Name: Analiza płynu maziowego w celu identyfikacji choroby zwyrodnieniowej stawów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj analizę płynu maziowego w celu identyfikacji choroby zwyrodnieniowej stawów i dny moczanowej. Ta metoda wykorzystuje mikroskopię polaryzacyjną do wykrywania kryształów i oceny stanu zapalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować profesorowi Leonardo Punzi za jego cenne mentorstwo w dziedzinie analizy płynu maziowego oraz Szpitalowi Uniwersyteckiemu w Padwie za wsparcie.

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Padwie. SF pobrano za zgodą pacjenta ze stawów kolanowych pacjentów otrzymujących terapeutyczną artrocentezę z powodu wysięku stawowego podczas ich pierwszej prezentacji w klinice lub w odpowiedzi na zaostrzenie choroby zwyrodnieniowej stawów. Przeciwwskazaniami do zabiegu były: koagulopatia, leki przeciwzakrzepowe, zmiany skórne, zapalenie skóry, czy cellulit nad stawem. Wszystkie próbki SF zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.
1. Przygotowanie płynu maziowego
<ol>
	<li>Przenieś próbki SF pobrane podczas artrocentezy obrzękniętych stawów15 do probówki zawierającej antykoagulant (najlepiej EDTA; patrz Tabela Materiałów) i do drugiej probówki niezawierającej dodatku (Rysunek 1).</li>
	<li>W przypadku podejrzenia zakażenia należy aseptycznie przenieść część próbki SF (~ 1 ml) do butelek hodowlanych w celu przeprowadzenia badań mikrobiologicznych. 
	UWAGA: Zakażenie można podejrzewać zarówno w wyniku objawów klinicznych (ciężki guz, dolor, calor, functio laesa, a czasami gorączka), jak i makroskopowego wyglądu SF (zmętnienie, kolor). W takim przypadku lekarz przepisuje analizę mikrobiologiczną, która jest wykonywana przez laboratorium mikrobiologiczne.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę SF (kroki 2-5) zaraz po pobraniu próbki.</li>
</ol>
2. Badanie makroskopowe
UWAGA: Makroskopowa ocena próbek SF składa się z ocen subiektywnych, jakościowych i półilościowych. Nie ma wzorcowych wag odniesienia i nie stosuje się próbek kontrolnych.
<ol>
	<li>Opisz objętość SF wyrażoną w mililitrach. Określ kolor próbki, który może wahać się od bladego do ciemnożółtego. Rejestruj obecność krwi.</li>
	<li>Zdefiniuj stopień przejrzystości, obserwując próbkę w podświetleniu i określając łatwość odczytania wydrukowanej strony przez rurkę z płynem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Ocenić lepkość, wlewając próbkę z jednorazowej pipety. Długa formacja struny lub kropli wskazuje odpowiednio na dobrą lub słabą lepkość (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Ocenić obecność materiałów w postaci cząstek stałych, w tym fragmentów tkanek lub fibryny, obserwując próbkę przez rurkę i w świetle podświetlenia.</li>
</ol>
3. Badanie mikroskopowe
UWAGA: Analiza mikroskopowa SF składa się z badania cytologicznego, w tym całkowitej i różnicowej liczby białych krwinek (WBC) oraz poszukiwania kryształów.
<ol>
	<li>Określ łączną liczbę komórek, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Określić całkowitą liczbę leukocytów w SF zebranych w probówce EDTA za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Pobrać 0,5 μl SF z probówki EDTA za pomocą pipety Malassez-Potain (oznaczenie 0,5; patrz tabela materiałów) (rysunek uzupełniający 1). Tą samą pipetą pobierz 9,5 μl 0,1% roztworu błękitu metylenowego (znak 11). Końcowe rozcieńczenie jest 20-krotne.</li>
		<li>Wymieszaj pipetę przez delikatne odwrócenie, wyrzuć pierwsze krople i wlej płyn maziowy + roztwór błękitu metylenowego do komory liczącej.</li>
		<li>Policz komórki w dwóch kolejnych kwadratach z dziewięciu i pomnóż otrzymaną liczbę przez 100 (uproszczona formuła; Rysunek uzupełniający 2). Wyraź WBC jako liczbę leukocytów na milimetr sześcienny. 
		UWAGA: Uproszczona formuła: Leukocyty (N/mm3) = liczba zliczonych komórek w dwóch kolejnych kwadratach x 100.</li>
		<li>Sklasyfikuj SF zgodnie z całkowitą liczbą WBC zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami16,17 (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj różnicowe zliczanie komórek.
	<ol>
		<li>Określ procent komórek wielojądrzastych (PMN), monocytów i limfocytów za pomocą barwienia supravitalnego lub tradycyjnego13,18.</li>
		<li>W przypadku barwienia supravital umieść jedną małą kroplę SF na środku gotowego do użycia szkiełka wstępnie pokrytego fioletem krezylowym i błękitem metylenowym (rysunek uzupełniający 3; patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i umieść kroplę olejku immersyjnego do mikroskopu.</li>
		<li>Przygotuj wysuszony na powietrzu rozmaz SF do tradycyjnego barwienia (mniej odpowiedni do rutynowej analizy). Umieść małą kroplę SF na końcu czystego slajdu. Za pomocą drugiego szkiełka lub szkiełka nakrywkowego rozprowadź go wzdłuż szkiełka ruchem do przodu. Pozostaw rozmaz do wyschnięcia.</li>
		<li>Wybarwić próbkę zgodnie ze standardową procedurą May-Grünwald-Giemsa18.</li>
		<li>Przyjrzyj się szkiełku pod obiektywem zanurzającym w oleju (1,000x).</li>
		<li>Policz 100 kolejnych komórek i rozróżnij komórki wielojądrzaste, monocyty i limfocyty (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3, Rysunek uzupełniający 4).</li>
		<li>Wyraż całkowitą liczbę w każdej kategorii w procentach. 
