Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia naukowcom dojrzewanie komercyjnych lub wytworzonych we własnym zakresie hiPSC-CM do fenotypu podobnego do dorosłego, który znacznie poprawia wartość predykcyjną hiPSC-CM w badaniach przesiewowych kardiotoksyczności. Główną zaletą tego protokołu jest to, że dostarcza dojrzałe hiPSC-CM w formacie o wysokiej przepustowości do optycznego mapowania zmian wapnia lub napięcia. Protokół ten może być wykorzystany do badania mechanizmów chorobowych lub do badań przesiewowych leków pod kątem kardiotoksyczności.

Procedurę zademonstruje Jeffrey Creech, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Rozpocznij od dwukrotnego umycia płytki indukującej dojrzewanie macierzy zewnątrzkomórkowej lub MECM 200 mikrolitrami zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS na 1 godzinę przed posiewem kardiomiocytów. Utrzymuj studzienki nawodnione.

Przenieś probówki kardiomiocytów ze zbiornika ciekłego azotu do suchego lodu i zwolnij ciśnienie, lekko otwierając nakrętki probówek. Następnie ponownie zamknij nakrętki probówek i rozmrażaj je w łaźni wodnej przez 4 minuty. Po rozmrożeniu komórek spryskaj probówki 70% etanolem przed ich otwarciem.

Przenieś komórki do 15-mililitrowych stożkowych probówek za pomocą 1-mililitrowej pipety. Dodaj 1 mililitr pożywki galwanicznej do kriowialu i przenieś popłuczynę do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie powoli wlej 1 mililitr podłoża galwanicznego i wymieszaj probówkę.

Powtarzaj to do momentu przeniesienia 8 mililitrów podłoża galwanicznego. Odwirować 15-mililitrową probówkę o sile 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze podłoża galwanicznego. Usuń podwielokrotność i wykonaj liczenie żywych komórek za pomocą hemocytometru przed dodaniem pożywki galwanicznej, aby uzyskać 7,5 x 10 do 5 komórek na mililitr.

Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na dołek 96-dołkowej płytki pokrytej MECM za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować komórki przez 2 dni. Następnie zastąp pożywkę 200 mikrolitrami pożywki konserwacyjnej i utrzymuj płytki przez 7 dni, ze zmianą podłoża w 5 dniu. W 7 dniu wykonaj test EP, zgodnie z opisem w tekście.

Upewnij się, że zmieniasz pożywkę co drugi dzień, decydując się na przedłużenie hodowli komórkowej. Aby oczyścić hiPSC-CM poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie lub MACS, odessać pożywkę do hodowli komórkowej i umyć komórki 1 mililitrem HBSS - Następnie zdysocjuj komórki, dodając 1 mililitr 0,25% trypsyny-etylenodiaminotetraoctanu lub EDTA i inkubuj komórki przez 10 minut. Następnie dezaktywuj trypsynę / EDTA, ponownie wysyłając i pojedynczo izolując komórki za pomocą 2 mililitrów pożywki galwanicznej.

Z sześciu dołków zbierz komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów. Po umyciu sitka 3 mililitrami podłoża galwanicznego policz komórki. Po zliczeniu odwirować i przepłukać osad komórkowy 2 mililitrami lodowatego buforu separacyjnego MACS przed granulowaniem i ponownym wysłaniem komórek do 80 mikrolitrów zimnego buforu separacyjnego MACS na 5 x 10 do 6. komórki.

Dodaj 20 mikrolitrów zimnego koktajlu ze zubożenia kardiomiocytów i wymieszaj zawiesinę przed inkubacją na lodzie przez 10 minut. Po umyciu komórek 4 mililitrami zimnego buforu separacyjnego MACS o stężeniu 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach zimnego buforu separacyjnego MACS. Dodaj 20 mikrolitrów zimnych mikrogranulek antybiotyny na 5 x 10 do 6. komórek i delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową przed inkubacją na lodzie przez 10 minut.

