Name: Model zwierzęcy danio pręgowanego do badania reakcji alergicznych w odpowiedzi na biomolekuły śliny kleszczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj model danio pręgowanego do badania reakcji alergicznych wywołanych przez biomolekuły śliny kleszczy. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy immunologiczne zespołu alfa-Gal i interakcje pasożyt-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom grupy SaBio za współpracę w projektowaniu eksperymentu i pomoc techniczną z obiektem doświadczalnym ryb oraz Juanowi Galceránowi Sáezowi (IN-CSIC-UMH, Hiszpania) za dostarczenie danio pręgowanego. Prace te były wspierane przez Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Hiszpanię i EU-FEDER (grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras jest finansowana przez Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Hiszpania, grant IJC2020-042710-I.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Kastylii-La Manchy w ramach badania "Ocena odpowiedzi immunologicznej na inaktywowaną szczepionkę M. bovis i prowokację M. marinum w modelu danio pręgowanego numer PR-2017-05-12."
Kleszcze zostały uzyskane z kolonii laboratoryjnej, gdzie reprezentatywne próbki kleszczy w kolonii zostały przetestowane metodą PCR na obecność typowych patogenów kleszczy w celu potwierdzenia braku patogenów, i przechowywane w Instytucie Parazytologii, Centrum Biologii Czeskiej Akademii Nauk (IP BC CAS), Republika Czeska.Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o ochronie zwierząt Republiki Czeskiej nr 246/1992 Sb (aprobata etyczna nr 34/2018).
1. Leczenie danio pręgowanego
UWAGA: Badanie ma na celu ocenę reakcji alergicznych i odpowiedzi immunologicznej u danio pręgowanego leczonego śliną kleszcza w odpowiedzi na spożycie mięsa ssaków.
<ol>
	<li>Traktować ryby (jak wyjaśniono w sekcji 4) śliną kleszczy, handlową Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (patrz Tabela materiałów), stosowaną jako kontrola pozytywna, z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) jako kontrolą ujemną. Dorosły danio pręgowany jest losowo przydzielany do trzech zrównoważonych płciowo grup (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Każdy inny pożądany związek związany z AGS może być oceniany przy użyciu tego modelu.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja śliny kleszcza Ixodes ricinus 
<ol>
	<li>Używaj częściowo nabrzmiałych, wolnych od patogenów samic kleszczy karmionych przez 6-7 dni na świnkach morskich.</li>
	<li>Leczyć kleszcza 5 μl 2% (wag./obj.) roztworu chlorowodorku pilokarpiny w PBS (patrz tabela materiałów) o pH 7,4 do hemokleu za pomocą strzykawki o pojemności 50 μl z igłą 0,33 mm, jak opisano wcześniej28 w celu wywołania produkcji śliny kleszcza. 
	UWAGA: Z kleszczami obchodzi się za pomocą kleszczy; Uważaj, aby nie używać zbyt dużej siły podczas ich chwytania.</li>
	<li>Zebrać ślinę za pomocą końcówki o pojemności 10 μl umieszczonej na mikropipecie.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wprowadź końcówkę do wnętrza hipostomimu kleszcza.</li>
		<li>Trzymaj ślinę w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie, zbierz ją i przechowuj w temperaturze -80 °C, jak opisano wcześniej27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ stężenie białka śliny, aby ustalić ilość białka, które należy wstrzyknąć rybie, tak jak w poprzednich badaniach27 za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
</ol>
3. Utrzymanie danio pręgowanego
<ol>
