Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA
August 9th, 2022
Protokół przedstawia dwie metody określania kinetyki aptamerów fluorogennego RNA: Szpinak2 i Brokuły. Pierwsza metoda opisuje, w jaki sposób mierzyć kinetykę aptamerów fluorogennych in vitro za pomocą czytnika płytkowego, podczas gdy druga metoda szczegółowo opisuje pomiar kinetyki aptamerów fluorogennych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.
Badanie in vitro i komórkowej kinetyki fluorogenicznych aptamerów pozwala użytkownikowi ocenić, czy interakcje barwnika aptamerowego są wystarczająco szybkie, aby zbadać interesujący go proces w czasie rzeczywistym. Przedstawione techniki pozwalają na ilościowe pomiary kinetyczne zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki, z których każdy może być istotny w zależności od zastosowania aptameru. Przedstawione metody można zastosować do dowolnego fluorogennego układu RNA, w tym alternatywnych aptamerów i bioczujników opartych na RNA dla małych cząsteczek.
Aby rozpocząć, skonfiguruj program renaturacji RNA z termocyklera. Utwórz program, wybierając opcję utwórz nowy program"dodaj nową fazę"i dodaj nowy krok"wiele razy, aby dodać kroki specyficzne dla temperatury przed naciśnięciem przycisku Zapisz"Dostosuj dodatkowe ustawienia zgodnie z programem. Aby zrenaturyzować RNA szpinaku dwa i brokuły, przygotuj dwie mikromolowe łodygi każdego RNA w podwójnie destylowanej wodzie w cienkościennej probówce PCR o pojemności 0,5 mililitra.
Następnie dodaj równe objętości dwukrotnego buforu renaturyzacyjnego, aby uzyskać jeden mikromolowy roztwór RNA. Umieść probówki w termocyklerze. Otwórz zapisany program renaturyzacji i naciśnij uruchom"Następnie skonfiguruj program wtryskiwacza czytnika płytek.
Na czytniku płytek fluorescencyjnych wybierz temperaturę" i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem kinetyki upewnij się, że temperatura zrównoważyła się do tej wartości. Otwórz oprogramowanie czytnika tabliczek.
Wybierz ustawienia"następnie widok akwizycji"aby wprowadzić program do pomiarów kinetycznych, wybierz pętlę"dla każdej studni. Następnie ustaw ustawienie linii bazowej na 60 odczytów linii bazowej i ustawienia inteligentnego wstrzykiwania dla wstrzykiwania 10 mikrolitrów. Ustaw fluorescencję odczytującą długość fali wzbudzenia na 448 nanometrów, długość fali emisji na 506 nanometrów, a wkład na mono.
Ustaw całkowity czas odczytu na 10 minut z interwałem odczytu 0,5 sekundy. Ustaw PMT i optykę na sześć błysków na odczyt. Następnie wprowadź pętlę do następnego dołka.
Aby przygotować wtryskiwacz do czytnika płytek, wybierz wstrzyknięcie" na czytniku płytek i dostarcz płytkę do zbierania odpadów, jeśli zostanie to skierowane. Następnie wybierz mycie" i wyczyść rurkę iniekcyjną zgodnie z instrukcjami na czytniku płytek za pomocą mililitrowej objętości podwójnie destylowanej wody, 75% etanolu, a następnie wody destylowanej. Następnie wybierz aspirat"pozwalając wtryskiwaczowi wyrzucić nadmiar cieczy.
Następnie wybierz prime", aby zalać wtryskiwacz dwoma 260 mikrolitrami 100 mikromolowych D F H B I.To wykonaj jeden eksperyment kinetyczny, dodaj 80 mikrolitrów głównej mieszanki buforu wiążącego do jednego dołka 96-dołkowej przezroczystej płytki dolnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów zrenaturyzowanego RNA. Pozostawić płytkę i roztwór D F H B I we wtryskiwaczu do zrównoważenia do 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie wybierz studnię do analizy w ustawieniach oprogramowania w obszarze odczytu. Następnie na karcie głównej wybierz uruchom"aby wykonać opisany wcześniej program kinetyczny. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie eksperymenty zostaną zakończone.