		UWAGA: Aby uzyskać dokładne wyniki, badania cytologiczne należy wykonać zaraz po pobraniu SF lub w ciągu 24-48 godzin od artrocentezy, jeśli są prawidłowo przechowywane (4 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykrywanie kryształów
<ol>
	<li>Określ obecność patologicznych kryształów za pomocą mikroskopu światła spolaryzowanego wyposażonego w dodatkowy filtr polaryzacyjny i czerwony kompensator19 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonaj przygotowanie szkiełek do wykrywania kryształów.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyczyść szkiełko papierem optycznym lub miękkim papierem nasączonym etanolem. Nałóż niewielką kroplę SF na szklane szkiełko.</li>
		<li>Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i umieść szkiełko pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj kryształy.
	<ol>
		<li>Ustaw ostrość szkiełka pod mikroskopem za pomocą obiektywu powiększającego o małej mocy. Dokładnie przyjrzyj się szkiełku w jasnym polu za pomocą obiektywu 40x. Zajrzyj do środka i na zewnątrz komórek.</li>
		<li>Zidentyfikuj kryształy według ich wielkości i kształtu (np. romboidalne, w kształcie igły, w kształcie pręcika).</li>
		<li>Włóż filtr polaryzacyjny między źródło światła a próbkę. Obróć polaryzator, aż jego oś optyczna będzie prostopadła do analizatora (umieszczonego nad obiektywami), aby utworzyć ciemne tło.</li>
		<li>Po zidentyfikowaniu kryształu dwójłomnego włóż kompensator między polaryzator a próbkę i przesuń go równolegle lub prostopadle do osi optycznej kryształu.</li>
		<li>Obserwuj kolor ujawniony przez kryształ (Tabela 2). 
		UWAGA: Kryształy MSU mają kształt igły, są jasno dwójłomne w ciemnym polu i mają żółto-pomarańczowy kolor, gdy ich oś jest równoległa do kompensatora. I odwrotnie, są niebieskie, gdy są ustawione prostopadle (znak ujemny) (tabela 2; <silna klasa="xfig">Rysunek 4). Kryształy CPP są kryształami podobnymi do prętów lub rombów, słabo dwójłomnymi w świetle spolaryzowanym i mają kolor niebieski lub żółty, gdy są ustawione równolegle lub prostopadle do osi kompensatora (znak dodatni) odpowiednio (tabela 2; <silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Czerwone zabarwienie alizaryny
<ol>
	<li>Przygotować 2% roztwór czerwieni alizarynowej S (pH 4,1-4,3), przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać z dala od światła.
	<ol>
		<li>W celu przygotowania szkiełka należy zmieszać kroplę SF z tą samą objętością roztworu czerwieni alizarynowej (1:1) na czystym szkiełku. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i obejrzyj w powiększeniu 400x.</li>
		<li>Zidentyfikuj kryształy pod mikroskopem. 
		UWAGA: Test jest pozytywny, gdy w świetle przechodzącym widoczne są jasne, ciemnoczerwone osady o okrągłym kształcie i koncentrycznych warstwach. W świetle spolaryzowanym wydają się one silnie dwójłomne20 (Rysunek 6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional+prevalence%2C+incidence+and+risk+factors+of+knee+osteoarthritis+in+population-based+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies.</a> EClinicalMedicine. 29, 100587(2020).</li>
<li>Hunter, D. J., Bierma-Zeinstra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis.</a> Lancet. 393 (10182), 1745-1759 (2019).</li>
<li>Mandell, B. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMandell%2C+BF+%22Synovial+Fluid+Analysis+and+the+Evaluation+of+Patients+with+Arthritis%22">Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis</a>. , Springer. Cham. (2022).</li>
<li>Schmerling, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+initial+evaluation+of+the+adult+patient+with+acute+musculoskeletal+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the initial evaluation of the adult patient with acute musculoskeletal symptoms.</a> Arthritis & Rheumatism. 39 (1), 1-8 (1996).</li>
<li>Coakley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCGP+and+BSAC+guidelines+for+management+of+the+hot+swollen+joint+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">RCGP and BSAC guidelines for management of the hot swollen joint in adults.</a> Rheumatology. 45 (8), 1039-1041 (2006).</li>
<li>Frallonardo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+calcium+phosphate+and+pyrophosphate+crystals+in+early+and+late+osteoarthritis%3A+relationship+with+clinical+indices+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Basic calcium phosphate and pyrophosphate crystals in early and late osteoarthritis: relationship with clinical indices and inflammation.</a> Clinical Rheumatology. 37 (10), 2847-2853 (2018).</li>
<li>Nalbant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+features+and+their+relations+to+osteoarthritis+severity%3A+new+findings+from+sequential+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid features and their relations to osteoarthritis severity: new findings from sequential studies.</a> Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 50-54 (2003).</li>
<li>Fuerst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcification+of+articular+cartilage+in+human+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Calcification of articular cartilage in human osteoarthritis.</a> Arthritis & Rheumatism. 60 (9), 2694-2703 (2009).</li>