Podczas inkubacji próbek należy umieścić kolumny dodatniego zubożenia wyposażone w 30-mikrometrowe filtry do wstępnej separacji na separatorze MACS i umieścić oznakowane 15-mililitrowe probówki zbiorcze poniżej kolumn. Następnie zalej każdą kolumnę 3 mililitrami zimnego buforu separacyjnego MACS. Wymieszaj zawiesinę komórkową traktowaną przeciwciałem z 2 mililitrami buforu separacyjnego MACS i dodaj ją do kolumny.

Dodaj 2 mililitry buforu separacyjnego MACS do każdej kolumny i zbierz 12 mililitrów przepływowej zawiesiny kardiomiocytów. Odwirować kardiomiocyty i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem kardiomiocytów w 1-mililitrowym pożywce galwanicznej. Aby określić stężenie, policz komórki i dostosuj objętość do pożądanej gęstości wysiewu przed posiewem oczyszczonych komórek kardiomiocytów na 96-dołkowych płytkach MECM.

Odessać i zastąpić pożywkę podtrzymującą kardiomiocyty 100 mikrolitrami barwników wrażliwych na napięcie lub VSD lub fluoroforów wrażliwych na wapń lub płynu mózgowo-rdzeniowego na dołek 96-dołkowej płytki. Po 30 minutach inkubacji zastąp barwniki pożywką testową lub HBSS. Zrównoważ komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed uzyskaniem podstawowych danych mapowania optycznego za pomocą urządzenia do mapowania optycznego o wysokiej przepustowości.

Aby potraktować komórki lekami do badania ostrej ekspozycji lub zmapować komórki przewlekle narażone na działanie leków będących przedmiotem zainteresowania, rozcieńczyć leki w dimetylosulfotlenku lub DMSO i przechowywać je jako roztwory podstawowe w temperaturze 20 stopni Celsjusza przed rozcieńczeniem ich w HBSS do pożądanych stężeń. Do badania kardiotoksyczności na płytkach 96-dołkowych należy dodać cztery dawki związku przy co najmniej ośmiu dołkach na dawkę. Należy stosować dawki w zakresie od poniżej do powyżej klinicznie skutecznego stężenia terapeutycznego w osoczu, w tym dawki skutecznej.

Podobnie jak w przypadku podstawowych pomiarów elektrofizjologicznych przed zastosowaniem leku, w przypadku badań przewlekłych należy rejestrować zapisy elektrofizjologii co najmniej 30 minut po leczeniu farmakologicznym. Po zapisach wyjściowych należy zastosować co najmniej cztery dawki każdego leku do dojrzałych monowarstw hiPSC-CM wykazujących ekspresję GCaMP6m, z co najmniej ośmioma dołkami na dawkę. Równoważ leki na komórkach przez 30 minut i ogrzej komórki do 37 stopni Celsjusza przed i podczas zbierania danych.

Po podstawowych zapisach całej płytki dodaj 500 nanomolowych izoproterenolu do każdego dołka, aby uzyskać solidne dane dotyczące odpowiedzi na lek i określić ilościowo wpływ izoproterenolu na szybkość dudnień monowarstwy, amplitudę skurczu i czas trwania przejściowego wapnia. Aby uzyskać dane mapowania optycznego, otwórz przednią szufladę i umieść płytkę na podgrzewaczu płytowym. Po otwarciu oprogramowania do akwizycji i określeniu lokalizacji zapisu pliku w oprogramowaniu wybierz czas trwania od 10 do 30 sekund i liczbę klatek na sekundę w celu uzyskania wyższej rozdzielczości czasowej, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij akwizycję.

Otwórz oprogramowanie analityczne i na karcie Filtr importu wybierz opcję Przeglądaj w poszukiwaniu pojedynczego pliku lub Wielość kafelków, aby zrekonstruować blachę. Wybierz pliki i wprowadź liczbę wierszy i kolumn, a następnie wybierz opcję Automatycznie. Następnie wybierz opcję Aktualizuj rozmiar piksela, wprowadź odległość na piksel i użyj Kreatora studni, aby określić lokalizację studni na obrazie, zanim klikniesz przycisk Zapisz proces i przejdziesz do następnej karty.