	<li>Utrzymuj danio pręgowanego w przepływowym systemie wodnym w temperaturze 27 °C z cyklem światła/ciemności wynoszącym 14 godzin/10 godzin (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Karm ryby dwa razy dziennie o 9:30 i 13:30 suchą karmą dla ryb (50-70 μg/rybę) do 2 dnia.</li>
	<li>Karm ryby dwa razy dziennie o 9:30 i 13:30 suchą karmą dla psów (50-70 μg/rybę) od 2 dnia po wstrzyknięciu leku do końca eksperymentu</li>
</ol>
4. Iniekcja danio pręgowanego
<ol>
	<li>Wybierz 10 ryb w grupie o podobnym stosunku samic do samców i podobnej wadze. 
	UWAGA: Grupa 1 zawiera ryby, którym wstrzyknięto PBS, grupa 2 zawiera ryby, którym wstrzyknięto ślinę kleszcza, a grupa 3 zawiera ryby, którym wstrzyknięto α-Gal.</li>
	<li>Znieczulić rybę na krótko, zanurzając ją w 0,02% metanosulfonianu trikainy (MS-222) (film 1). 
	UWAGA: Odpowiednio znieczulone ryby wykazują normalny oddech i nie pływają, podczas gdy mogą być umieszczone na dnie zbiornika wodnego lub pływające. Każda ryba musi być indywidualnie znieczulona, aby uniknąć ewentualnych uszkodzeń fizjologicznych.</li>
	<li>Złap znieczuloną rybę za pomocą sieci rybackiej.</li>
	<li>Ostrożnie ułożyć rybę na pół boku, używając kleszczy lub rąk, na mokrej gąbce, z płetwą ogonową po prawej stronie, aby wstrzyknąć związki w tym samym kierunku w celu kontrolowania zmian chorobowych.</li>
	<li>Wstrzyknąć grupy ryb śródskórnie, tak jak w poprzednich badaniach26, w mięsień w odległości 5 mm od płetwy ogonowej i pod kątem 45° w stosunku do ciała ryby (film 2). Zastosuj odpowiednie leczenie w dniach 0, 3 i 8, jak opisano wcześniej27 za pomocą strzykawki 100 μL wyposażonej w igłę o długości 1 cm, 29 G z 1 μL (z 9 μg/μL białka) śliny I. ricinus w 10 μL PBS (ślina kleszcza), 5 μg α-Gal w 10 μL PBS (α-Gal)27, i 10 μL PBS (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3). 
	UWAGA: Obchodzenie się z nim należy wykonywać szybko i ostrożnie, aby uniknąć jakichkolwiek fizycznych uszkodzeń zwierzęcia. 
	Inne biomolekuły w ślinie kleszczy można ocenić zgodnie z tym protokołem.</li>
	<li>Umieść leczoną rybę z powrotem w zbiorniku słodkowodnym bez znieczulenia w celu odzyskania zdrowia. 
	UWAGA: Wszystkie ryby z tej samej grupy można umieścić w tym samym zbiorniku na wodę w celu odzyskania.</li>
</ol>
5. Karmienie danio pręgowanego
<ol>
	<li>Rozgnieć karmę dla psów za pomocą moździerza i tłuczka.</li>
	<li>Karm 50-70 μg/ryby dwa razy dziennie o 9:30 i 13:30 suchą karmą dla ryb do 2 dnia.</li>
	<li>Karm 50-70 μg/rybę dwa razy dziennie o 9:30 i 13:30 puree dla psów od 2 dnia po wstrzyknięciu leku do końca eksperymentu 8. 
	UWAGA: Jeśli mają być oceniane markery odporności lub miana przeciwciał przeciwko przeciwciałom α-Gal lub IgE w odpowiedzi na leczenie lub paszę w różnych inokulacjach, karmienie byłoby konieczne do końca eksperymentu.</li>
</ol>
6. Ocena reakcji alergicznych, zmian chorobowych i zachowania u danio pręgowanego
<ol>
	<li>Zbadaj krwotoczny rodzaj reakcji alergicznych (zaczerwienienie skóry, przebarwienia i krwotok) za pomocą lupy lub mikroskopu stereoskopowego w celu uzyskania dokładności i wskaż lokalizację ich pojawienia się na rybach zgodnie z kategoryzacją zawartą w Tabeli 1 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A). 
	UWAGA: Reakcje alergiczne przedstawione w <silna klasa="xfig">Rycina 4 pojawiły się po wstrzyknięciu śliny kleszcza i spożyciu paszy zawierającej czerwone mięso. W związku z tym opisane reakcje są typami reakcji związanych z AGS, ponieważ podobne reakcje pojawiają się w kontekście klinicznym.
	<ol>