<li>Campillo-Gimenez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+potential+of+four+different+phases+of+calcium+pyrophosphate+relies+on+NF-%CE%BAB+activation+and+MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory potential of four different phases of calcium pyrophosphate relies on NF-κB activation and MAPK pathways.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2248(2018).</li>
<li>Pazár, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+calcium+phosphate+crystals+induce+monocyte%2Fmacrophage+IL-1%CE%B2+secretion+through+the+NLRP3+inflammasome+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Basic calcium phosphate crystals induce monocyte/macrophage IL-1β secretion through the NLRP3 inflammasome in vitro.</a> The Journal of Immunology. 186 (4), 2495-2502 (2011).</li>
<li>Martín, M. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+count+in+body+fluids%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Automated cell count in body fluids: a review.</a> Advances in Laboratory Medicine. 2, 149-161 (2021).</li>
<li>Seghezzi,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+cellular+analysis+of+synovial+fluids+by+optical+microscopy+and+automated+count+using+the+Sysmex+XN+body+fluid+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Optimization of cellular analysis of synovial fluids by optical microscopy and automated count using the Sysmex XN body fluid mode.</a> Clinica Chimica Acta. 462, 41-48 (2016).</li>
<li>Reginato, A. J., Maldonado, I., Reginato, A. M., Falasca, G. F., O'Connor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supravital+staining+of+synovial+fluid+with+Testsimplets%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Supravital staining of synovial fluid with Testsimplets.</a> Diagnostic Cytopathology. 8 (2), 147-152 (1992).</li>
<li>Lumbreras, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+for+crystals+in+synovial+fluid%3A+training+of+the+analysts+results+in+high+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Analysis for crystals in synovial fluid: training of the analysts results in high consistency.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (4), 612-615 (2005).</li>
<li>Tieng, A., Franchin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knee+arthrocentesis+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Knee arthrocentesis in adults.</a> Journal of Visualized Experiments. , e63135(2022).</li>
<li>Punzi, L., Oliviero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthrocentesis+and+synovial+fluid+analysis+in+clinical+practice%3A+value+of+sonography+in+difficult+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Arthrocentesis and synovial fluid analysis in clinical practice: value of sonography in difficult cases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1154 (1), 152-158 (2009).</li>
<li>Schumacher, H. R., Reginato, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchumacher%2C+HR+%22Atlas+of+Synovial+Fluid+Analysis+and+Crystal+Identification%22">Atlas of Synovial Fluid Analysis and Crystal Identification</a>. , Lea & Febiger. Philadelphia. (1991).</li>
<li>Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+protocol+for+characterizing+the+murine+C1498+cell+line+and+its+associated+leukemia+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54270(2016).</li>
<li>Oliviero, F., Punzi, L. Basics of Polarized Light Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOliviero%2C+F+%22Synovial+Fluid+Analysis+and+the+Evaluation+of+Patients+with+Arthritis%22">Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis</a>. , Springer. Cham. 79-90 (2022).</li>
<li>Paul, H., Reginato, A. J., Schumacher, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alizarin+red+S+staining+as+a+screening+test+to+detect+calcium+compounds+in+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Alizarin red S staining as a screening test to detect calcium compounds in synovial fluid.</a> Arthritis & Rheumatism. 26 (2), 191-200 (1983).</li>
<li>Favero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+fetuin-A+levels+in+patients+affected+by+osteoarthritis+with+or+without+evidence+of+calcium+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid fetuin-A levels in patients affected by osteoarthritis with or without evidence of calcium crystals.</a> Rheumatology. 58 (4), 729-730 (2019).</li>
<li>Frallonardo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+calcium+crystals+in+knee+osteoarthritis+synovial+fluid%3A+a+comparison+between+polarized+light+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Detection of calcium crystals in knee osteoarthritis synovial fluid: a comparison between polarized light and scanning electron microscopy.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 22 (7), 369-371 (2016).</li>
<li>Peffers, M. J., Smagul, A., Anderson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+synovial+fluid%3A+current+and+potential+uses+to+improve+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of synovial fluid: current and potential uses to improve clinical outcomes.</a> Expert Review of Proteomics. 16 (4), 287-302 (2019).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

