź i otrzewną.

Zacisnąć wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy hemostatycznych. Wykonaj pionowe nacięcie przez ścianę klatki piersiowej na poziomie linii środkowej obojczyka po każdej stronie i podnieś przednią ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić zawartość śródpiersia. Trzymaj aortę bezpiecznie od tyłu za pomocą kleszczy.

Wprowadzić igłę strzykawki do wierzchołka serca. Perfuzjowany trzema mililitrami HBSS z szybkością trzech mililitrów na minutę. Przetnij aortę i usuń serce.

Umyj serce na szalce Petriego za pomocą HBSS. Zważ izolowane serce i zanotuj wagę w miligramach . Zmiel serce w temperaturze pokojowej na małe kawałki za pomocą ostrza.

Kawałki serca powinny mieć rozmiar około 1,5 milimetra. Zmierz masę tkanki serca za pomocą wagi i umieść 60 miligramów mielonego serca do strawienia w 15-mililitrowej probówce na lodzie z trzema mililitrami HBSS. Powtórz ten proces dla myszy, która nie otrzymała wstrzyknięcia przeciwciała B220 i umieść ją w probówce z trzema mililitrami referencyjnej tkanki kontrolnej znakowanej HBSS.

Dodaj enzymy do każdej probówki zawierającej tkanki mielone. Dodaj 0,5 mikrolitra na miligram DNazy I, jeden 0,5 mikrolitra na miligram kolagenazy II i 0,2 mikrolitra na miligram hialuronidazy. Umieść reakcję trawienia w wytrząsarce na 30 minut z prędkością 300 obrotów na minutę.

Rurki umieszcza się w wytrząsarce pod małym kątem, pod kątem około 25 stopni. Dodać siedem mililitrów HBSS do każdej z 15-mililitrowych probówek reakcyjnych i odwirować przy 250 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po zdekantacji supernatantu ponownie zawiesić każdą osadkę w pięciu mililitrach buforu do lizy ACK.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 10 mililitrów PBS do każdej probówki, wymieszaj i przefiltruj do 50-mililitrowej probówki z sitkiem o średnicy 40 mikrometrów. Zmiażdż wszelkie zanieczyszczenia na filtrze za pomocą tłoka strzykawki, aby upewnić się, że cały materiał przechodzi przez filtr.

Po dodaniu PBS przez filtr, aż objętość osiągnie 25 mililitrów na serce, dodaj dodatkowe 25 mililitrów PBS do referencyjnej probówki z tkanką kontrolną i podziel objętość na dwie różne probówki. Oznacz jedną z probówek jako niepoplamioną, a drugą żywą/martwą. Po odwirowaniu w temperaturze 250 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić niebarwioną probówkę w 100 mikrolitrach PBS, a każdą z pozostałych granulek w 100 mikrolitrach roztworu żywej/martwej barwie

Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. Po dodaniu 500 mikrolitrów buforu FACS do każdej próbki, przenieś ją do probówki FACS przez filtr 40 mikrometrów. Po odrzuceniu probówek FACS o stężeniu 250 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu FACS.

Dodaj 50 mikrolitrów roztworu blokującego FC do każdej probówki, z wyjątkiem probówek niebarwionych i żywych/martwych. Wymieszaj i inkubuj przez pięć minut. Po dodaniu 50 mikrolitrów roztworu mieszaniny przeciwciał do każdej probówki, z wyjątkiem niebarwionych i żywych/martwych probówek, inkubować przez 30 minut w ciemności, przykrywając wiadro z lodem folią aluminiową.

Podobnie jak w przypadku żywej/martwej plamy, ponownie przemyć 500 mikrolitrami buforu FACS i ponownie zawiesić w 300 do 500 mikrolitrach buforu FACS. Otwórz oprogramowanie sterujące instrumentem. W górnej części okna wybierz zakładkę Przejęcie i kliknij Nowy.

W sekcji biblioteki, w polu Typ do filtrowania, wpisz PE, PerCP-Cy5.5, brylantowy fiolet 421, Alexa Fluor 700 i Zombie Aqua, wybierając fluoro-4 i klikając Dodaj po wpisaniu każdego z nich. Następnie kliknij przycisk Dalej, aby przejść do zakładki Grupy. Teraz kliknij symbol z rurką, aby dodać serce do analizy.

Kliknij grupę referencyjną, a wyświetli się okno. W kolumnie znaczników fluorescencyjnych wybierz Zombie Aqua jako znacznik fluorescencyjny, usuwając wszystkie inne, klikając czerwoną ikonę kosza obok każdego z nich. Następnie na ikonie Typ formantu wybierz pozycję Komórki.

Następnie kliknij Zapisz. Kliknij Dalej. Następnie kliknij kartę Znaczniki.

Zostanie wyświetlona tabela. Wpisz odpowiedni znacznik komórki w pierwszym wierszu każdej kolumny fluoro-4 i naciśnij Enter. Kliknij dwukrotnie przycisk Dalej, aby przejść do karty Akwizycja.

W polu Zdarzenia do rekordu próbek eksperymentalnych wpisz 10 milionów, a w tym samym polu dla wiersza grupy referencyjnej wpisz 200 000. Kliknij Zapisz i otwórz. W lewym dolnym rogu kliknij Sterowanie instrumentami.

Ustaw napięcie na FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Wybierz formant pozyskiwania. W przypadku opcji natężenia przepływu wybierz opcję Wysokie z menu rozwijanego.