		<li>Obserwuj, czy po zabiegach i podczas podawania pokarmu dwa razy dziennie, gdy ryby znajdują się w zbiorniku wodnym, pojawia się jakakolwiek reakcja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj zachowanie ryb, oceniając zmiany27 we wzorcach pływania (mobilność, prędkość, stanie bez ruchu na dnie zbiornika wodnego i pływanie zygzakiem) zgodnie z kategoryzacją zawartą w Tabeli 1.</li>
	<li>Oceń skumulowaną śmiertelność, podając liczbę martwych ryb, w tym czas/dzień zgonu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). 
	UWAGA: Wszystkie parametry są oceniane zaraz po podaniu substancji lub po zmianie paszy i monitorowane codziennie do końca eksperymentu w 8 dniu, kategoryzując zmienne jakościowe (Tabela 1). Jako zalecenie, ocena ta powinna zostać przeprowadzona przez specjalistę posiadającego wiedzę na temat danio pręgowanego, aby rozważyć zmiany behawioralne w oparciu o jego pochodzenie i doświadczenie w pracy z tym modelem zwierzęcym.</li>
	<li>Oblicz liczbę danio pręgowanego dziennie ze zgłoszonymi reakcjami alergicznymi, nieprawidłowym zachowaniem i zmianami żywieniowymi w każdej grupie i porównaj między grupami za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA.</li>
</ol>
7. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Poddać rybę eutanazji przez zanurzenie w 0,04% MS-222 w 8, 
	UWAGA: Zbierz również próbki od ryb, które zmarły z powodu reakcji alergicznych podczas badania.</li>
	<li>Przymocuj rybę do talerza parafinowego za pomocą szpilek.</li>
	<li>Pobrać surowicę z naczyń krwionośnych skrzeli29 ryb natychmiast po eutanazji, gdy skrzela są nadal irygowane krwią, używając strzykawki o pojemności 0,5 ml wyposażonej w igłę o długości 1 cm, 29 G. Przechowuj go w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze -20 °C do czasu użycia (film 3).</li>
	<li>Przetnij rybę strzałkowo ostrzem skalpela i oceń zmiany wewnętrzne (zmiany krwotoczne lub ziarninaki)27,30, jeśli się pojawią. 
	UWAGA: Zmiany chorobowe nie muszą się pojawić, ale muszą zostać zarejestrowane, jeśli tak się stanie.</li>
	<li>Zbierz jelito (Film 4) i nerkę (Film 5) od każdej ryby w oddzielnych pustych probówkach o pojemności 1,5 ml, jak opisano wcześniej31, i przechowuj je w temperaturze -80 C (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Ekstrahować całkowite RNA z próbek jelita danio pręgowanego i nerek za pomocą zestawu do oczyszczania RNA (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przeanalizuj ekspresję genów związanych z odpowiedzią immunologiczną, jak opisano wcześniej30,32 (patrz Tabela 2 dla sekwencji starterów) u danio pręgowanego, przeprowadzając ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) przy użyciu mieszaniny odwrotnej transkrypcji dla RT-qPCR (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta. Znormalizuj wartości cT mRNA w stosunku do D. rerio GAPDH i porównaj grupy (ryby leczone śliną, α-Gal i grupy leczone PBS) za pomocą testu t Studenta o nierównej wariancji.</li>
	<li>Określ miana przeciwciał IgM, które rozpoznają α-Gal u danio pręgowanego w próbkach surowicy za pomocą testu ELISA, jak opisano wcześniej27,30. Zapisz miana przeciwciał jako wartości OD.450 nm, używając czytnika płytek, i porównaj między grupami (ryby traktowane śliną, α-Gal i grupy leczone PBS) za pomocą testu t Studenta o nierównej wariancji. 
	UWAGA: Oznaczanie miana przeciwciał IgM i analiza genów ekspresji jest opcjonalna i przeprowadzana tylko wtedy, gdy wymagana jest informacja immunologiczna. Mieszanina RT-qPCR to zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA do analizy ekspresji genów przy użyciu qPCR w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>