W chorobie zwyrodnieniowej stawów analiza SF pomaga zdefiniować charakterystykę choroby poprzez proste kroki: całkowitą i różnicową liczbę leukocytów oraz poszukiwanie kryształów, w tym CPP i BCP. Co więcej, wykrycie kryształów MSU może uwidocznić ważne choroby współistniejące.
Pomimo niskich kosztów i prostego wykonania, na czułość testów i wiarygodność wyników mogą mieć wpływ niedoświadczeni analitycy - głównie w odniesieniu do identyfikacji kryształów. Wykształcenie i doświadczenie analityk...

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest złożoną i wieloczynnikową przewlekłą chorobą stawów, której łączna częstość występowania wynosi 16% u osób w wieku 15 lat i starszych, oraz 23% u osób w wieku 40 lat i starszych1. Oczekuje się, że częstość występowania choroby zwyrodnieniowej stawów wzrośnie ze względu na starzenie się populacji i wzrost czynników ryzyka, takich jak otyłość i zespół metaboliczny2.
Wśród głównych problemów związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów są trudności w diagnozowaniu choroby we wczesnych stadiach oraz obecnie dostępne metody leczenia ograniczone do leczenia bólu i objawowych leków wolno działających (SYSADOA), takich jak glikozaminoglikany. Rozpoznanie choroby zwyrodnieniowej stawów opiera się na objawach klinicznych i wynikach badań obrazowych. Jednak brak korelacji między tymi dwiema ocenami może powodować wieloletnie opóźnienia w diagnozie choroby zwyrodnieniowej stawów i rozpoczęciu leczenia2. Choroba zwyrodnieniowa stawów charakteryzuje się procesami zwyrodnieniowymi i stanem zapalnym o niskim stopniu nasilenia, które można łatwo zbadać za pomocą analizy płynu maziowego (SF). SF to lepki dialilat plazmatyczny bogaty w kwas hialuronowy, który smaruje przestrzeń stawową, dostarcza składniki odżywcze i tlen do chrząstki oraz usuwa odpady metaboliczne. SF działa również jako amortyzator, chroniąc w ten sposób stawy podczas naprężeń i naprężeń3.
Analiza SF to prosta i niezawodna metoda, która zawsze musi być wykonywana podczas wstępnej oceny pacjentów z objawami mięśniowo-szkieletowymi i wysiękami w stawach3. Zalecenia American College of Rheumatology, British Society for Rheumatology i innych obejmują analizę SF wśród badań diagnostycznych chorób reumatycznych, które muszą być wykonywane głównie w ocenie ostrego zapalenia stawów jednostawowych4,5. Całkowita i różnicowa liczba leukocytów uzyskana z analizy SF daje obraz procesu patologicznego zachodzącego w stawie, klasyfikując w ten sposób stopień zapalenia. Identyfikacja kryształów chorobotwórczych, takich jak moczan sodu (MSU) i kryształy pirofosforanu wapnia (CPP), w świetle spolaryzowanym, ma kluczowe znaczenie w diagnostyce i leczeniu krystalicznego zapalenia stawów (np. dny moczanowej i dny rzekomej). Ponadto obecność mikroorganizmów sugeruje rozpoznanie septycznego zapalenia stawów.
Kryształy wapnia są częste w próbkach pobranych od pacjentów z OA6. Zasadowe kryształy fosforanu wapnia (BCP) i CPP stwierdzono odpowiednio w około 22% i 23% próbek SF od pacjentów z OA6. Chociaż ich rola pozostaje niejasna, kryształy te są związane z cięższymi postaciami OA7 i są uważane za epifenomen samego procesu patologicznego. Kryształy wapnia wykryto w 100% próbek tkanek pobranych od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów kolanowych poddawanych endoprotezoplastyce8. Ponadto wysunięto hipotezę, że kryształy wapnia mogą być zaangażowane w patogenezę choroby zwyrodnieniowej stawów ze względu na ich działanie zapalne, wykazane w kilku badaniach9 i pośredniczone, przynajmniej częściowo, przez inflammasom NLRP310.
Ostatnio kryształy wapnia zostały opisane zarówno we wczesnych, jak i późnych stadiach6 choroby zwyrodnieniowej stawów, co wskazuje, że mogą one odgrywać istotną rolę w diagnozowaniu różnych podgrup klinicznych choroby zwyrodnieniowej stawów i leczenia farmakologicznego.
Ogólny cel analizy SF jest dwojaki: określenie stopnia zapalnego SF oraz zdiagnozowanie krystalicznego lub septycznego zapalenia stawów poprzez identyfikację konkretnych kryształów lub mikroorganizmów. Jest to szczególnie przydatne, proste i niezawodne narzędzie w diagnozowaniu choroby zwyrodnieniowej stawów, ze względu na typowy niezapalny wzór z bardzo niskim procentem lub brakiem neutrofili.
Zalety w porównaniu z alternatywnymi technikami 
Analiza SF składa się z prostych procedur, które obejmują całkowitą i różnicową liczbę leukocytów oraz wyszukiwanie kryształów. Ręczne zliczanie komórek wykonywane przez doświadczonych techników laboratoryjnych3,11 pozostaje złotym standardem w analizie cytologicznej mazi stawowej i innych płynów ustrojowych. Jednak ze względu na czasochłonne ograniczenie oraz zmienność między i wewnątrz obserwatorów tej metody, automatyczne liczenie komórek stopniowo zastępowało ręczne liczenie w dużych rutynowych laboratoriach klinicznych, w których analizatory krwi i moczu zostały przystosowane do umożliwienia analizy SF11,12. Niemniej jednak ręczne liczenie ma pewne zalety w określonych ustawieniach: (1) w ambulatorium, aby uzyskać całkowitą i różnicową wartość WBC na czas; (2) w celu identyfikacji typów komórek, takich jak jednojądrzaste komórki cytofagocytarne (Reiter) lub komórki niehematopoetyczne, takie jak synowiocyty, których automatyczne liczniki nie są w stanie rozpoznać; (3) gdy próbka jest zbyt mała, aby mogła być obsługiwana przez przyrząd; (4) Tworzenie lokalnych rejestrów laboratoryjnych, które są łatwo dostępne dla celów badawczych. Kolejną zaletą ręcznego liczenia jest barwienie insupravital, czyli metoda, która pozwala na bardzo szybkie różnicowanie komórek i natychmiast po przygotowaniu szkiełek podstawowych. Natomiast tradycyjne barwienia, takie jak procedury Wrighta i Maya-Grünwalda-Giemsy, wymagają suszenia na powietrzu rozmazów SF i czasu na barwienie komórek13. Chociaż nie nadają się do rutynowych analiz, w których liczy się czas, te metody barwienia ujawniają bardziej szczegółowe populacje komórek w próbce, w tym erytrocyty, bazofile, eozynofile, leukocyty wielojądrzaste, limfocyty i płytki krwi.
Na koniec, rutynowa analiza SF dla kryształów jest wykonywana przy użyciu prostej techniki opartej na mikroskopii światła spolaryzowanego, która zapewnia szybkie wyniki14. Metody alternatywne, takie jak mikroskopia skaningowa i elektronowa, dają dokładniejsze i bardziej czułe wyniki, ale ich zastosowanie w codziennej praktyce klinicznej nie jest możliwe ze względu na wysokie koszty oraz czasochłonne przygotowanie i analizę próbek.

