Name: Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Poznaj metodę ekspansji kodu genetycznego do etykietowania efektorów Salmonella i ich obrazowania w superrozdzielczości w komórkach HeLa za pomocą mikroskopii dSTORM.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze start-up z oddziału medycznego Uniwersytetu Teksańskiego w Galveston, TX, oraz nagrodę Texas STAR dla L.J.K. Dziękujemy prof. Edwardowi Lemke (Europejskie Laboratorium Biologii Molekularnej, Heidelberg, Niemcy) za plazmid pEVOL-PylRS-AF. Obrazy na rysunku 1 zostały utworzone przy użyciu BioRender.

<ol><li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li>
<li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li>
<li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interactions+with+host+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li>
<li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-injection+machines+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li>
<li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA%2FB+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li>
<li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116(2015).</li>
<li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell%2C+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311(2019).</li>
<li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335(2017).</li>
<li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li>
<li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li>
<li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789(2021).</li>
<li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050(2020).</li>
<li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li>
<li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12(2005).</li>
<li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li>
<li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li>
<li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li>
<li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li>
<li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SifA%2C+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium%2C+directs+Salmonella-induced+filament+%28Sif%29+formation+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li>
<li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+proteins%3A+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li>
<li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li>
<li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li>
<li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases%3A+status+for+the+year+2000%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292(2000).</li>
<li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins%3A+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single%2C+fixed+E.+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li>
<li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li>
<li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li>
<li>Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811(2020).</li>
<li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715(2021).</li>
<li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Communication+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261(2019).</li>
<li>Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314(2022).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane w niniejszym dokumencie podejście wykorzystano do śledzenia dokładnej lokalizacji białek efektorowych wstrzykniętych do komórki gospodarza przez bakteryjną T3SS po zakażeniu. T3SS są wykorzystywane przez patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak Salmonella, Shigella i Yersinia, do transportu składników wirulencji do gospodarza. Rozwój technologii obrazowania w superrozdzielczości umożliwił wizualizację czynników wirulencji w niewyobrażalnej wcześniej rozdzielczości 12,13,24.<sup class="xref...

Infekcje bakteryjne od dawna uważane są za poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Patogeny wykorzystują wysoce rozwinięte, niezwykle silne i skomplikowane systemy obronne, a także różnorodne czynniki wirulencji bakteryjnej (określane jako białka efektorowe), aby uniknąć odpowiedzi immunologicznej gospodarza i wywołać infekcje1,2. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw tych systemów i rola poszczególnych białek efektorowych są nadal w dużej mierze nieznane ze względu na brak odpowiednich podejść do bezpośredniego śledzenia kluczowych składników białkowych i efektorów w komórkach gospodarza podczas patogenezy.
Jednym z typowych przykładów jest Salmonella enterica serowar Typhimurium, która powoduje ostre zapalenie żołądka i jelit. Salmonella Typhimurium wykorzystuje systemy wydzielania typu trzeciego (T3SS) do wstrzykiwania różnych białek efektorowych bezpośrednio do komórek gospodarza. Gdy tylko Salmonella dostanie się do komórki gospodarza, znajduje się w kwaśnym przedziale związanym z błoną, zwanym wakuolą zawierającą Salmonellę (SCV)3,4. Kwaśne pH SCV aktywuje T3SS kodowaną przez wyspę patogeniczności Salmonelli 2 (SPI-2) i translokuje salwę 20 lub więcej białek efektorowych przez błonę wakuolarną do cytozolu gospodarza 5,6,7,8. Wewnątrz gospodarza te złożone koktajle białek efektorowych koordynują szlaki sygnałowe komórek gospodarza, powodując powstawanie wysoce dynamicznych, złożonych rurowych struktur błonowych rozciągających się od SCV wzdłuż mikrotubul, zwanych włóknami indukowanymi przez Salmonellę (SIF), które umożliwiają Salmonelli przetrwanie i replikację w komórkach gospodarza9,10,11.