Otwórz zakładkę ROIs, czyli Regiony zainteresowania, i wybierz, czy chcesz narysować ROI ręcznie, automatycznie, czy w ogóle nie używać ROI, które będą brane pod uwagę przy analizie całej płyty. Po wybraniu regionu w studni kliknij przycisk Zapisz proces, aby przejść do następnego kroku. Zaznacz pola Ukryj studnie i Pokaż tylko filtrowane, aby zwizualizować zwrot z inwestycji.

Otwórz kartę Analiza, wybierz każdą studnię lub ROI, aby potwierdzić dokładność automatycznego wykrywania dudnień. Dodaj lub usuń bity ze ścieżek, zaznaczając pojedyncze uderzenia i naciskając Delete na klawiaturze. Po zakończeniu kliknij Zapisz.

Następnie kliknij przycisk Wykres czasoprzestrzenny na karcie Analiza i dodaj linię, aby określić wykres czasoprzestrzenny, aby zwizualizować dane dla każdego odwiertu lub ROI. Po wybraniu linii poziomej lub pionowej kliknij przycisk Generuj wykres. Po upewnieniu się, że wykrywanie dudnień jest dokładne, przejdź do zakładki Eksport i wybierz Format pliku, wprowadź opcję Statystyka dudnienia przed kliknięciem Eksportuj.

Po wyeksportowaniu otwórz pliki danych i uruchom wybraną procedurę analizy statystycznej. Obrazowanie z kontrastem fazowym wykazało, że hiPSC-CM platerowane na MECM dojrzały i stały się strukturalnie odrębne od tej samej partii hiPSC-CM ponownie podanych na mysim ECM. Dojrzałe komórki przybrały kształt pręcika, podczas gdy niedojrzałe komórki zachowały okrągły kształt.

Kardiomiocyty wybarwione przeciwciałami alfa-aktyniny wykazywały typowy kształt komórek hodowanych w każdym stanie ECM. Zgodnie z barwieniem TnI, barwienie alfa-aktyniną wykazało, że hiPSC-CM dojrzewające na MECM promowały dojrzały fenotyp w kształcie pręcika i indukowały większą organizację sarkomerów. Zawartość i aktywność mitochondriów były różne między komórkami hodowanymi na mysim ECM i MECM.

Dane elektrofizjologiczne dotyczące potencjałów czynnościowych zarejestrowanych za pomocą VSD i systemu mapowania optycznego wykazały, że komórki specyficzne dla przedsionków mają znacznie szybszy spontaniczny wskaźnik dudnienia i krótszy czas trwania potencjału czynnościowego (APD80) niż komórki specyficzne dla komór. Mapy cieplne całej płyty dla parametrów takich jak APD80 ujawniły odtwarzalność danego parametru w obrębie płyty. Typowe potencjały czynnościowe dojrzałych monowarstw hiPSC-CM wskazywały na morfologię potencjału czynnościowego izolowanych i badanych dorosłych kardiomiocytów.

Wykazano również typowy spontaniczny rytm potencjału czynnościowego. W odpowiedzi na izoproterenol aktywacja receptorów beta-1-adrenergicznych spowodowała dodatnią chronotropię, dodatnią inotropię i dodatnią lusitropię. Odpowiedź HiPSC-CM na ludzki gen związany z Ether-a-go-go lub hERG bloker kanałów, w tym E-4031, domperydon, wandetanib i sotalol, badano przy użyciu fluorescencji wapnia GCaMP6m do monitorowania rytmu.

W badaniu wykazano wykrycie wczesnych depolaryzacji pozabiegowych spowodowanych blokadą kanału hERG E-4031. Pracuj szybko z komórkami w zawiesinie i unikaj naprężeń ścinających, delikatnie pipetując komórki. Dodatkowo należy ostrożnie wymieniać pożywki, aby uniknąć uszkodzenia syncytii hiPS.

Po tej procedurze komórki są podatne na pobieranie białek, RNA, DNA i lipidów do analizy za pomocą ulubionej techniki badaczy. Technika ta umożliwia naukowcom badanie chorób i testowanie kardiotoksyczności nowych leków przy użyciu kardiomiocytów podobnych do dorosłych.