<table><tbody><tr><td>Alizaryna czerwona S</td><td>Merck</td><td>A5533</td><td>Do wyszukiwania kryształów BCP</td></tr><tr><td>Komora Burkera</td><td>Merck</td><td>BR718905</td><td>Do całkowitej liczby białych krwinek</td></tr><tr><td>Okulary ochronne</td><td>Merck</td><td>C7931</td><td>Do badania mikroskopowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki EDTA</td><td>BD</td><td>368861</td><td>Do kolekcji SF&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S8902</td><td>Do wyszukiwania kryształów</td></tr><tr><td>Filtr lambda (kompensator)</td><td>Dowolny&nbsp;</td><td>Skontaktuj się z firmą zajmującą</td> się <td>mikroskopami w celu identyfikacji kryształów&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta Malassez-Potain</td><td>Artiglass</td><td>54830000</td><td>Do rozcieńczania płynu maziowego</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu metylenowego</td><td>Merck</td><td>3978</td><td>Do całkowitej liczby białych krwinek</td></tr><tr><td>Mikroskop spolaryzowany&nbsp;</td><td>Leica, Nikon, inne</td><td>W zależności od modelu i firmy</td><td>Do pełnej analizy płynu maziowego</td></tr><tr><td>Soczewka polaryzacyjna</td><td>Dowolna&nbsp;</td><td>Skontaktuj się z firmą zajmującą</td> się <td>mikroskopami w celu identyfikacji kryształów&nbsp;</td></tr><tr><td>Testsimplet&nbsp;</td><td>Waldeck</td><td>14386</td><td>Barwienie Supravital do różnicowania komórek</td></tr></tbody></table>