Metody wizualizacji, śledzenia i monitorowania lokalizacji efektorów bakteryjnych, a także badania ich transportu i interakcji wewnątrz komórek gospodarza, dostarczają krytycznego wglądu w mechanizmy leżące u podstaw patogenezy bakteryjnej. Znakowanie i lokalizacja białek efektorowych T3SS wydzielanych przez Salmonellę w komórkach gospodarza okazało się wyzwaniem technologicznym12,13; Niemniej jednak rozwój genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych zmienił naszą zdolność do badania i wizualizacji białek w żywych organizmach. Jednak wielkość białek fluorescencyjnych (~25-30 kDa)15 jest często porównywalna lub nawet większa niż wielkość białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI; np. 13,65 kDa dla SsaP, 37,4 kDa dla SifA). W rzeczywistości znakowanie białkami fluorescencyjnymi efektorów często blokuje wydzielanie znakowanego efektora i blokuje T3SS14.
Ponadto, białka fluorescencyjne są mniej stabilne i emitują niską liczbę fotonów przed fotowybielaniem, co ogranicza ich użycie w technikach mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości16,17,18, szczególnie w mikroskopii fotoaktywacji lokalizacji (PALM), STORM i mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED). Podczas gdy właściwości fotofizyczne organicznych barwników fluorescencyjnych są lepsze niż białek fluorescencyjnych, metody/techniki takie jak CLIP/SNAP19,20, Split-GFP21, ReAsH/FlAsH22,23 i HA-Tags24,25 wymagają dodatkowego wyrostka białkowego lub peptydowego, który może upośledzać funkcję strukturalną białka efektorowego będącego przedmiotem zainteresowania poprzez zakłócanie modyfikacji potranslacyjnej lub transportu. Alternatywna metoda, która minimalizuje niezbędną modyfikację białek, polega na włączeniu ncAA do punktu POI podczas translacji przez GCE. NCAA są albo fluorescencyjne, albo mogą być fluorescencyjne za pomocą kliknięcia chemistry12,13,26,27,28.
Korzystając z GCE, ncAA z małymi, funkcjonalnymi, bioortogonalnymi grupami (takimi jak grupa azydkowa, cyklopropenowa lub cyklooktynowa) mogą być wprowadzane w prawie każdym miejscu docelowego białka. W tej strategii natywny kodon jest zamieniany na rzadki kodon, taki jak bursztynowy (TAG) kodon stop w określonej pozycji w genie POI. Zmodyfikowane białko ulega następnie ekspresji w komórkach wraz z ortogonalną parą syntetazy aminoacylo-tRNA/tRNA. Miejsce aktywne syntetazy tRNA jest zaprojektowane do odbierania tylko jednego określonego ncAA, który jest następnie kowalencyjnie przyłączany do końca 3' tRNA, który rozpoznaje bursztynowy kodon. ncAA jest po prostu wprowadzany do pożywki wzrostowej, ale musi zostać wchłonięty przez komórkę i dotrzeć do cytozolu, gdzie syntetaza aminoacylo-tRNA (aaRS) może połączyć go z ortogonalnym tRNA; jest następnie włączany do punktu POI w określonym miejscu (patrz Rysunek 1)12. W ten sposób GCE umożliwia specyficzne dla miejsca włączenie mnóstwa bioortogonalnych grup reaktywnych, takich jak keton, azydek, alkin, cyklooktyn, transcyklookten, tetrazyna, norbonen, α, β-nienasycony amid i bicyklo [6.1.0]-nonyn do POI, potencjalnie pokonując ograniczenia konwencjonalnych metod znakowania białek12,26,27,28.
Ostatnie pojawiające się trendy w technikach obrazowania o wysokiej rozdzielczości otworzyły nowe możliwości badania struktur biologicznych na poziomie molekularnym. W szczególności STORM, jednocząsteczkowa, oparta na lokalizacji, technika superrozdzielczości, stała się nieocenionym narzędziem do wizualizacji struktur komórkowych do ~20-30 nm i jest w stanie badać procesy biologiczne cząsteczka po cząsteczce, odkrywając w ten sposób role cząsteczek wewnątrzkomórkowych, które są jeszcze nieznane w tradycyjnych badaniach uśrednianych zespołowo13. Techniki jednocząsteczkowe i superrozdzielcze wymagają małego znacznika z jasnymi, fotostabilnymi fluoroforami organicznymi w celu uzyskania najlepszej rozdzielczości. Niedawno pokazaliśmy, że GCE może być używany do włączenia odpowiednich sond do obrazowania w superrozdzielczości12.
