Name: Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metody wyznaczania kinetyki fluorogenicznych aptamerów RNA in vitro i w komórkach. Wykorzystaj czytnik płytek oraz cytometrię przepływową do ilościowych pomiarów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez następujące granty dla MCH: NSF-BSF 1815508 i NIH R01 GM124589. MRM był częściowo wspierany przez grant szkoleniowy NIH T32 GM122740.

<ol><li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li>
<li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li>
<li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li>
<li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li>
<li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li>
<li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139(2016).</li>
<li>Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194(2012).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li>
<li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li>
<li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li>
<li>Szatmári, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002(2020).</li>
<li>Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIVE%2FDEAD%C2%AE+BacLightTM%3A+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li>
<li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li>
<li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W przypadku eksperymentu kinetyki in vitro ten sam ogólny protokół można zmodyfikować w celu pomiaru kinetyki in vitro biosensora fluorescencyjnego opartego na RNA, zawierającego zarówno domenę wiążącą ligand, jak i fluoroforową8. W takim przypadku RNA powinno być inkubowane z fluoroforem przed pomiarami po wstrzyknięciu liganda w celu uzyskania kinetyki odpowiedzi liganda. Jeśli zaobserwuje się dużą zmienność między kontrpróbami, można rozwiązać problem, sprawdzając, czy każda p...

Reakcje fluorogenne to reakcje chemiczne, które generują sygnał fluorescencyjny. Aptamery fluorogennego RNA zazwyczaj pełnią tę funkcję poprzez wiązanie barwnika o małej cząsteczce w celu zwiększenia jego fluorescencji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) 1. Opracowano różne systemy aptamerów fluorogennego RNA, które składają się ze specyficznych sekwencji aptamerów RNA i odpowiadających im ligandów barwnikowych1. Aptamery fluorogennego RNA zostały dołączone do transkryptów RNA jako znaczniki fluorescencyjne, które umożliwiają obrazowanie żywych komórek mRNA i niekodujących RNA2,3,4. Zostały one również umieszczone po sekwencjach promotorowych jako fluorescencyjne reportery ekspresji genów, podobnie jak w przypadku użycia białka zielonej fluorescencji (GFP) jako reportera, z wyjątkiem tego, że funkcja raportowania jest na poziomie RNA5,6. Wreszcie, aptamery fluorogennego RNA zostały włączone do biosensorów fluorescencyjnych opartych na RNA, które są zaprojektowane do wyzwalania reakcji fluorogenicznej w odpowiedzi na określoną małą cząsteczkę. Biosensory fluorescencyjne oparte na RNA zostały opracowane do obrazowania żywych komórek różnych niefluorescencyjnych metabolitów i cząsteczek sygnałowych7,8,9,10,11.
Rośnie zainteresowanie rozwojem aptamerów fluorogennego RNA do wizualizacji dynamicznych zmian w lokalizacji RNA, ekspresji genów i sygnałach małocząsteczkowych. Dla każdego z tych zastosowań pożądane jest uzyskanie pomiarów w czasie rzeczywistym, ale dokładność pomiarów zależy od kinetyki reakcji fluorogenicznej, która jest szybsza niż częstotliwość próbkowania. W tym miejscu opisujemy metody określania kinetyki in vitro dla aptamerów fluorogennego RNA Spinach212 i Broccoli13 za pomocą czytnika płytek wyposażonego w wstrzykiwacz próbki oraz określania kinetyki włączania komórkowego dla Spinach2 wyrażonego w Escherichia coli za pomocą cytometru przepływowego. Te dwa aptamery RNA zostały wybrane, ponieważ zostały zastosowane do badania lokalizacji RNA2,3,4, były używane w reporters5, 6 i biosensors7,8,9,10,11i odpowiednie ligandy barwnikowe (DFHBI lub DFHBI-1T) są dostępne w handlu. Podsumowanie ich właściwości in vitro określonych w literaturze znajduje się w tabeli 14,13,14, które wpłynęły na opracowanie protokołu (np. użyte długości fal i stężenia barwnika). Wyniki te pokazują, że reakcje fluorogenne, na które wpływają aptamery RNA, są szybkie i nie powinny utrudniać dokładnych pomiarów dla pożądanych zastosowań biologicznych komórek.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>BP160500</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy w żelu agarozowym</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1A-BP</td><td></td></tr><tr><td>Alpha D-(+)-laktoza monohydrat</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18-600-440</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynowe probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Cytometr przepływowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24861</td><td></td></tr><tr><td>Attune 1x płyn do ustawiania ostrości</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24904</td><td></td></tr><tr><td>Attune Shutdown Solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24975</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki śledzące wydajność Attune</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4449754</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do mycia Attune</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>&nbsp; J24974</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa karbenicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz chlorowy</td><td>Amazon</td><td>B07J6FJR8D</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96-dołkowa płytka</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF86610A</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane, 12 mm x 75 mm, 5 ml z dołączoną dwupozycyjną nasadką</td><td>Globe Scientific</td><td>05-402-31</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2697</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza (bezwodna)</td> <td>Acros Organics</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td> Barwnik ładujący DNA <td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>Probówki DNA LoBind (2,0 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8,0</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet z końcówką filtrującą</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td> BD <td>Biosciences</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie FlowJo v10</td></tr><tr><td>Czytnik płytek fluorescencyjnych z kontrolą ogrzewania</td><td>VWR</td><td>10014-924</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz do elektroforezy żelowej</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>EC3000XL2</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen AM95010</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM95010</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>z licencji Academic Group&nbsp;</td></tr><tr><td>Blok grzewczy&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159Z11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Nieorganiczna pirofosfataza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Drabina DNA o niskiej masie cząsteczkowej</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233L</td><td>Dostarczana z bezpłatną fiolką z barwnikiem ładującym żel, fioletowy (6x), bez SDS (NEB #B7025).</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Probówki</td> do mikrowirówek Fisher Scientific <td>MFCD00011110</td><td></td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td><td>Mikrowirówka Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>z regulacją temperatury</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Gilson</td><td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M Końcówki</td><td></td></tr><tr><td>do mikropipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td><td></td></tr><tr><td>Filtr do wody Millipore z jednostką BioPak</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td><td></td></tr><tr><td>Wąskie końcówki do pipet do mikropipet</td><td>DOT Scientific</td><td>RN005R-LRS</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Thermo Fischer Zestaw</td><td></td> do czyszczenia BP39920 <td></td></tr><tr><td>Scientific PCR</td><td>Startery i szablony Qiagen</td><td>28181</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td><td></td>DNA</tr><tr><td>Termocykler PCR do cienkościennych probówek PCR Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>PCR do probówek 0,5 ml</td><td>Techne</td><td>5PRIME/C</td><td></td></tr><tr><td>pET31b-T7-Spinach2</td><td>Plasmid Addgene</td><td>Plazmid #79783</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion High-Fidelity&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Zakup enzymu Phusion High-Fideldity jest dostarczany z 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer oraz roztworami MgCl2 i DMSO.</td></tr><tr><td>Grzebień żelowy do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, C.B.S. Scientific</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>VGC-1508</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Genesee Naukowe</td><td>38-101</td><td></td></tr><tr><td>rNTP: ATP, CTP, GTP, UTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Krótkofalowe źródło światła UV</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11758221</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>Sód chlorek (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodny</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S375-500</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td>SoftMax Pro 6.5.1 (oprogramowanie do czytnika płytek) uzyskane na podstawie licencji Academic Group</td></tr><tr><td>Sterylne jednostki filtrujące</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>09-741-88</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE do elektroforezy w żelu agarozowym</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Baza</td> <td>TrisSigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Trypton (granulowany)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>System żelowy Mocznik-PAGE&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjna płytka TLC UV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05789.0001</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/Vis</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>2215415</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy (granulowany)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr></tbody></table>

wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów rna

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

Aptamery fluorogennego RNA zostały zastosowane w żywych komórkach do oznaczania i wizualizacji RNA, raportowania ekspresji genów i aktywacji biosensorów fluorescencyjnych, które wykrywają poziomy metabolitów i cząsteczek sygnałowych. W celu zbadania zmian dynamicznych w każdym z tych układów pożądane jest uzyskanie pomiarów w czasie rzeczywistym, ale dokładność pomiarów zależy od kinetyki reakcji fluorogenicznej, która jest szybsza niż częstotliwość próbkowania. W tym miejscu opisano metody określania kinetyki włączania in vitro i komórkowej dla aptamerów fluorogennego RNA za pomocą czytnika płytek wyposażonego odpowiednio w iniektor próbki i cytometr przepływowy. Pokazujemy, że kinetyka in vitro aktywacji fluorescencji aptamerów Spinach2 i Brokułów może być modelowana jako dwufazowe reakcje asocjacyjne i mają różne stałe szybkości faz szybkich wynoszące odpowiednio 0,56 s-1 i 0,35 s-1. Ponadto wykazaliśmy, że kinetyka komórkowa aktywacji fluorescencji Spinacha2 w Escherichia coli, która jest dodatkowo ograniczona przez dyfuzję barwnika do bakterii Gram-ujemnych, jest nadal wystarczająco szybka, aby umożliwić dokładną częstotliwość pobierania próbek w skali minutowej. Te metody analizy kinetyki aktywacji fluorescencji mają zastosowanie do innych opracowanych aptamerów fluorogennego RNA.