analiza płynu maziowego w celu identyfikacji choroby zwyrodnieniowej stawów

Synovial Fluid Analysis to Identify Osteoarthritis

Analiza płynu maziowego (SF) jest ważna w diagnozowaniu choroby zwyrodnieniowej stawów (OA). Cechy makroskopowe i mikroskopowe, w tym całkowita i różnicowa liczba białych krwinek (WBC), pomagają określić niezapalny charakter SF, który jest cechą charakterystyczną choroby zwyrodnieniowej stawów. U pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów krwinki białe w próbkach SF zwykle nie przekraczają 2000 komórek na mikrolitr, a odsetek komórek zapalnych, takich jak neutrofile, jest bardzo niski lub nie ma go wcale. Kryształy wapnia są częste w SF pobranym od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Chociaż ich rola w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów pozostaje niejasna, wiąże się one z łagodnym procesem zapalnym i cięższym postępem choroby. Ostatnio kryształy wapnia zostały opisane zarówno we wczesnym, jak i późnym stadium choroby zwyrodnieniowej stawów, co wskazuje, że mogą odgrywać istotną rolę w diagnozowaniu różnych podgrup klinicznych choroby zwyrodnieniowej stawów i leczeniu farmakologicznym. Ogólny cel analizy SF w chorobie zwyrodnieniowej stawów jest dwojaki: ustalenie stopnia niezapalnego SF i podkreślenie obecności kryształów wapnia.

Duże stawy dotknięte OA są często obrzęknięte i produkują znaczne ilości SF, które są odprowadzane via artrocentezą15. Makroskopowe cechy SF oceniane bezpośrednio po artrocentezie obejmują przede wszystkim ilość, kolor, przejrzystość i lepkość17. Pomimo ich niskiej swoistości, dostarczają one wstępnych danych na temat stopnia stanu zapalnego. Kolor zależy od komórkowości SF oraz stopnia fragmentacji makrocząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej. SF pobrane od pacjent...

Analiza płynu maziowego pod mikroskopią światła transmitowanego, spolaryzowanego i kompensowanego służy do oceny zapalnej lub niezapalnej natury próbki za pomocą prostych kroków. Jest szczególnie przydatny w chorobie zwyrodnieniowej stawów do wykrywania kryształów wapnia i identyfikacji poważniejszej podgrupy choroby zwyrodnieniowej stawów.

Analiza płynu maziowego w celu identyfikacji choroby zwyrodnieniowej stawów

Synovial fluid (SF) analysis is important in diagnosing osteoarthritis (OA). Macroscopic and microscopic features, including total and differential white ...

