Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA
9 sierpnia 2022
Protokół przedstawia dwie metody określania kinetyki aptamerów fluorogennego RNA: Szpinak2 i Brokuły. Pierwsza metoda opisuje, w jaki sposób mierzyć kinetykę aptamerów fluorogennych in vitro za pomocą czytnika płytkowego, podczas gdy druga metoda szczegółowo opisuje pomiar kinetyki aptamerów fluorogennych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.
Badanie in vitro i komórkowej kinetyki fluorogenicznych aptamerów pozwala użytkownikowi ocenić, czy interakcje barwnika aptamerowego są wystarczająco szybkie, aby zbadać interesujący go proces w czasie rzeczywistym. Przedstawione techniki pozwalają na ilościowe pomiary kinetyczne zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki, z których każdy może być istotny w zależności od zastosowania aptameru. Przedstawione metody można zastosować do dowolnego fluorogennego układu RNA, w tym alternatywnych aptamerów i bioczujników opartych na RNA dla małych cząsteczek.
Aby rozpocząć, skonfiguruj program renaturacji RNA z termocyklera. Utwórz program, wybierając opcję utwórz nowy program"dodaj nową fazę"i dodaj nowy krok"wiele razy, aby dodać kroki specyficzne dla temperatury przed naciśnięciem przycisku Zapisz"Dostosuj dodatkowe ustawienia zgodnie z programem. Aby zrenaturyzować RNA szpinaku dwa i brokuły, przygotuj dwie mikromolowe łodygi każdego RNA w podwójnie destylowanej wodzie w cienkościennej probówce PCR o pojemności 0,5 mililitra.
Następnie dodaj równe objętości dwukrotnego buforu renaturyzacyjnego, aby uzyskać jeden mikromolowy roztwór RNA. Umieść probówki w termocyklerze. Otwórz zapisany program renaturyzacji i naciśnij uruchom"Następnie skonfiguruj program wtryskiwacza czytnika płytek.
Na czytniku płytek fluorescencyjnych wybierz temperaturę" i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem kinetyki upewnij się, że temperatura zrównoważyła się do tej wartości. Otwórz oprogramowanie czytnika tabliczek.
Wybierz ustawienia"następnie widok akwizycji"aby wprowadzić program do pomiarów kinetycznych, wybierz pętlę"dla każdej studni. Następnie ustaw ustawienie linii bazowej na 60 odczytów linii bazowej i ustawienia inteligentnego wstrzykiwania dla wstrzykiwania 10 mikrolitrów. Ustaw fluorescencję odczytującą długość fali wzbudzenia na 448 nanometrów, długość fali emisji na 506 nanometrów, a wkład na mono.
Ustaw całkowity czas odczytu na 10 minut z interwałem odczytu 0,5 sekundy. Ustaw PMT i optykę na sześć błysków na odczyt. Następnie wprowadź pętlę do następnego dołka.
Aby przygotować wtryskiwacz do czytnika płytek, wybierz wstrzyknięcie" na czytniku płytek i dostarcz płytkę do zbierania odpadów, jeśli zostanie to skierowane. Następnie wybierz mycie" i wyczyść rurkę iniekcyjną zgodnie z instrukcjami na czytniku płytek za pomocą mililitrowej objętości podwójnie destylowanej wody, 75% etanolu, a następnie wody destylowanej. Następnie wybierz aspirat"pozwalając wtryskiwaczowi wyrzucić nadmiar cieczy.
Następnie wybierz prime", aby zalać wtryskiwacz dwoma 260 mikrolitrami 100 mikromolowych D F H B I.To wykonaj jeden eksperyment kinetyczny, dodaj 80 mikrolitrów głównej mieszanki buforu wiążącego do jednego dołka 96-dołkowej przezroczystej płytki dolnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów zrenaturyzowanego RNA. Pozostawić płytkę i roztwór D F H B I we wtryskiwaczu do zrównoważenia do 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie wybierz studnię do analizy w ustawieniach oprogramowania w obszarze odczytu. Następnie na karcie głównej wybierz uruchom"aby wykonać opisany wcześniej program kinetyczny. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie eksperymenty zostaną zakończone.
Po zakończeniu pracy należy umyć wtryskiwacz, aby usunąć pozostały roztwór D F H B I z rurki iniekcyjnej, jak pokazano wcześniej. Aby skonfigurować pliki eksperymentalne, włącz cytometr przepływowy i komputer. Utwórz nowy plik na karcie eksploratora eksperymentów, klikając prawym przyciskiem myszy cytometr przepływowy"nazwa użytkownika.