Kinetyka in vitro 
Sekwencje matryc DNA i starterów, które są kupowane jako syntetyczne oligonukleotydy, są pokazane w Tabeli 2, a receptury odczynników są pokazane w Pliku Uzupełniającym 1. Amplifikacja PCR służy do zwiększenia ilości matrycy DNA za pomocą promotora T7, który jest wymagany do późniejszej reakcji transkrypcji in vitro (IVT). Ponadto amplifikacja PCR może być stosowana do dwóch celów w tej samej reakcji: do wygenerowa...

Protokół przedstawia dwie metody określania kinetyki aptamerów fluorogennego RNA: Szpinak2 i Brokuły. Pierwsza metoda opisuje, w jaki sposób mierzyć kinetykę aptamerów fluorogennych in vitro za pomocą czytnika płytkowego, podczas gdy druga metoda szczegółowo opisuje pomiar kinetyki aptamerów fluorogennych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

Badanie in vitro i komórkowej kinetyki fluorogenicznych aptamerów pozwala użytkownikowi ocenić, czy interakcje barwnika aptamerowego są wystarczająco szybkie, aby zbadać interesujący go proces w czasie rzeczywistym. Przedstawione techniki pozwalają na ilościowe pomiary kinetyczne zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki, z których każdy może być istotny w zależności od zastosowania aptameru. Przedstawione metody można zastosować do dowolnego fluorogennego układu RNA, w tym alternatywnych aptamerów i bioczujników opartych na RNA dla małych cząsteczek.Aby rozpocząć, skonfiguruj program renaturacji RNA z termocyklera. Utwórz program, wybierając opcję utwórz nowy program"dodaj nową fazę"i dodaj nowy krok"wiele razy, aby dodać kroki specyficzne dla temperatury przed naciśnięciem przycisku Zapisz"Dostosuj dodatkowe ustawienia zgodnie z programem. Aby zrenaturyzować RNA szpinaku dwa i brokuły, przygotuj dwie mikromolowe łodygi każdego RNA w podwójnie destylowanej wodzie w cienkościennej probówce PCR o pojemności 0,5 mililitra.Następnie dodaj równe objętości dwukrotnego buforu renaturyzacyjnego, aby uzyskać jeden mikromolowy roztwór RNA. Umieść probówki w termocyklerze. Otwórz zapisany program renaturyzacji i naciśnij uruchom"Następnie skonfiguruj program wtryskiwacza czytnika płytek.Na czytniku płytek fluorescencyjnych wybierz temperaturę" i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem kinetyki upewnij się, że temperatura zrównoważyła się do tej wartości. Otwórz oprogramowanie czytnika tabliczek.Wybierz ustawienia"następnie widok akwizycji"aby wprowadzić program do pomiarów kinetycznych, wybierz pętlę"dla każdej studni. Następnie ustaw ustawienie linii bazowej na 60 odczytów linii bazowej i ustawienia inteligentnego wstrzykiwania dla wstrzykiwania 10 mikrolitrów. Ustaw fluorescencję odczytującą długość fali wzbudzenia na 448 nanometrów, długość fali emisji na 506 nanometrów, a wkład na mono.Ustaw całkowity czas odczytu na 10 minut z interwałem odczytu 0,5 sekundy. Ustaw PMT i optykę na sześć błysków na odczyt. Następnie wprowadź pętlę do następnego dołka.Aby przygotować wtryskiwacz do czytnika płytek, wybierz wstrzyknięcie" na czytniku płytek i dostarcz płytkę do zbierania odpadów, jeśli zostanie to skierowane. Następnie wybierz mycie" i wyczyść rurkę iniekcyjną zgodnie z instrukcjami na czytniku płytek za pomocą mililitrowej objętości podwójnie destylowanej wody, 75% etanolu, a następnie wody destylowanej. Następnie wybierz aspirat"pozwalając wtryskiwaczowi wyrzucić nadmiar cieczy.Następnie wybierz prime", aby zalać wtryskiwacz dwoma 260 mikrolitrami 100 mikromolowych D F H B I.To wykonaj jeden eksperyment kinetyczny, dodaj 80 mikrolitrów głównej mieszanki buforu wiążącego do jednego dołka 96-dołkowej przezroczystej płytki dolnej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów zrenaturyzowanego RNA. Pozostawić płytkę i roztwór D F H B I we wtryskiwaczu do zrównoważenia do 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Następnie wybierz studnię do analizy w ustawieniach oprogramowania w obszarze odczytu. Następnie na karcie głównej wybierz uruchom"aby wykonać opisany wcześniej program kinetyczny. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie eksperymenty zostaną zakończone.Po zakończeniu pracy należy umyć wtryskiwacz, aby usunąć pozostały roztwór D F H B I z rurki iniekcyjnej, jak pokazano wcześniej. Aby skonfigurować pliki eksperymentalne, włącz cytometr przepływowy i komputer. Utwórz nowy plik na karcie eksploratora eksperymentów, klikając prawym przyciskiem myszy cytometr przepływowy"nazwa użytkownika.Następnie wybierz nowy eksperyment"w oknie rozwijanym, a gdy pojawi się nowe okno na ekranie komputera, wybierz typ eksperymentu jako probówki"a następnie wybierz w porządku"W nowym pliku eksperymentu kliknij prawym przyciskiem myszy folder grupy i wybierz dodaj nową probówkę z próbką"Oznacz probówki z próbkami dla każdego określonego punktu czasowego i powtórz, klikając prawym przyciskiem myszy próbkę"i wybierając zmień nazwę"w menu rozwijanym. Następnie przygotuj rozcieńczony roztwór komórkowy, dodając 1,5 mililitra jednego X P B S i trzy mikrolitry indukowanych komórek w pożywce AI w probówce hodowlanej. Przed dodaniem barwnika zmierz fluorescencję tła komórek, aby zaobserwować, jak fałd włącza się z czasem.Po dodaniu barwnika umieść probówkę hodowlaną zawierającą komórki w PBS w podnośniku probówki z próbką i podnieś podnośnik do igły do wstrzykiwania próbki. Następnie wybierz odpowiedni plik próbki na karcie panelu pobierania i kliknij przycisk nagrywania"Po zakończeniu przebiegu opuść ręcznie podnośnik probówki z próbką za pomocą probówki hodowlanej. Aby zainicjować etap płukania, przepłukać układ fluidyczny i zminimalizować przenoszenie między każdą próbką repliki biologicznej.Aby przejść do następnego przykładu, wybierz następny przykładowy plik, klikając ikonę strzałki w prawo obok nazwy probówki z próbką pod ikoną rekordu. Aby zmierzyć fluorescencję komórek za pomocą barwnika, dodaj 1,4 mikrolitra skoncentrowanego barwnika do jednego X P B S z komórkami, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mikromolowych D F H B I jeden T. Zabezpiecz pokrywę probówki hodowlanej i odwróć trzy do pięciu razy, aby równomiernie wymieszać roztwór. Następnie zdejmij pokrywkę i umieść probówkę hodowlaną w podnośniku probówki na próbkę.Po podniesieniu uchwytu do igły do wstrzykiwania próbki, kliknij ikonę rekordu pod odpowiednim plikiem próbki. Następnie uruchom timer, naciskając start"Kinetyka in vitro aptamerów fluorogenicznych, szpinaku dwa i brokułów, wykazywała dwufazową kinetykę asocjacyjną do wiązania z barwnikiem D F H B I. W przypadku obu aptamerów dane kinetyki były lepiej dopasowane przez asocjację dwufazową niż jednofazową w długim czasie pomiaru.Krzywa najlepszego dopasowania określała stałe szybkości i wartości półtrwania dla szybkich i wolnych asocjacji. Szpinak dwa w stanie kompetencji wiązania, wykazywał szybsze włączanie niż brokuły. Kinetyka drugiej fazy dla obu aptamerów jest podobna i może odpowiadać wspólnemu krokowi ograniczającemu szybkość.Krzywe kinetyczne aptamerów składają się z podobnego stopnia szybko asocjujących RNA. W przypadku komórek wykazujących ekspresję dwóch T RNA szpinaku średnia intensywność fluorescencji lub MFI wzrasta natychmiast w zerowym punkcie czasowym. Co więcej, fluorescencja komórkowa osiągnęła maksymalną zrównoważoną wartość MFI w ciągu pięciu minut.Natomiast komórki kontrolne wykazały niską fluorescencję tła i brak zmian w wartościach MFI z dodatkiem D M S O Przedstawione metody pozwalają naukowcom określić, w jaki sposób mogą przyspieszyć czujniki oparte na RNA w aptamerach fluorogenicznych.

determination-vitro-cellular-turn-on-kinetics-for-fluorogenic-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Celem tego protokołu jest umożliwienie ilościowego pomiaru czasu życia fluorescencji sond Riboglow dla powtarzalnych przepływów pracy obrazowania RNA in vitro, w żywych komórkach ssaków i w trójwymiarowym modelu komórkowym. Przedstawiamy przykłady przygotowania próbek, dostarczania sond, pozyskiwania danych oraz przepływów pracy analizy ilościowej w celu pozyskania bezstronnego pomiaru czasu życia fluorescencji.

Charakteryzacja sond Riboglow in vitro jako podstawa dla fluorescencyjnego obrazowania czasu życia w żywych komórkach ssaków i trójwymiarowych modelach komórkowych

Poznaj metody wyznaczania kinetyki fluorogenicznych aptamerów RNA in vitro i w komórkach. Wykorzystaj czytnik płytek oraz cytometrię przepływową do ilościowych pomiarów w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA

Przeglądaj więcej filmów