Analiza płynu maziowego może ujawnić stopień zapalenia i obecność kryształów patogennych podczas wstępnej oceny pacjenta z objawami mięśniowo-szkieletowymi i wysiękami stawowymi. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota i niezawodność. W kilku krokach klinicysta może uzyskać ważne informacje diagnostyczne na temat choroby pacjenta.Identyfikacja konkretnych kryształów ma kluczowe znaczenie dla diagnozy i leczenia. Kryształy moczanu wskazują na dnę moczanową, podczas gdy pirofosforan wapnia i inne kryształy wapnia wskazują na artropatie związane z wapniem lub cięższą postać choroby zwyrodnieniowej stawów. Na początek pobierz próbkę płynu maziowego pobraną podczas artrocentezy obrzękniętych stawów pacjentów.Opisz objętość próbki w mililitrach i przenieś ją oddzielnie do probówki zawierającej antykoagulant EDTA i innej probówki bez żadnych dodatków. W przypadku podejrzenia infekcji należy aseptycznie przenieść kilka mililitrów próbki płynu maziowego do butelki hodowlanej w celu przeprowadzenia badań mikrobiologicznych. Aby zbadać próbkę makroskopowo, weź probówkę zawierającą próbkę i określ kolor próbki, który może wahać się od bladego do ciemnożółtego.Odnotować obecność krwi, jeśli taka występuje. Określ stopień klarowności próbki, obserwując ją w podświetleniu i określając łatwość odczytania wydrukowanej strony przez rurkę zawierającą próbkę. Następnie oceń lepkość próbki, ociekając ją z jednorazowej pipety.Podczas gdy pojawienie się długiego ciągu cieczy wskazuje na wysoką lepkość, tworzenie się kropel wskazuje na niską lepkość. Obserwuj próbkę przez probówkę ze światłem w tle pod kątem obecności jakichkolwiek cząstek stałych, w tym fragmentów tkanek lub fibryny. Aby określić całkowitą liczbę białych krwinek, należy pobrać 0,5 mikrolitra próbki z probówki zawierającej EDTAA za pomocą pipety Malassez-Potain.Użyj tej samej pipety, aby pobrać 9,5 mikrolitra 0,1% roztworu błękitu metylenowego. Wymieszać próbkę z roztworem błękitu metylenowego w pipecie przez delikatne odwrócenie. Wyrzuć kilka pierwszych kropli przed wlaniem mieszaniny do komory liczącej hemocytometru.Teraz policz komórki w dwóch kolejnych kwadratach z dziewięciu i pomnóż uzyskaną liczbę przez 100. Wyraź całkowitą liczbę białych krwinek jako liczbę leukocytów na milimetr sześcienny. Użyj próbki płynu maziowego z probówki bez żadnych dodatków, aby określić różnicową liczbę białych krwinek w próbkach płynu maziowego.Aby określić różnicową liczbę komórek za pomocą barwienia supravital, weź gotowe do użycia szkiełko wstępnie pokryte fioletem krystalicznym i błękitem metylenowym i umieść jedną małą kroplę próbki na środku szkiełka. Następnie przykryj kroplę próbki szkiełkiem nakrywkowym i umieść kroplę olejku immersyjnego mikroskopu na szkiełku nakrywkowym. Aby użyć tradycyjnego barwienia do oszacowania różnicowej liczby komórek, zacznij od umieszczenia małej kropli próbki na końcu czystego szkiełka.Teraz użyj drugiego szkiełka lub szkiełka nakrywkowego, aby rozprowadzić kroplę wzdłuż szkiełka ruchem do przodu. Pozwól rozmazowi wyschnąć na powietrzu. Sprawdź szkiełko zawierające rozmaz wysuszony na powietrzu pod obiektywem zanurzeniowym 1,000X w olejku.Oszacuj różnicową liczbę komórek, licząc 100 kolejnych komórek, jednocześnie odróżniając od siebie komórki wielojądrzaste, monocyty i limfocyty. Wyczyść szkiełko za pomocą papieru optycznego lub miękkiego nasączonego etanolem. Nanieść małą kroplę próbki, która nie została zmieszana z żadnym dodatkiem, na szkiełko podstawowe i przykryć ją szkiełkiem nakrywkowym przed umieszczeniem szkiełka pod mikroskopem.Ustaw ostrość szkiełka pod mikroskopem za pomocą obiektywu o małym powiększeniu i dokładnie zbadaj je w jasnym polu za pomocą obiektywu 40X. Zajrzyj do środka i na zewnątrz komórek, aby zidentyfikować kryształy według ich wielkości i kształtu, które mogą być romboidalne, w kształcie igły lub pręta. Następnie włóż filtr polaryzacyjny między źródło światła a próbkę.Aby utworzyć ciemne tło, obróć polaryzator, aż jego oś optyczna będzie prostopadła do analizatora. Po zidentyfikowaniu kryształu dwójłomnego włóż kompensator między polaryzator a próbkę i przesuń go równolegle lub prostopadle do osi optycznej kryształu. Obserwuj kolor ujawniony przez kryształ.W przypadku barwienia czerwienią alizaryny należy zmieszać kroplę próbki płynu maziowego z równą objętością wcześniej przygotowanego roztworu czerwieni alizarynowej na czystym szkiełku. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i zbadaj pod mikroskopem w powiększeniu 400x, aby zidentyfikować kryształy. Makroskopowe charakterystyki próbek płynu maziowego wskazywały na stopień zapalenia.Próbka o bladożółtym kolorze i większej przejrzystości jest na ogół związana ze stanami niezapalnymi, takimi jak choroba zwyrodnieniowa stawów. Z drugiej strony próbka o ciemnożółtym kolorze i mętnym wyglądzie wskazuje na obecność komórek, szczątków, kwasu hialuronowego i fragmentów fibryny, które są związane z wysiękami zapalnymi. Leukocyty obserwowane w próbkach płynu maziowego od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów były głównie monocytami i innymi komórkami jednojądrzastymi, takimi jak synowiocyty.W próbkach płynu maziowego wykryto kryształy pirofosforanu wapnia, co wskazuje na stosunkowo wyższe poziomy cytokin zapalnych. Co więcej, dodatnie barwienie czerwienią alizarynową ujawniło obecność zasadowych kryształów fosforanu wapnia w próbkach. Bardzo ważne jest, aby podczas poszukiwania kryształów dokładnie zbadać szkiełko w zwykłym świetle.Pamiętaj, że kryształy pirofosforanu są często słabo dwójłomne i można je przeoczyć w świetle spolaryzowanym. Obecność kryształów wapnia w płynie maziowym i ich związek z cięższą postacią choroby skłoniły naukowców do zbadania nowych mechanizmów patogenezy i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów.

synovial-fluid-analysis-to-identify-osteoarthritis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obecny protokół ustanawia rygorystyczną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania zmian morfologicznych stawów, które towarzyszą chorobie zwyrodnieniowej stawów. Zastosowanie tego protokołu może być cenne w monitorowaniu postępu choroby i ocenie interwencji terapeutycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów.