Odwirować niezabarwioną rurkę serca i umieścić ją bezpiecznie na porcie wstrzykiwania próbki. Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę. Następnie kliknij przycisk Nagraj i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane.

Zrób to samo dla żywej/martwej poplamionej tkanki serca. Wybierz menu Rozmieszaj i ustaw elementy sterujące. Zaznacz pole wyboru Autofluorescencja jako znacznik fluorescencyjny.

Następnie kliknij przycisk Dalej, aby przejść do zakładki Identyfikuj populacje pozytywne/negatywne. Na tej karcie zostanie wyświetlony wykres obszaru punktowego z przodu w stosunku do bocznego obszaru punktowego. Kliknij i przeciągnij punkty wielokąta, aby zaznaczyć obszar o wielkości od 1 do 4 milionów na przedniej osi obszaru punktowego i od 0,2 do 3 milionów na bocznej osi obszaru punktowego.

Na następnym wykresie po prawej stronie V5-A zostanie wyświetlony na osi X. Przesuń bramki, aby wybrać połowę piku po prawej stronie jako dodatnią, a region po lewej stronie wykresu jako ujemny. Na wykresie zatytułowanym Grupa odniesienia — niebarwiona wybierz populację w podobnym zakresie.

W przypadku niebarwionych nie wolno wybierać żadnego pozytywu/negatywu. Kliknij przycisk Live Unmixing (Na żywo rozłączanie). Teraz pobierz próbki eksperymentalne, zwiruj probówkę i umieść ją bezpiecznie na SIP.

Upewnij się, że zielona strzałka wskaźnika wskazuje właściwą próbkę. Następnie kliknij przycisk Record (Nagrywaj) w panelu Acquisition Control (Sterowanie akwizycją) oprogramowania cytometru i poczekaj, aż zdarzenia zostaną zarejestrowane. Wybierz kartę Domyślny niemieszany arkusz.

Utwórz wykres FCS-A i SSC-A za pomocą narzędzia do wykresu kropkowego na górze. Wybierz zdarzenia wyższe niż 0,4 miliona na osi FSC-A i wyższe niż 0,8 miliona na osi SSC-A za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów. Utwórz nowy wykres, klikając dwukrotnie zaznaczenie, a następnie na tym nowym wykresie kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi Y i wybierz żywą/martwą plamę.

Kliknij prawym przyciskiem myszy etykietę osi X i wybierz Autofluorescencja A. Zaznacz wszystkie zdarzenia poniżej 10 do piątego na osi żywy/martwy. To są żywe komórki. Kliknij dwukrotnie w tym zaznaczeniu.

Na nowym wykresie wybierz PerCP-Cy5.5A dla osi X i SSC-A dla osi Y. Wybierz populacje po prawej stronie PerCP-Cy5.5A. To są komórki odpornościowe.

Kliknij dwukrotnie zaznaczenie. Na nowym wykresie wybierz FSC-A dla osi X i wysokość rozproszenia do przodu dla osi Y. Wybierz zdarzenia, które podążają za trendem, w którym wartość FSC-A i wartość SSC-A są takie same.

To zaznacza pojedyncze komórki i eliminuje dublety. Kliknij dwukrotnie to zaznaczenie, aby wyświetlić nowy wykres w populacji pojedynczych komórek CD45-dodatnich. Z wykresu populacji pojedynczej komórek CD45-dodatnich wybierz brylantowy fiolet 421 na osi X w porównaniu z SSC-A na osi Y.

Wybierz populację po prawej stronie na osi 421 w kolorze jaskrawego fioletu. To jest populacja komórek B. Kliknij dwukrotnie dwukrotnie w tej populacji, aby utworzyć dwa nowe wykresy z populacją komórek B.

Ustaw pierwszy wykres komórek B z PEA na osi X i brylantowo fioletowym 421A na osi Y. Populacja po prawej stronie odpowiada międzynaczyniowym komórkom B, a populacja po lewej reprezentuje śródmiąższowe komórki B. Zaznacz oba.

Skonfiguruj drugi wykres komórek B z Alexa Fluor 700A na osi X i SSC-A na osi Y. Populacja po lewej stronie odpowiada komórkom CD11b-ujemnym, a zdarzenia po prawej odpowiadają komórkom CD11b-dodatnim. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdą sekcję, a następnie kliknij Właściwości bramy.

Kliknij pozycję Liczba i Nadrzędny, aby wyświetlić liczbę zdarzeń i wartości procentowe populacji rodzicielskich. Rejestruj liczbę zdarzeń i wartości procentowe w celu dalszej analizy danych. Oczekuje się, że po usunięciu dubletów w naiwnym, nieuszkodzonym sercu, około 20% komórek CD45-dodatnich będzie limfocytami B CD19-dodatnimi.

Spośród tych komórek średnio 5,5% znajduje się w przestrzeni śródmiąższowej. 94,5% znajduje się w przestrzeni wewnątrznaczyniowej. Z całej populacji komórek B znajdujących się w sercu tylko około 1,6% odpowiada komórkom B1 na podstawie markera powierzchniowego CD11b, a pozostałe 98,4% odpowiada komórkom B2.

Podczas analizy limfocytów B mięśnia sercowego za pomocą cytometrii przepływowej ważne jest, aby prawidłowo wykonać perfuzję i zmielić serce zgodnie z protokołem. Właściwa filtracja strawionego serca jest również niezbędna, aby zmaksymalizować regenerację komórek odpornościowych.