Następnie wybierz nowy eksperyment"w oknie rozwijanym, a gdy pojawi się nowe okno na ekranie komputera, wybierz typ eksperymentu jako probówki"a następnie wybierz w porządku"W nowym pliku eksperymentu kliknij prawym przyciskiem myszy folder grupy i wybierz dodaj nową probówkę z próbką"Oznacz probówki z próbkami dla każdego określonego punktu czasowego i powtórz, klikając prawym przyciskiem myszy próbkę"i wybierając zmień nazwę"w menu rozwijanym. Następnie przygotuj rozcieńczony roztwór komórkowy, dodając 1,5 mililitra jednego X P B S i trzy mikrolitry indukowanych komórek w pożywce AI w probówce hodowlanej. Przed dodaniem barwnika zmierz fluorescencję tła komórek, aby zaobserwować, jak fałd włącza się z czasem.
Po dodaniu barwnika umieść probówkę hodowlaną zawierającą komórki w PBS w podnośniku probówki z próbką i podnieś podnośnik do igły do wstrzykiwania próbki. Następnie wybierz odpowiedni plik próbki na karcie panelu pobierania i kliknij przycisk nagrywania"Po zakończeniu przebiegu opuść ręcznie podnośnik probówki z próbką za pomocą probówki hodowlanej. Aby zainicjować etap płukania, przepłukać układ fluidyczny i zminimalizować przenoszenie między każdą próbką repliki biologicznej.
Aby przejść do następnego przykładu, wybierz następny przykładowy plik, klikając ikonę strzałki w prawo obok nazwy probówki z próbką pod ikoną rekordu. Aby zmierzyć fluorescencję komórek za pomocą barwnika, dodaj 1,4 mikrolitra skoncentrowanego barwnika do jednego X P B S z komórkami, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mikromolowych D F H B I jeden T. Zabezpiecz pokrywę probówki hodowlanej i odwróć trzy do pięciu razy, aby równomiernie wymieszać roztwór. Następnie zdejmij pokrywkę i umieść probówkę hodowlaną w podnośniku probówki na próbkę.
Po podniesieniu uchwytu do igły do wstrzykiwania próbki, kliknij ikonę rekordu pod odpowiednim plikiem próbki. Następnie uruchom timer, naciskając start"Kinetyka in vitro aptamerów fluorogenicznych, szpinaku dwa i brokułów, wykazywała dwufazową kinetykę asocjacyjną do wiązania z barwnikiem D F H B I. W przypadku obu aptamerów dane kinetyki były lepiej dopasowane przez asocjację dwufazową niż jednofazową w długim czasie pomiaru.
Krzywa najlepszego dopasowania określała stałe szybkości i wartości półtrwania dla szybkich i wolnych asocjacji. Szpinak dwa w stanie kompetencji wiązania, wykazywał szybsze włączanie niż brokuły. Kinetyka drugiej fazy dla obu aptamerów jest podobna i może odpowiadać wspólnemu krokowi ograniczającemu szybkość.
Krzywe kinetyczne aptamerów składają się z podobnego stopnia szybko asocjujących RNA. W przypadku komórek wykazujących ekspresję dwóch T RNA szpinaku średnia intensywność fluorescencji lub MFI wzrasta natychmiast w zerowym punkcie czasowym. Co więcej, fluorescencja komórkowa osiągnęła maksymalną zrównoważoną wartość MFI w ciągu pięciu minut.
Natomiast komórki kontrolne wykazały niską fluorescencję tła i brak zmian w wartościach MFI z dodatkiem D M S O Przedstawione metody pozwalają naukowcom określić, w jaki sposób mogą przyspieszyć czujniki oparte na RNA w aptamerach fluorogenicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje dwie metody wyznaczania kinetyki fluorogennych aptamerów RNA Spinach2 i Broccoli. Pierwsza metoda wykorzystuje czytnik płytek do pomiarów in vitro, natomiast druga wykorzystuje cytometrię przepływową do pomiarów komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia molekularna
Wprowadzenie
- Fluorogenne aptamery RNA są przydatne do badań interakcji molekularnych w czasie rzeczywistym.
