Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Metoda ta umożliwia rejestrację wewnątrzkomórkowych potencjałów czynnościowych podobnych do tradycyjnych MEA, umożliwiając w ten sposób lepszy opis kształtu AP i bardziej czułą klasyfikację potencjałów proarytmicznych. W porównaniu z typowymi zapisami potencjału pola, wewnątrzkomórkowy, podobny do rzeczywistego kształtu potencjału zapewnia lepszy wgląd w precyzyjną autoryzację leżących poniżej kanałów jonowych. W przypadku zastosowania do kardiomiocytów pochodzących od pacjentów klinicznych za pomocą technologii komórek macierzystych, metoda ta może przyczynić się do diagnozy przyczynowej i personalizacji CRP oraz chorób serca, takich jak arytmie Nasza technik, Karin Gebhardt, zademonstruje hodowlę kardiomiocytów.

Aby rozpocząć powlekanie pól elektrod wcześniej autoklawowanych MEA, Dropwise z fibronektyną za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów pod kapturem o przepływie laminarnym. Aby zmniejszyć szok osmotyczny, przenieś roztwór galwaniczny kroplami przez 90 sekund do 50-mililitrowej probówki zawierającej rozmrożone kardiomiocyty. Delikatnie dodaj osiem mililitrów podłoża galwanicznego do probówki i dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek.

Za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów usuń supernatant, uważając, aby nie wyrzucić osadu i dostosuj liczbę komórek do końcowego stężenia. Przed umieszczeniem ogniwa należy usunąć nałożony roztwór powlekający z obszaru elektrody MEA za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Aby uniknąć wysuszenia powłoki, natychmiast zasiej komórki, dodając cztery mikrolitry komórek kroplami na pola elektrod dla obu, sześciu dołków MEA i jednego dołka ME A. Teraz pozwól komórkom przylegać do dołków przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Pod okapem z przepływem laminarnym dodaj 200 mikrolitrów i jeden mililitr sterylnego podłoża galwanicznego podgrzanego do 37 stopni Celsjusza dla odpowiednio sześciu MEA i MEA z jednym dołkiem. W przypadku nagrań MEA umieść system MEA na górze urządzenia z uchwytem chipa MEA wyśrodkowanym nad otworem obiektywu. Następnie pozwól laserowi skupić się na elektrodach, ustawiając konfigurację MEA tak, aby obiektyw znajdował się bezpośrednio pod otworem systemu MEA.

Aby umożliwić komórkom regenerację po zakłóceniach mechanicznych, należy przenieść chip MEA z hodowanymi komórkami z inkubatora do zestawu MEA na 15 minut przed zapisem. Następnie dokładnie wyczyść podkładki stykowe i kołki za pomocą wacika izopropanolowego, aby zmniejszyć poziom hałasu. Ostrożnie umieść MEA w konfiguracji MEA i umieść sześciodołkowy chip MEA z numerem seryjnym widocznym po prawej stronie lub chip MEA z pojedynczą studnią z elektrodą odniesienia po lewej stronie.

Teraz ustaw zintegrowane ogrzewanie systemu MEA na 38 stopni Celsjusza. Zamknij pokrywę urządzenia, ponieważ zintegrowany wyłącznik bezpieczeństwa umożliwia aktywację lasera tylko wtedy, gdy pokrywa jest zamknięta nad chipem MEA. Za pomocą programu konfiguracyjnego MEA ustaw górnoprzepustowy i dolnoprzepustowy filtr systemowy MEA odpowiednio na 0,1 herca lub mniej i 3 500 herców.

Użyj oprogramowania MC rack lub dowolnego alternatywnego oprogramowania do nagrywania. Dostosuj zakres wejściowy zgodnie z eksperymentem. Upewnienie się, że sygnał nie nasyca amplifier i częstotliwość próbkowania.

Użyj funkcji długoterminowego wyświetlania w oprogramowaniu, aby sprawdzić nagranie. Po włożeniu chipa MEA do konfiguracji MEA i skonfigurowaniu oprogramowania zainicjuj mechanikę laserową za pomocą oprogramowania FB ALP. Teraz kliknij przycisk inicjalizacji.

Pod koniec inicjalizacji wirtualny punkt laserowy znajdzie się odpowiednio w studzience D dla MEA z sześcioma dołkami i w lewym dolnym rogu dla MEA z pojedynczą studnią. Następnie za pomocą sterującego za pomocą kliknięcia myszą przesuń wirtualny punkt laserowy na środek elektrody D pięć i dostosuj ostrość, przytrzymując Control i przewijając kółkiem myszy. Alternatywnie użyj funkcji automatycznego ustawiania ostrości.