<ol><li>de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).</li>
<li>de la Fuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-pathogen+interactions+and+vector+competence%3A+identification+of+molecular+drivers+for+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114(2017).</li>
<li>Villar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tick+salivary+gland+and+saliva+alphagalactome+reveals+candidate+alpha-gal+syndrome+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).</li>
<li>Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+tick+salivary+proteins+as+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The use of tick salivary proteins as novel therapeutics.</a> Frontiers in Physiology. 10, 812(2019).</li>
<li>Chung, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetuximab-induced+anaphylaxis+and+IgE+specific+for+galactose-alpha-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).</li>
<li>Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+between+tick+bite+reactions+and+red+meat+allergy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Medical+Journal+of+Australia%22%5BJournal%5D)">An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans.</a> The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+molecular+drivers+of+the+%CE%B1-Gal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1210(2019).</li>
<li>de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-Gal+syndrome%3A+new+insights+into+the+tick-host+conflict+and+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation.</a> Parasites & Vectors. 12 (1), 154(2019).</li>
<li>Platts-Mills, T. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+cause+and+consequences+of+IgE+to+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose%3A+A+report+from+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+workshop+on+understanding+IgE-mediated+mammalian+meat+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).</li>
<li>Commins, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+anaphylaxis%2C+angioedema%2C+or+urticaria+after+consumption+of+red+meat+in+patients+with+IgE+antibodies+specific+for+galactose-alpha-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).</li>
<li>Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphylaxis+to+the+carbohydrate+side+chain+alpha-gal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Allergy+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal.</a> Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).</li>
<li>Mateos-Hernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-host+conflict%3A+immunoglobulin+E+antibodies+to+tick+proteins+in+patients+with+anaphylaxis+to+tick+bite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite.</a> Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).</li>
<li>Galili, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+in+primates+by+%26%2334%3BCatastrophic-selection%26%2334%3B+interplay+between+enveloped+virus+epidemics%2C+mutated+genes+of+enzymes+synthesizing+carbohydrate+antigens%2C+and+natural+anti-carbohydrate+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Evolution in primates by &#34;Catastrophic-selection&#34; interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies.</a> American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).</li>
<li>Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+mechanism+of+galactose-alpha-1%2C3-galactose+in+the+elicitation+of+delayed+anaphylactic+reactions+to+red+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Allergy+and+Asthma+Reports%22%5BJournal%5D)">Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3(2019).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+research+meets+tick+vectors+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cancer research meets tick vectors for infectious diseases.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).</li>
<li>Yilmaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+elicits+a+protective+immune+response+against+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission.</a> Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+immune+response+to+%CE%B1-Gal+and+vector-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).</li>
<li>Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+of+alpha-gal+syndrome%3A+Current+standards%2C+pitfalls+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Hautarzt%3B+Zeitschrift+Fur+Dermatologie%2C+Venerologie%2C+Und+Verwandte+Gebiete%22%5BJournal%5D)">Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives.</a> Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).</li>
<li>Commins, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+tick+bites+to+the+production+of+IgE+antibodies+to+the+mammalian+oligosaccharide+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+spectrum+of+%CE%B1-Gal+syndrome%3A+from+immediate-type+to+delayed+immediate-type+reactions+to+mammalian+innards+and+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Allergo+Journal+International%22%5BJournal%5D)">Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat.</a> Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).</li>
<li>Hodžić, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+Toxocara+canis+inhibits+the+production+of+IgE+antibodies+to+%CE%B1-Gal+in+humans%3A+towards+a+conceptual+framework+of+the+hygiene+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis.</a> Vaccines. 8 (2), 167(2020).</li>
<li>Kiewiet, M. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+characterization+of+the+%CE%B1-Gal+syndrome-importance+of+atopy+for+symptom+severity+in+a+European+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology.+In+Practice%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).</li>
<li>Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-gal+story%3A+lessons+learned+from+connecting+the+dots%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).</li>
<li>Hashizume, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Amblyomma+testudinarium+tick+bites+are+associated+with+increased+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose+carbohydrate+IgE+antibody+levels%3A+A+retrospective+cohort+study+in+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).</li>
<li>Chandrasekhar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+exposure+to+clinically+relevant+lone+star+ticks+promotes+IgE+production+and+hypersensitivity+through+CD4%2B+T+cell-+and+MyD88-dependent+pathways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice.</a> Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).</li>
<li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amblyomma+sculptum+tick+saliva%3A+%CE%B1-Gal+identification%2C+antibody+response+and+possible+association+with+red+meat+allergy+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil.</a> International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).</li>
<li>Contreras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+reactions+and+immunity+in+response+to+tick+salivary+biogenic+substances+and+red+meat+consumption+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78(2020).</li>
<li>Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E%282%29+in+tick+saliva+regulates+macrophage+cell+migration+and+cytokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile.</a> Parasites & Vectors. 6 (2), 261(2013).</li>
<li>Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+will+tell%3A+what+hematological+analyses+can+reveal+about+fish+welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare.</a> Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955(2021).</li>
<li>Pacheco, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+alpha-gal+protects+against+mycobacterial+infection+in+the+zebrafish+model+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis.</a> Vaccines. 8 (2), 195(2020).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), e1717(2010).</li>
<li>Lu, M. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+response+is+involved+in+nervous+necrosis+virus+acute+and+persistent+infection+in+zebrafish+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model.</a> Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).</li>
<li>Saralahti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+model+for+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis.</a> Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).</li>
<li>Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%3A+A+fintastic+model+for+hematopoietic+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312(2018).</li>
<li>Katoch, S., Patial, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+emerging+model+system+to+study+liver+diseases+and+related+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).</li>
<li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li>
<li>Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prednisolone+on+behavior+and+hypothalamic-pituitary-interrenal+axis+activity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325(2020).</li>
<li>Aleström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+Housing+and+husbandry+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: Housing and husbandry recommendations.</a> Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Danio pręgowany to ekonomiczny i łatwy w obsłudze model, który jest również bardzo użytecznym narzędziem do badania molekularnych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej, chorób chorobotwórczych, testowania nowych leków oraz szczepień i ochrony przed infekcjami 33,34,35. Badanie zachowania danio pręgowanego jest przydatne, ponieważ poprzednie badania wykazały, że niektóre gatunki ryb pozostają nieruchome na dnie zbiornika, gdy są...