- Zrozumienie kinetyki aptamerów jest kluczowe dla ich zastosowania w różnych procesach biologicznych.
- Metody te mogą zostać dostosowane do różnych systemów RNA oraz biosensorów.
- Techniki pomiarowe obejmują środowiska in vitro oraz komórkowe.
Cel badania
- Ocena kinetyki aptamerów RNA w czasie rzeczywistym.
- Przedstawienie metodologii możliwej do zastosowania w różnych fluorogennych systemach RNA.
- Ułatwienie ilościowych pomiarów oddziaływań aptamerów.
Zastosowane metody
- Pomiary kinetyczne in vitro z użyciem czytnika płytek.
- Pomiary kinetyczne w komórkach z użyciem cytometrii przepływowej.
- Konfiguracja programu renaturacji RNA w termocyklerze.
- Przygotowanie próbek RNA w probówkach do PCR.
Główne wyniki
- Skuteczny pomiar kinetyki aptamerów in vitro oraz w komórkach.
- Wykazanie szybkich oddziaływań aptamer-barwnik, odpowiednich do badań w czasie rzeczywistym.
- Metody możliwe do zastosowania w różnych biosensorach opartych na RNA.
- Uzyskanie danych ilościowych dla obu konfiguracji eksperymentalnych.
Wnioski
- Przedstawione metody umożliwiają efektywne badanie kinetyki aptamerów RNA.
- Zarówno pomiary in vitro, jak i komórkowe są możliwe do przeprowadzenia i dostarczają cennych informacji.
- Techniki te mogą przyczynić się do rozwoju badań nad zastosowaniami opartymi na RNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczenie kinetyki włączania (turn-on) fluorogennego aptameru RNA jest kluczowe dla umożliwienia wizualizacji RNA w czasie rzeczywistym oraz zastosowań biosensorów w systemach żywych komórek. Dokładne profilowanie kinetyczne zapewnia, że oddziaływania między aptamerem a barwnikiem są wystarczająco szybkie, aby wspierać dynamiczne badania ekspresji genów i sygnalizacji metabolitów. Możliwość ta bezpośrednio wpływa na pewność prognostyczną i wartość translacyjną narzędzi odkrywczych opartych na RNA w całym procesie rozwoju produktów biofarmaceutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wspiera analizę funkcji RNA oraz aktywności szlaków w żywych komórkach.
- Umożliwia redukcję ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie, że responsywność aptameru jest zgodna z ramami czasowymi eksperymentu.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla biosensorów i reporterów opartych na RNA.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia zwalidowane parametry kinetyczne służące do standaryzacji i powtarzalności testu.
- Umożliwia opracowanie testów wysokoprzepustowego przesiewu dla związków celujących w RNA.
- Dostarcza ilościowe wyniki niezbędne do wiarygodnej oceny i porównania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje wydajność biosensora do modeli komórkowych istotnych dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój narzędzi opartych na RNA w ramach procesów przedklinicznych.
- Poprawia predykcyjną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację kinetyki aptamerów w kontekstach fizjologicznie istotnych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Opisane metody pomiarów kinetycznych stanowią pomost między wczesną fazą odkryć, opracowywaniem testów a badaniami translacyjnymi, zapewniając podstawy do skutecznego wdrażania narzędzi opartych na RNA.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie ścieżek sygnałowych poprzez ilościowe określanie dynamiki RNA w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Pozwala na ustalenie gotowości i powtarzalności testu za pomocą zestandaryzowanych punktów odniesienia kinetyki.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów fluorescencji oraz stałych szybkości kinetycznych do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Zapewniają zgodność kinetyki biosensorów z wymaganiami modeli przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowalny schemat postępowania dla różnorodnych fluorogennych systemów RNA i biosensorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach ukierunkowanych na RNA.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, reprodukowalne i skalowalne protokoły pomiarów kinetycznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową w opracowywaniu narzędzi do badania RNA.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów odkrywczych opartych na RNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z RNA oraz w kinetycznej analizie opartej na fluorescencji.
- Metoda zależy od dostępu do czytników płytek z iniektorem oraz aparatury do cytometrii przepływowej.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów pomiarów kinetycznych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych fluorogennych aptamerów RNA i platform biosensorycznych.
- Ograniczeniem są szybkości dyfuzji oraz charakterystyka pobierania przez komórki specyficznych barwników i typów komórek.