Naciśnij przycisk ustawiony P jeden, a wirtualny punkt laserowy automatycznie przesunie się do studzienki F. System jest teraz wyrównany. Dostosuj moc lasera i czas procesu zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Aby włączyć laser, kliknij przycisk wyłączania lasera, który pojawi się jako laser włączony, przełącz się na oprogramowanie do nagrywania.

Wybierz nazwę pliku i kliknij czerwony przycisk nagrywania, a następnie przycisk odtwarzania w górnej części okna, aby zarejestrować pomiar. Przed otwarciem komórek za pomocą lasera zapisuj linię bazową przez 60 sekund. Przełącz się z powrotem na oprogramowanie inicjujące i dezaktywuj elektrody, które mają być wykluczone przez laser na wirtualnej mapie po prawej stronie okna oprogramowania.

Aby uruchomić laser, użyj kliknięcia myszą Alt i wybierz środkową elektrodę tej studni. To inicjuje laser do automatycznego otwierania komórek na każdej elektrodzie tej studni, powtórz dla każdej studzienki, aby otworzyć wszystkie wcześniej aktywowane elektrody tej wybranej studni. Stężenie milimolowe nifedypiny E-40 31 i dofetylidu należy rozpuścić najpierw w DMSO, a następnie w pełnym podłożu do 10-krotności pożądanego stężenia.

Nigdy nie przekraczaj końcowego stężenia DMSO wynoszącego 0,1% w studni. Rejestruj aktywność linii bazowej przez 60 sekund. Rozpocznij indukowaną laserem perację, jak pokazano wcześniej, co spowoduje przekształcenie FPS w liAP.

Zastosuj wszystkie leki w pojedynczym stężeniu na studzienkę. Usunąć 20 mikrolitrów i 100 mikrolitrów pożywki na studzienkę odpowiednio z sześciu dołków i pojedynczych dołków MEA. Dodać 20 mikrolitrów lub 100 mikrolitrów roztworu podstawowego leku, który ma być odmierzony, do studzienki.

W zależności od typu MEA i ostrożnie pipetować w górę i w dół dwa do trzech razy. Pozwól związkom myć się przez 300 sekund. W tym czasie kształt liAP może przekształcić się w kształt FP.

Ponownie, indukowana laserem indukowana peracja i rejestruj możliwe defekty wywołane związkiem na liAP przez dodatkowe 60 sekund. Dodanie nifedypiny zmniejszyło fazę plateau liAP w sposób zależny od stężenia, a tym samym skróciło cały liAP. Skrócenie to było porównywalne z potencjałami pola kardiomiocytów z niemanipulowanych elektrod.

E-40 31 hamował repolaryzację odpowiednich kanałów potasowych KV w jednym punkcie 11 i prowadził do arytmicznego zachowania kardiomiocytów w zwiększonych stężeniach. Ponadto E-40 31 wydłużał czas trwania liAP w sposób zależny od stężenia. Pod koniec liAP zaobserwowano niewielkie odchylenia napięcia dodatniego przy 0,1 mikromola, które stawały się bardziej widoczne przy wyższych stężeniach, co wskazuje na przejściową nową depolaryzację zwaną EAD.

Przy najwyższym stężeniu 0,1 mikromola te EAD z czasem eskalowały do uderzeń ektopowych. Które są przedwczesnymi potencjałami czynnościowymi. EAD i pobudzenia ektopowe są kluczowymi wskaźnikami aktywności proarytmicznej.

A w końcu aktywność elektryczna powoduje arytmiczne dudnienie. Zależności stężenie-odpowiedź korelowały z zapisami FP i liAP. Ponadto, w obecności dofetylidu, zarówno FP, jak i liAP wykazywały czas trwania około dwóch sekund w tym samym dołku, przebieg FP wykazywał regularne odchylenia repolaryzacji.

Podczas gdy w liAP EAD są wykrywalne. Ważne jest, aby dostosować ostrość przed każdym melomenem, ponieważ nieostry obraz mikroskopowy może wpłynąć na otwarcie komórek. Również potencjał czynnościowy jest podejmowany wkrótce po tym, jak opterperacja powinna być wykorzystana do analizy.

Technika ta jest bardziej czuła w wykrywaniu wcześniejszych efektów arytmii w porównaniu ze standardowym MEA, co pozwala na dokładniejsze wykrywanie niepożądanych skutków złożonych.