Kleszcze są wektorami patogenów, które wywołują choroby, a także są przyczyną reakcji alergicznych, wpływając na zdrowie ludzi i zwierząt na całym świecie1,2. Podczas żerowania kleszczy biomolekuły w ślinie kleszczy, zwłaszcza białka i lipidy, ułatwiają odżywianie się tych ektopasożytów, unikając obrony żywiciela3. Niektóre biomolekuły śliny z modyfikacjami glikanu Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) prowadzą do wytwarzania wysokiego poziomu przeciwciał anty-α-Gal IgE po ukąszeniu kleszcza, tylko u niektórych osób, co jest znane jako zespół α-Gal (AGS)4. Jest to choroba związana z alergią IgE-zależną, która może prowadzić do anafilaksji na ukąszenia kleszczy, spożycie mięsa ssaków innych niż naczelne i niektóre leki, takie jak cetuximab5. Reakcje na α-Gal są często ciężkie, a czasami mogą być śmiertelne6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-Gal występuje u wszystkich ssaków z wyjątkiem małp, małp człekokształtnych i ludzi, którzy nie mają zdolności syntezy α-Gal13. Jednak patogeny, takie jak bakterie i pierwotniaki, wyrażają ten glikan na swojej powierzchni, co może indukować wytwarzanie dużych ilości przeciwciał anty-α-Gal IgM/IgG i może być mechanizmem ochronnym przed tymi patogenami16,17. Jednak wytwarzanie przeciwciał anty-α-Gal zwiększa ryzyko rozwoju alergii anty-α-Gal zależnych od IgE7,13. Naturalne przeciwciała anty-α-Gal wytwarzane u ludzi, głównie podtypów IgM/IgG, mogą być związane z tą modyfikacją obecną u bakterii z mikrobioty jelitowej klasy <sup="xref">16. AGS może być trudną diagnozą kliniczną, ponieważ obecnie główna metoda diagnostyczna opiera się na wywiadzie klinicznym opóźnionych reakcji alergicznych, szczególnie związanych z alergiami pokarmowymi (tj. świąd, zlokalizowana pokrzywka lub nawracający obrzęk naczynioruchowy do anafilaksji, pokrzywki i objawów żołądkowo-jelitowych) oraz pomiarze poziomu przeciwciał IgE anty-α-Gal9. Obecne odkrycia sugerują, że ukąszenia kleszczy stanowią jedno z głównych zagrożeń związanych z pojawieniem się AGS18,19, 20-krotny lub większy wzrost poziomu IgE do α-Gal po ukąszeniu kleszcza19, historia ukąszeń kleszczy u pacjentów z AGS20,21,22, istnienie przeciwciał reagujących na antygeny kleszczowe u pacjentów z AGS19, a te anty-α-Gal IgE są silnie powiązane z poziomami anty-kleszczowych IgE19,23 ale potrzebne są dalsze badania, aby ocenić, które biomolekuły są faktycznie zaangażowane.
Ponadto, innym możliwym scenariuszem są pacjenci, którzy wykazują silne reakcje alergiczne na ukąszenia kleszczy i wysoki poziom przeciwciał anty-α-Gal IgE, ale są tolerancyjni na spożycie mięsa ssaków12. Dlatego alergia na mięso ssaków może być szczególnym rodzajem alergii związanej z ukąszeniami kleszczy. Główne gatunki kleszczy związane z AGS to Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brazylia), Amblyomma testudinarium i Haemaphysalis longicornis (Japonia), Ixodes holocyclus (Australia) i Ixodes ricinus (główny wektor boreliozy z Lyme w Europie)11,24.
Jedynym modelem, który został użyty do oceny produkcji IgE związanej z ukąszeniami kleszczy, jest model mysi zmodyfikowany genetycznie genetycznie dla myszy α−1,3-galaktozylotransferazy (α-Gal KO)25,26, ponieważ podobnie jak inne ssaki, myszy również wyrażają α-Gal na białkach i lipidach i nie wytwarzają IgE do α-Gal. Jednak danio pręgowany (Danio rerio) jest użytecznym modelem do badań biomedycznych stosowanych u ssaków, ponieważ ma wiele podobieństw anatomicznych ze ssakami i, podobnie jak ludzie, nie jest również w stanie syntetyzować α-Gal. Ponieważ α-Gal nie jest wytwarzany naturalnie u danio pręgowanego, jest to model przystępny cenowo, łatwy w manipulacji i pozwala na dużą wielkość próbki do badania reakcji alergicznych związanych z α-Gal.
W tym badaniu, danio pręgowany jest używany jako organizm modelowy do charakteryzowania i opisywania lokalnych reakcji alergicznych, wzorców zachowań i mechanizmów molekularnych związanych z reakcją na przezskórne uczulenie na ślinę kleszcza26,27 i późniejsze spożycie mięsa ssaków. W tym celu ryby są wystawiane na działanie śliny kleszcza poprzez wstrzyknięcie śródskórne, a następnie są karmione karmą dla psów, która zawiera produkty pochodzące z mięsa ssaków odpowiednie do stosowania u zwierząt, która zawiera α-Gal27, a następnie oceniane są możliwe powiązane reakcje alergiczne. Metoda ta może być stosowana do badania innych biomolekuł związanych z procesami alergicznymi, zwłaszcza tych związanych z AGS.