Po zakończeniu pracy należy umyć wtryskiwacz, aby usunąć pozostały roztwór D F H B I z rurki iniekcyjnej, jak pokazano wcześniej. Aby skonfigurować pliki eksperymentalne, włącz cytometr przepływowy i komputer. Utwórz nowy plik na karcie eksploratora eksperymentów, klikając prawym przyciskiem myszy cytometr przepływowy"nazwa użytkownika.
Następnie wybierz nowy eksperyment"w oknie rozwijanym, a gdy pojawi się nowe okno na ekranie komputera, wybierz typ eksperymentu jako probówki"a następnie wybierz w porządku"W nowym pliku eksperymentu kliknij prawym przyciskiem myszy folder grupy i wybierz dodaj nową probówkę z próbką"Oznacz probówki z próbkami dla każdego określonego punktu czasowego i powtórz, klikając prawym przyciskiem myszy próbkę"i wybierając zmień nazwę"w menu rozwijanym. Następnie przygotuj rozcieńczony roztwór komórkowy, dodając 1,5 mililitra jednego X P B S i trzy mikrolitry indukowanych komórek w pożywce AI w probówce hodowlanej. Przed dodaniem barwnika zmierz fluorescencję tła komórek, aby zaobserwować, jak fałd włącza się z czasem.
Po dodaniu barwnika umieść probówkę hodowlaną zawierającą komórki w PBS w podnośniku probówki z próbką i podnieś podnośnik do igły do wstrzykiwania próbki. Następnie wybierz odpowiedni plik próbki na karcie panelu pobierania i kliknij przycisk nagrywania"Po zakończeniu przebiegu opuść ręcznie podnośnik probówki z próbką za pomocą probówki hodowlanej. Aby zainicjować etap płukania, przepłukać układ fluidyczny i zminimalizować przenoszenie między każdą próbką repliki biologicznej.
Aby przejść do następnego przykładu, wybierz następny przykładowy plik, klikając ikonę strzałki w prawo obok nazwy probówki z próbką pod ikoną rekordu. Aby zmierzyć fluorescencję komórek za pomocą barwnika, dodaj 1,4 mikrolitra skoncentrowanego barwnika do jednego X P B S z komórkami, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mikromolowych D F H B I jeden T. Zabezpiecz pokrywę probówki hodowlanej i odwróć trzy do pięciu razy, aby równomiernie wymieszać roztwór. Następnie zdejmij pokrywkę i umieść probówkę hodowlaną w podnośniku probówki na próbkę.
Po podniesieniu uchwytu do igły do wstrzykiwania próbki, kliknij ikonę rekordu pod odpowiednim plikiem próbki. Następnie uruchom timer, naciskając start"Kinetyka in vitro aptamerów fluorogenicznych, szpinaku dwa i brokułów, wykazywała dwufazową kinetykę asocjacyjną do wiązania z barwnikiem D F H B I. W przypadku obu aptamerów dane kinetyki były lepiej dopasowane przez asocjację dwufazową niż jednofazową w długim czasie pomiaru.
Krzywa najlepszego dopasowania określała stałe szybkości i wartości półtrwania dla szybkich i wolnych asocjacji. Szpinak dwa w stanie kompetencji wiązania, wykazywał szybsze włączanie niż brokuły. Kinetyka drugiej fazy dla obu aptamerów jest podobna i może odpowiadać wspólnemu krokowi ograniczającemu szybkość.
Krzywe kinetyczne aptamerów składają się z podobnego stopnia szybko asocjujących RNA. W przypadku komórek wykazujących ekspresję dwóch T RNA szpinaku średnia intensywność fluorescencji lub MFI wzrasta natychmiast w zerowym punkcie czasowym. Co więcej, fluorescencja komórkowa osiągnęła maksymalną zrównoważoną wartość MFI w ciągu pięciu minut.
