Model zwierzęcy danio pręgowanego do badania reakcji alergicznych w odpowiedzi na biomolekuły śliny kleszczy

Pytanie brzmi, dlaczego tylko u niektórych osób narażonych na ukąszenia kleszczy rozwijają się reakcje alergiczne. Dla nas wyjaśnienie biomolekuł w ślinie kleszczy i mechanizmów immunologicznych związanych z tym procesem jest kluczem do odpowiedzi na to pytanie. Zwierzęcy model zespołu alfa-Gal u danio pręgowanego odtwarza ludzkie wzorce zachowań i reakcje alergiczne w odpowiedzi na ślinę kleszczy.

To eksperymentalne podejście pogłębia wiedzę na temat interakcji molekularnej kleszcz-gospodarz, w której mamy konflikt związany z zespołem alfa-Gal i współpracą związaną z odpowiedzią przeciwciał na alfa-Gal, które chronią przed zakażeniem patogenem. Aby potraktować rybę śliną kleszczy, rozłóż dorosłego danio pręgowanego na trzy grupy zrównoważone płciowo. Użyj komercyjnego Gala1-3Gal-BSA 3 lub alfa-Gal jako kontroli pozytywnej i PBS jako kontroli negatywnej.

Do ekstrakcji śliny należy używać częściowo nabrzmiałych, wolnych od patogenów samic kleszczy karmionych przez sześć do siedmiu dni na świnkach morskich. Potraktuj kleszcza pięcioma mikrolitrami 2% roztworu chlorowodorku pilokarpiny w PBS o pH 7,4 do hemokleu za pomocą 50-mikrolitrowej strzykawki z igłą 0,33 milimetra. Zbierz ślinę z hypostomu kleszcza za pomocą 10-mikrolitrowej końcówki zamontowanej na mikropipecie.

Umieść ślinę w 1,5-mililitrowej tubce na lodzie i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Określić stężenie białka śliny, aby ustalić ilość białka, która ma zostać wstrzyknięta do ryby, za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA, zgodnie z zaleceniami producenta. Utrzymuj danio pręgowanego w przepływowym systemie wodnym w temperaturze 27 stopni Celsjusza z cyklem jasno-ciemnym trwającym od 14 do 10 godzin.

Następnie wybierz 10 ryb z każdej grupy o podobnym stosunku samic do samców i podobnej wadze do wstrzyknięcia. Znieczulić rybę na krótko, zanurzając ją w 0,02% metanosulfonianu trikainy. Umieść znieczuloną rybę na pół boku, ostrożnie używając kleszczy lub rąk, na mokrej gąbce, z płetwą ogonową po prawej stronie, aby wstrzyknąć związki w tym samym kierunku, aby kontrolować zmiany.

Wstrzyknąć grupy ryb śródskórnie w mięśnie za pomocą strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów wyposażonej w jednocentymetrową igłę o rozmiarze 29 w odległości pięciu milimetrów od płetwy ogonowej i pod kątem 45 stopni do ciała ryby. Po wstrzyknięciu należy umieścić leczoną rybę z powrotem w zbiorniku słodkowodnym bez znieczulenia w celu odzyskania sprawności. Karm ryby dwa razy dziennie o 9:30.

i 13:30 z 50 do 70 mikrogramami suchej paszy dla ryb na rybę do drugiego dnia. Następnie rozgnieć karmę dla psów z moździerzem i tłuczkiem, aby karmić ryby od drugiego dnia po wstrzyknięciu do końca eksperymentu w ósmym dniu.

W celu pobrania próbki przymocuj uśpioną rybę do płytki parafinowej za pomocą szpilek. Zebrać surowicę z naczyń krwionośnych skrzeli ryby, gdy skrzela są nadal nawadniane krwią, za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w jednocentymetrową igłę o rozmiarze 29 rozmiarów. Zebrane serum przechowuj w 1,5-mililitrowej tubce w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.

Przetnij rybę strzałkowo ostrzem skalpela i oceń wewnętrzne zmiany. Następnie zbierz jelito i nerkę każdej ryby w osobnych 1,5-mililitrowych probówkach. Wyekstrahuj całkowite RNA z jelita i nerki za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.

Przeanalizuj ekspresję genów związanych z odpowiedzią immunologiczną, wykonując ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją lub RT-qPCR przy użyciu mieszanki odwrotnej transkrypcji dla RT-qPCR, zgodnie z instrukcjami producenta. Znormalizuj wartości cT mRNA w stosunku do GAPDH danio pręgowanego i porównaj między grupami za pomocą testu t Studenta o nierównej wariancji. Określić miana przeciwciał IgM, które rozpoznają alfa-Gal w próbkach surowicy metodą ELISA.

Zapisz miana przeciwciał jako wartości gęstości optycznej 450 nanometrów za pomocą czytnika płytek i porównaj między grupami za pomocą testu t Studenta z nierówną wariancją. Ten model danio pręgowanego umożliwia scharakteryzowanie i ocenę różnych reakcji alergicznych spowodowanych reakcją gospodarza na ślinę kleszcza i ich implikacją w zespole alfa-Gal lub AGS. Ponadto, w porównaniu z rybami kontrolnymi, u ryb leczonych śliną kleszczy zaobserwowano zmiany w zachowaniach, takich jak powolne pływanie, leżenie na dnie zbiornika i brak jedzenia, ruch wibracyjny lub zygzakowaty.

Znaczną częstość występowania reakcji alergicznych zaobserwowano u ryb leczonych śliną kleszczy, wykazujących szybkie odczulanie i tolerancję. Zmiana zachowania była bardziej wyraźna u ryb, którym podawano ślinę kleszczy niż tylko alfa-Gal. Dodatkową analizę ekspresji reprezentatywnych markerów immunologicznych przeprowadzono metodą RT-PCR.

Wyniki wykazały różnice między grupami danio pręgowanego w nerkach, gdzie markery odpowiedzi immunologicznej były obniżone u ryb leczonych śliną i alfa-Galem w porównaniu z grupą kontrolną. Co więcej, danio pręgowany, któremu podawano ślinę i alfa-Gal, wytworzył przeciwciała IgM przeciwko alfa-Gal, które wykazywały wyższe poziomy niż u ryb leczonych PBS. Wstrzyknięcie leku, ocena reakcji alergicznych i zachowania oraz raportowanie liczby martwych ryb z powodu reakcji alergicznych są najważniejszym aspektem protokołu.

Wykorzystanie technologii omicznych na poziomie mRNA, białka, a także mikrobiomu w celu scharakteryzowania odpowiedzi na ślinę kleszczy pozwala nam zidentyfikować kluczowe biomolekuły biorące udział w tym procesie.