<table><tbody><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr>Urządzenia <td></td><td></td><td></td><td>do nauki w akwarystyce</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rozsekcyjny</td><td>VWR</td><td>631-1279</td><td></td></tr><tr><td>Karma dla psa - czerwona Klasyczna</td><td>Acana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISA płytki-96</td><td>dołków Thermo Fisher Scientific</td><td>10547781</td><td></td></tr><tr><td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&alpha;-Gal)&nbsp;</td><td>Dextra</td><td>NGP0203</td><td></td></tr><tr><td>iScript Odwrotna transkrypcja Supermix</td><td>1708840</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki mikrolitrowe</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek pilokarpiny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet P10&nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-0364</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet P1000</td><td>VWR</td><td>613-0359</td><td></td></tr><tr><td>Wysokiej jakości pokarm dla ryb tropikalnych</td><td>DAPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gąbka Uchwyt dla zwierząt&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Wykonane z pianki złomowej</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>termocykler Real-Time PCR</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanosulfonian trikainy (MS-222)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr></tbody></table>

model zwierzęcy danio pręgowanego do badania reakcji alergicznych w odpowiedzi na biomolekuły śliny kleszczy

Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

Kleszcze to wektory stawonogów, które wywołują chorobę poprzez przenoszenie patogenów i których ukąszenia mogą być związane z reakcjami alergicznymi wpływającymi na zdrowie ludzi na całym świecie. U niektórych osób wysoki poziom przeciwciał immunoglobuliny E przeciwko glikanowi Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) został wywołany przez ukąszenia kleszczy. Reakcje anafilaktyczne, w których pośredniczą glikoproteiny i glikolipidy zawierające glikan α-Gal, obecny w ślinie kleszczy, są związane z zespołem alfa-Gal (AGS) lub alergią na mięso ssaków. Danio pręgowany (Danio rerio) stał się szeroko stosowanym modelem kręgowców do badania różnych patologii. W tym badaniu danio pręgowany został wykorzystany jako model do badania reakcji alergicznych w odpowiedzi na spożycie α-Gal i mięsa ssaków, ponieważ, podobnie jak ludzie, nie syntetyzują one tego glikanu. W tym celu oceniono wzorce zachowań i krwotoczne reakcje alergiczne typu anafilaktycznego w odpowiedzi na ślinę kleszcza Ixodes ricinus i spożycie mięsa ssaków. To eksperymentalne podejście pozwala na uzyskanie ważnych danych, które wspierają model zwierzęcy danio pręgowanego do badania alergii przenoszonych przez kleszcze, w tym AGS.

Protokół przedstawiony w niniejszej pracy opiera się na kilku aspektach wcześniej opublikowanych eksperymentów27,30 oraz wynikach uzyskanych w naszym laboratorium, gdzie model danio pręgowanego został ustanowiony i zwalidowany do badania AGS oraz odpowiedzi immunologicznej na α-Gal, ponieważ ani ludzie, ani danio pręgowane nie syntetyzują tej cząsteczki13. Model ten umożliwia charakteryzację i ocenę różnych reakcji alergicznych będących wy...

Tutaj danio pręgowany (Danio rerio) jest używany jako model do badania reakcji alergicznych i odpowiedzi immunologicznych związanych z zespołem alfa-Gal (AGS) poprzez ocenę reakcji alergicznych na ślinę kleszczy i spożycie mięsa ssaków.

Model zwierzęcy danio pręgowanego do badania reakcji alergicznych w odpowiedzi na biomolekuły śliny kleszczy

Ticks are arthropod vectors that cause disease by pathogen transmission and whose bites could be related to allergic reactions impacting human health ...