Natomiast komórki kontrolne wykazały niską fluorescencję tła i brak zmian w wartościach MFI z dodatkiem D M S O Przedstawione metody pozwalają naukowcom określić, w jaki sposób mogą przyspieszyć czujniki oparte na RNA w aptamerach fluorogenicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje dwie metody określania kinetyki fluorogenicznych aptamerów RNA Spinach2 i Broccoli. Pierwsza metoda wykorzystuje czytnik płytek do pomiarów in vitro, podczas gdy druga wykorzystuje cytometrię przepływową do pomiarów komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia molekularna
Tło
- Fluorogeniczne aptamery RNA są przydatne w badaniach interakcji molekularnych w czasie rzeczywistym.
- Rozumienie kinetyki aptamerów jest kluczowe dla ich zastosowania w różnych procesach biologicznych.
- Metody te mogą być dostosowane do różnych systemów RNA i biosensorów.
- Techniki pomiarowe obejmują środowiska in vitro i komórkowe.
Cel badania
- Ocena kinetyki aptamerów RNA w czasie rzeczywistym.
- Dostarczenie metodologii stosowanych do różnych fluorogenicznych systemów RNA.
- Ułatwienie ilościowych pomiarów interakcji aptamerów.
Stosowane metody
- In vitro pomiary kinetyczne przy użyciu czytnika płytek.
- Pomiar kinetyki komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej.
- Ustawienia programu renaturacji RNA w termocyklerze.
- Przygotowanie próbek RNA w probówkach PCR.
Główne wyniki
- Pomyślne pomiary kinetyki aptamerów in vitro i w komórkach.
- Wykazane szybkie interakcje aptamer-barwnik nadające się do badań w czasie rzeczywistym.
- Metody nadające się do różnych biosensorów opartych na RNA.
- Dane ilościowe uzyskane dla obu ustawień eksperymentu.
Wnioski
- Przedstawione metody umożliwiają skuteczne badanie kinetyki aptamerów RNA.
- Pomiar in vitro i komórkowy są wykonalne i informacyjne.
- Te techniki mogą postępować w badaniach nad zastosowaniami opartymi na RNA.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative determination of fluorogenic RNA aptamer turn-on kinetics is critical for enabling real-time RNA visualization and biosensor applications in live-cell systems. Accurate kinetic profiling ensures that aptamer-dye interactions are sufficiently rapid to support dynamic studies of gene expression and metabolite signaling. This capability directly impacts the predictive confidence and translational value of RNA-based discovery tools across the biopharma pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of RNA function and pathway activity in live cells.
- Enables biological de-risking by confirming aptamer responsiveness aligns with experimental timescales.
- Facilitates functional target validation for RNA-based biosensors and reporters.
Screening & Assay Development
- Provides validated kinetic parameters for assay standardization and reproducibility.
- Enables development of high-throughput screening assays for RNA-targeted compounds.
- Delivers quantitative outputs essential for reliable compound evaluation and comparison.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biosensor performance with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-based tools into preclinical workflows.
- Improves predictive de-risking by quantifying aptamer kinetics in physiologically relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
These kinetic measurement methods integrate at the interface of early discovery, assay development, and translational research, providing a foundation for robust RNA-based tool deployment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by quantifying real-time RNA dynamics.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility through standardized kinetic benchmarks.
- Analytics: Supplies quantitative fluorescence readouts and kinetic rate constants for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures biosensor kinetics are compatible with preclinical model requirements.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse fluorogenic RNA systems and biosensors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurement protocols.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and enhances capital efficiency in RNA tool development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-based discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and fluorescence-based kinetic analysis.
- Depends on access to plate readers with injectors and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of kinetic measurement protocols.
- Adaptable to a range of fluorogenic RNA aptamers and biosensor platforms.
- Limited by the diffusion rates and cellular uptake characteristics of specific dyes and cell types.