Standaryzowana ocena histomorfometryczna choroby zwyrodnieniowej stawów w chirurgicznym modelu myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy i powtarzalny protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów monocytów/makrofagów i limfocytów T za pomocą testów barwienia zarówno zewnątrzkomórkowego, jak i wewnątrzkomórkowego w obrębie śledziony myszy, szpiku kostnego, węzłów chłonnych i tkanki maziowej, wykorzystując sprawdzony model chirurgiczny mysiego zapalenia stawów.

Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

Pierwotne tkanki uzyskane od pacjentów po całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego dostarczają eksperymentalnego modelu do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów z maksymalną kliniczną przekładalnością. Protokół ten opisuje, w jaki sposób identyfikować, przetwarzać i izolować RNA z siedmiu unikalnych tkanek kolana w celu wsparcia badań mechanistycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów u ludzi.

Pobieranie tkanek i ekstrakcja RNA z ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów

Obecny protokół opisuje urządzenie do testowania tarcia, które stosuje jednocześnie wzajemne przesuwanie i normalne obciążenie do dwóch stykających się biologicznych powierzchni stykających się.

Urządzenie do testowania tarcia - bioreaktor do badania biomechaniki stawów maziowych, mechanobiologii i regulacji fizycznej

Prezentowany tutaj jest protokół użycia nanocząsteczek srebra do skutecznego łagodzenia ostrych objawów u myszy z chorobą zwyrodnieniową stawów wywołaną kolagenazą typu II, w tym zapalenie błony maziowej, przerost błony maziowej, przerost naczyń krwionośnych, itp.

Łagodzenie choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy za pomocą nanocząstek srebra

W niniejszym artykule opisujemy chirurgiczną metodę transekcji więzadła krzyżowego przedniego (ACL) jako wiarygodny model wywoływania choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u gryzoni oraz metody pobierania płynu maziowego kolana, pomiaru obrzęku kolana i oceny ciężkości choroby zwyrodnieniowej stawów.

Przecięcie więzadła krzyżowego przedniego i płukanie płynu maziowego w modelu gryzoni w celu zbadania zapalenia stawów i pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów

Opracowaliśmy ludzki system ex vivo transwell zdolny do oceny ostrych zmian zapalnych, zakaźnych i strukturalnych w błonie maziowej.

Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), czyli choroba zwyrodnieniowa stawów, jest wyniszczającym stanem związanym z bólem, który pozostaje tylko częściowo kontrolowany przez dostępne leki przeciwbólowe. Opracowywane są modele zwierzęce, które mają na celu lepsze zrozumienie mechanizmów bólu związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów. W tym miejscu opisujemy metodologię monojodooctanowego modelu bólu zwyrodnieniowego stawów u myszy.

Model monojodooctanu bólu związanego z chorobą zwyrodnieniową stawów u myszy

Przedstawiono protokół ustanawiający mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowane z mazi stawowej i szpiku kostnego świnek miniaturowych i pobrane nieinwazyjnie za pomocą aspiracji strzykawki. Fenotypowanie komórkowe przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej po izolacji komórek oraz hodowli in vitro szpiku kostnego i płynów maziowych pochodzących z MSCs.

Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych

Tutaj, w oparciu o punkt widzenia klinicysty, proponujemy dwumodelowy protokół dodatniego ciśnienia dolnego ciała (LBPP) (modele chodzenia i kucania) oprócz klinicznej, funkcjonalnej metodologii oceny, w tym szczegóły dotyczące dalszego zachęcania do rozwoju niefarmakologicznych strategii interwencji chirurgicznej u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego. Natomiast wpływ treningu LBPP na poprawę dolegliwości bólowych i funkcji kolana u jednego pacjenta prezentujemy jedynie poprzez...

Bieżnia nadciśnieniowa dolnej części ciała do rehabilitacji choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego

Poznaj analizę płynu maziowego w celu identyfikacji choroby zwyrodnieniowej stawów i dny moczanowej. Ta metoda wykorzystuje mikroskopię polaryzacyjną do wykrywania kryształów i oceny stanu zapalnego.

Analiza płynu maziowego w celu identyfikacji choroby zwyrodnieniowej stawów

Przeglądaj więcej filmów