Pytanie brzmi, dlaczego tylko u niektórych osób narażonych na ukąszenia kleszczy rozwijają się reakcje alergiczne. Dla nas wyjaśnienie biomolekuł w ślinie kleszczy i mechanizmów immunologicznych związanych z tym procesem jest kluczem do odpowiedzi na to pytanie. Zwierzęcy model zespołu alfa-Gal u danio pręgowanego odtwarza ludzkie wzorce zachowań i reakcje alergiczne w odpowiedzi na ślinę kleszczy.To eksperymentalne podejście pogłębia wiedzę na temat interakcji molekularnej kleszcz-gospodarz, w której mamy konflikt związany z zespołem alfa-Gal i współpracą związaną z odpowiedzią przeciwciał na alfa-Gal, które chronią przed zakażeniem patogenem. Aby potraktować rybę śliną kleszczy, rozłóż dorosłego danio pręgowanego na trzy grupy zrównoważone płciowo. Użyj komercyjnego Gala1-3Gal-BSA 3 lub alfa-Gal jako kontroli pozytywnej i PBS jako kontroli negatywnej.Do ekstrakcji śliny należy używać częściowo nabrzmiałych, wolnych od patogenów samic kleszczy karmionych przez sześć do siedmiu dni na świnkach morskich. Potraktuj kleszcza pięcioma mikrolitrami 2% roztworu chlorowodorku pilokarpiny w PBS o pH 7,4 do hemokleu za pomocą 50-mikrolitrowej strzykawki z igłą 0,33 milimetra. Zbierz ślinę z hypostomu kleszcza za pomocą 10-mikrolitrowej końcówki zamontowanej na mikropipecie.Umieść ślinę w 1,5-mililitrowej tubce na lodzie i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Określić stężenie białka śliny, aby ustalić ilość białka, która ma zostać wstrzyknięta do ryby, za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA, zgodnie z zaleceniami producenta. Utrzymuj danio pręgowanego w przepływowym systemie wodnym w temperaturze 27 stopni Celsjusza z cyklem jasno-ciemnym trwającym od 14 do 10 godzin.Następnie wybierz 10 ryb z każdej grupy o podobnym stosunku samic do samców i podobnej wadze do wstrzyknięcia. Znieczulić rybę na krótko, zanurzając ją w 0,02% metanosulfonianu trikainy. Umieść znieczuloną rybę na pół boku, ostrożnie używając kleszczy lub rąk, na mokrej gąbce, z płetwą ogonową po prawej stronie, aby wstrzyknąć związki w tym samym kierunku, aby kontrolować zmiany.Wstrzyknąć grupy ryb śródskórnie w mięśnie za pomocą strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów wyposażonej w jednocentymetrową igłę o rozmiarze 29 w odległości pięciu milimetrów od płetwy ogonowej i pod kątem 45 stopni do ciała ryby. Po wstrzyknięciu należy umieścić leczoną rybę z powrotem w zbiorniku słodkowodnym bez znieczulenia w celu odzyskania sprawności. Karm ryby dwa razy dziennie o 9:30.i 13:30 z 50 do 70 mikrogramami suchej paszy dla ryb na rybę do drugiego dnia. Następnie rozgnieć karmę dla psów z moździerzem i tłuczkiem, aby karmić ryby od drugiego dnia po wstrzyknięciu do końca eksperymentu w ósmym dniu.W celu pobrania próbki przymocuj uśpioną rybę do płytki parafinowej za pomocą szpilek. Zebrać surowicę z naczyń krwionośnych skrzeli ryby, gdy skrzela są nadal nawadniane krwią, za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w jednocentymetrową igłę o rozmiarze 29 rozmiarów. Zebrane serum przechowuj w 1,5-mililitrowej tubce w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.Przetnij rybę strzałkowo ostrzem skalpela i oceń wewnętrzne zmiany. Następnie zbierz jelito i nerkę każdej ryby w osobnych 1,5-mililitrowych probówkach. Wyekstrahuj całkowite RNA z jelita i nerki za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.Przeanalizuj ekspresję genów związanych z odpowiedzią immunologiczną, wykonując ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją lub RT-qPCR przy użyciu mieszanki odwrotnej transkrypcji dla RT-qPCR, zgodnie z instrukcjami producenta. Znormalizuj wartości cT mRNA w stosunku do GAPDH danio pręgowanego i porównaj między grupami za pomocą testu t Studenta o nierównej wariancji. Określić miana przeciwciał IgM, które rozpoznają alfa-Gal w próbkach surowicy metodą ELISA.Zapisz miana przeciwciał jako wartości gęstości optycznej 450 nanometrów za pomocą czytnika płytek i porównaj między grupami za pomocą testu t Studenta z nierówną wariancją. Ten model danio pręgowanego umożliwia scharakteryzowanie i ocenę różnych reakcji alergicznych spowodowanych reakcją gospodarza na ślinę kleszcza i ich implikacją w zespole alfa-Gal lub AGS. Ponadto, w porównaniu z rybami kontrolnymi, u ryb leczonych śliną kleszczy zaobserwowano zmiany w zachowaniach, takich jak powolne pływanie, leżenie na dnie zbiornika i brak jedzenia, ruch wibracyjny lub zygzakowaty.Znaczną częstość występowania reakcji alergicznych zaobserwowano u ryb leczonych śliną kleszczy, wykazujących szybkie odczulanie i tolerancję. Zmiana zachowania była bardziej wyraźna u ryb, którym podawano ślinę kleszczy niż tylko alfa-Gal. Dodatkową analizę ekspresji reprezentatywnych markerów immunologicznych przeprowadzono metodą RT-PCR.Wyniki wykazały różnice między grupami danio pręgowanego w nerkach, gdzie markery odpowiedzi immunologicznej były obniżone u ryb leczonych śliną i alfa-Galem w porównaniu z grupą kontrolną. Co więcej, danio pręgowany, któremu podawano ślinę i alfa-Gal, wytworzył przeciwciała IgM przeciwko alfa-Gal, które wykazywały wyższe poziomy niż u ryb leczonych PBS. Wstrzyknięcie leku, ocena reakcji alergicznych i zachowania oraz raportowanie liczby martwych ryb z powodu reakcji alergicznych są najważniejszym aspektem protokołu.Wykorzystanie technologii omicznych na poziomie mRNA, białka, a także mikrobiomu w celu scharakteryzowania odpowiedzi na ślinę kleszczy pozwala nam zidentyfikować kluczowe biomolekuły biorące udział w tym procesie.

