Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

Pirosekwencjonowanie to sekwencjonowanie techniką syntezy, która może być stosowana do genotypowania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w mitochondrialnym DNA. Metoda ta jest korzystna ze względu na łatwość wdrożenia i opłacalność w porównaniu z innymi metodami sekwencjonowania. Może być z łatwością stosowany jako metoda diagnostyczna niektórych chorób mitochondrialnych poprzez określanie wartości heteroplazmii wariantów patogennych w mitochondrialnym DNA.

Na początek uzyskaj plik sekwencji mitochondrialnego DNA dla gatunku, który ma być genotypowany, i określ pozycję polimorfizmu pojedynczego nukleotydu lub SNP. Należy upewnić się, że zastosowana sekwencja referencyjna wykorzystuje odpowiednią numerację zasad dla badanej mutacji, tak aby można było łatwo zidentyfikować pozycję SNP. Skopiuj 1 000 par zasad przed i za witryną SNP i wklej obciętą sekwencję do oprogramowania do projektowania podkładu pirosekwencjonowego.

Podświetl bazę polimorficzną, kliknij ją prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierz Ustaw region docelowy, aby ustawić analizowaną zasadę SNP jako cel testu pirosekwencjonowania. Naciśnij ikonę odtwarzania w prawym górnym rogu interfejsu, aby uruchomić wybór starterów i poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie wygeneruje tria starterów, dwa startery do wstępnej amplifikacji matrycy DNA i trzeci starter do sekwencjonowania przez syntezę w maszynie do pirosekwencjonowania. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Kopiuj wszystkie zestawy podkładów, aby zachować wszystkie zestawy podkładów.

Otwórz oprogramowanie uruchamiające dostarczone z pysekwenserem, wybierz Nowy test, a następnie wybierz szablon testu kwantyfikacji alleli. Wprowadź sekwencję do analizy w odpowiednim polu, wpisując nukleotydy bezpośrednio za starterem sekwencjonowania. W przypadku zmiennej position oznacz dwie możliwe podstawy, oddzielone ukośnikiem.

Naciśnij przycisk Generuj kolejność dozowania i pozwól oprogramowaniu automatycznie określić odpowiednią kolejność nukleotydów, które mają być dozowane w sekwencjonowaniu w reakcji syntezy. Zapisz i podaj nazwę testu. Następnie wykonaj przebieg, rozcieńczając DNA, które ma być analizowane, do 5 nanogramów na mikrolitr.

W pierwszym uruchomieniu upewnij się, że dołączasz próbki znanej heteroplazmii jako odniesienie i próbki typu dzikiego. Następnie wykonaj sekwencjonowanie PCR z 5 mikrolitrami rozcieńczonego DNA i 25 mikrolitrami reakcji, używając starterów i parametrów amplifikacji. Aby uruchomić konfigurację pliku, wybierz opcję New Run (Nowy przebieg) w oprogramowaniu pyrosequencer.

Pirosekwencer może jednocześnie sekwencjonować 48 oddzielnych reakcji z preamplifikacją, z pustym kwadratem reprezentującym pojedynczy studzienek sekwencjonowania na krążku pirosekwencjonowania. Załaduj testy, klikając prawym przyciskiem myszy kwadrat i wybierając Załaduj test. W razie potrzeby zsekwencjonuj do czterech oddzielnych testów z różnymi starterami sekwencjonowania.

Ustaw tryb dozowania startera na automatyczny, aby automatycznie przypisać komorę wtryskową dla każdego startera sekwencjonującego używanego w serii. Ustaw tryb pracy na standardowy, chyba że uruchamiasz cztery różne typy testów na jednej tarczy sekwencjonowania. Upewnij się, że liczba testów w pliku szablonu przebiegu jest zgodna z liczbą amplifikowanych reakcji PCR.

Następnie zapisz uruchomione pliki na dysku USB. Aby zalać pirosekwencer, naciśnij przycisk czyszczenia na głównym ekranie dotykowym urządzenia i wyczyść wszystkie wtryskiwacze wodą o wysokiej czystości, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Podczas wkładania paska absorbera do maszyny upewnij się, że końce spotykają się w pozycji godziny 9.

Po podłączeniu pamięci USB naciśnij przycisk Sekwencja, aby załadować przygotowane wcześniej pliki uruchomione. Postępuj zgodnie z instrukcjami na urządzeniu, aby załadować i zalać odczynniki, zgodnie z wymaganiami, do odpowiednich wtryskiwaczy w maszynie. Załaduj 3 mikrolitry kulek do studzienek, a następnie załaduj 10 mikrolitrów każdej reakcji PCR, która ma być sekwencjonowana w odpowiedniej próbce.

Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać próbkę z kulkami magnetycznymi. Poszukaj wskazania w zagruntowanym pirosekwencerze, że dysk można załadować do maszyny. Odkręć nakrętkę mocującą płytkę i wyrównaj załadowaną płytkę z metalowym kołkiem w komorze dysku.

Po mocnym wkręceniu płytki w komorę na płytę, uruchom sekwencjonowanie, naciskając przycisk start na interfejsie ekranu dotykowego. Po zakończeniu działania odłącz dysk USB od komputera i podłącz go z powrotem do komputera, na którym działa oprogramowanie pirosekwencera. Po pojawieniu się nowo wygenerowanego pliku uruchamiania na dysku USB kliknij dwukrotnie plik Uruchom wynik.

To automatycznie analizuje wyjście lucyferazy z każdej studzienki po włączeniu nukleotydu i określa ilościowo interesujący nas allel mitochondrialny. Poszukaj wyników kolorów wyświetlanych przez oprogramowanie w oparciu o jakość odczytów. Aby zapisać wyniki, wybierz Raporty w górnym oknie, a następnie Pełny raport, aby wygenerować plik PDF zawierający pirogramy i wyniki z każdego odwiertu serii.

Alternatywnie można pobrać wyniki w innych formatach w zakładce Raporty. Elektroforeza w żelu agarozowym amplifikacji PCR przy użyciu starterów amplifikacyjnych z obu zestawów wybranych dla mutacji m. 3243A>G, jak pokazano na tym rysunku.

Tutaj Het oznacza prawie homoplazmatyczną próbkę m. 3243A>G, która ma być poddana analizie. Porównanie wydajności obu zestawów starterów przy użyciu wzorców molowych do kalibracji pokazano na tym rysunku.

Zmierzone wartości są oznaczone pionowymi liniami przerywanymi. Wyświetlana jest funkcja liniowa X=Y, aby zilustrować, jak blisko każdego z dwóch testowanych testów znajduje się idealny pomiar. Nazwy linii komórkowych na osi X są nazwami różnych klonów cybridów, które zostały zgenotypowane przy użyciu tego testu.

Wyniki genotypowania czterech klonów cybrydów o nieznanej heteroplazmii m. 3243A>G przy użyciu obu testów przedstawiono tutaj. Sekwencjonowanie przeprowadzono w trzech egzemplarzach technicznych.

Wyniki genotypowania mitochondrialnych komórek poddanych działaniu nukleazy palca cynkowego, wraz z kontrolami nietraktowanymi i pozorowanymi, a także pirogramy z dwóch powtórzeń PCR próbek komórek MEF użytych do wygenerowania wyników, a także kontrola genotypowania typu dzikiego. Pirosekwencjonowanie może być wykorzystywane jako odczyt dla eksperymentów terapii genowej w celu oceny różnych technologii terapii genowej w mitochondrialnym DNA.