zebrafish-animal-model-for-study-allergic-reactions-response-to-tick

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Wrodzona odpowiedź immunologiczna chroni organizmy przed infekcją patogenem. Krytyczny składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, pęknięcie oddechowe fagocytów, generuje reaktywne formy tlenu, które zabijają atakujące mikroorganizmy. Opisujemy test wyrzutu oddechowego, który określa ilościowo reaktywne formy tlenu wytwarzane, gdy wrodzona odpowiedź immunologiczna jest indukowana chemicznie.

Kwantyfikacja reakcji na impuls oddechowy jako wskaźnik wrodzonego zdrowia immunologicznego u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Tutaj opisujemy protokół immunizacji dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) szczepionką opartą na DNA i pokazujemy walidację udanego szczepienia. Metoda ta jest odpowiednia do przedklinicznych badań przesiewowych kandydatów na szczepionki w różnych modelach infekcji.

Uodparnianie dorosłych ryb danio pręgowanego do przedklinicznych badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA

Ten protokół opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Zarodniki Aspergillus są mikrowstrzykiwane do tyłomózgowia larw, a leczenie chemiczne stosuje się w celu wywołania immunosupresji. Postęp infekcji jest monitorowany za pomocą codziennego zestawu do obrazowania w celu monitorowania wzrostu grzybów i odpowiedzi immunologicznej, a także liczenia żywych zarodników przez posiewanie jednostek tworzących kolonie.

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Metoda ta opisuje opracowanie systemu żywienia krwią kleszczy in vitro , wykorzystującego komorę drukowaną w 3D oraz laboratoryjnie wykonaną membranę silikonową. System umożliwia sztuczne karmienie kleszczy, umożliwiając łatwe pobieranie próbek na różnych etapach karmienia oraz wykorzystując niewielkie ilości krwi, stanowiąc nieocenione narzędzie do badania kleszczy ixoidied.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

Aby zamodelować, jak sygnały zapalne wpływają na neurorozwój u organizmów genetycznie podatnych, przedstawiamy protokół mikroiniekcji IL-6 do przewodu Cuviera (żyła główna kardynałowa) larw rybki zebra, umożliwiając kontrolowane wywołanie stanu zapalnego i ocenę jego wpływu na rozwój w kontekście zespołu stwardnienia guzowatego (TSC).

Mikrowstrzyknięcie Interleukiny-6 do krwioobiegu larw ryb cebra TSC w celu badania zachowań przypominających zaburzenia neuropsychiatryczne

Poznaj model danio pręgowanego do badania reakcji alergicznych wywołanych przez biomolekuły śliny kleszczy. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy immunologiczne zespołu alfa-Gal i interakcje pasożyt-gospodarz.

Model zwierzęcy danio pręgowanego do badania reakcji alergicznych w odpowiedzi na biomolekuły śliny kleszczy

Przeglądaj więcej filmów