Dwa z najlepszych wyborów do znakowania białek w komórkach to bicyklo [6.1.0] nonynelizyna (BCN) i trans-cyklookten-lizyna (TCO; pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1), które mogą być genetycznie kodowane przy użyciu wariantu pary tRNA/syntetaza (tutaj określanego jako tRNAPyl/PylRSAF), gdzie Pyl reprezentuje pirolizynę, a AF reprezentuje racjonalnie zaprojektowaną podwójną mutantkę (Y306A, Y384F) pochodzącą z Methanosarcina mazei To naturalnie koduje pirolizynę12,29,30,31. Poprzez promowaną przez szczep reakcję cykloaddycji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronów (SPIEDAC), aminokwasy te reagują chemoselektywnie z koniugatami tetrazyny (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) < klasa sup = "xref">12,< klasa sup = "xref" >30,< klasa sup = "xref">31. Takie reakcje cykloaddycji są wyjątkowo szybkie i kompatybilne z żywymi komórkami; Mogą być również fluorogenne, jeśli odpowiedni fluorofor jest funkcjonalizowany ugrupowaniem tetrazynowym < klasa sup="xref">12,26,32. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół monitorowania dynamiki efektorów bakteryjnych dostarczanych do komórek gospodarza za pomocą GCE, a następnie subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą dSTORM. Wyniki wskazują, że włączenie ncAA przez GCE, a następnie reakcja kliknięcia z fluorogennymi barwnikami zawierającymi tetrazynę, stanowi wszechstronną metodę selektywnego znakowania, wizualizacji wydzielanych białek, a następnie lokalizacji subkomórkowej w gospodarzu. Wszystkie opisane tutaj komponenty i procedury można jednak dostosować lub zastąpić, tak aby system GCE mógł być dostosowany do badania innych zagadnień biologicznych.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor do biegania Tris/Glycine SDS</td><td>BIO-RAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Fischer Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP212R-1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina Sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Przeciwgrzybicza (100x)</td><td>ThermiFischer Scientific</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Arabinoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP (wysokowydajna wirówka)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BDP-FL-tetrazyna</td><td>Lumiprobe (USA)</td><td>2.14E+02</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Milipore</td><td>444203</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Click Aminokwas / trans-Cyclooct-2-en &ndash; L - Lizyna (TCO*A)</td><td>SiChem GmbH</td><td>SC-8008</td><td>Rozmiar: 500 mg</td></tr><tr><td>DAPI (Hoechst33342)</td>Spektrofotometr <td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11+</td><td>DeNovix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM*</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>* Używany do utrzymywania HeLa Cell</td></tr><tr><td>DMEM**</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>**Stosowany w przypadku infekcji bakteryjnych w obecności ncAA, patrz punkt 5.4.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osioł przeciwciało anty-królicze Alexa fluoro555</td><td>wtórne Invitrogen</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Szczep E. coli BL21 (DE3)</td><td>Novagen (Madison, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897-BV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Probówka 1,5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td></td><td>Filtry</td> strzykawkowe Fischer 10082147 <td></td></tr><tr><td>Fisherbrand - sterylne (PVDF 0,22 i mikro; m)</td> <td>Fischer Scientific</td><td>97203</td><td>Zestaw 100</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>BIO-RAD</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Gibco L-Glutamina (200 mM), 100x</td><td>Fischer Scientific</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fischer Scientific</td><td>BF229-4</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ATTC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-C1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kwas hydrokwarowy</td><td>Fischer</td><td>Scientific A144-212</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Przetwarzanie i analiza obrazu:&nbsp; http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>IntantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Bejca na bazie Coomassie</td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>Janelia Fluoro 646-tetrazyna</td><td>Tocris Bioscience</td><td>7279</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>5 g</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Menedżer (v. 1.4.2)</td><td></td><td></td><td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Kuweta mikropulsacyjna</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2086</td><td>0,2 cm odstęp między elektrodami, opakowanie 50</td></tr><tr><td>Nikon N-STORM</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask Kolby do hodowli komórkowych</td><td>ThermiFischer Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Casamino Acid</td><td>Calbiochem</td><td>2240</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Paraformaldehhyde (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)</td><td>GenDEPOT&nbsp;</td><td>CA005-010</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>pEVOL-PylRS-AF</td><td></td><td></td><td>Budowa plazmidu i mapa znajdują się pod następującymi numerami referencyjnymi 1. Angew Chem Int ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td><td></td><td></td><td>Ref: elife. 2021, 10, e67789.</td></tr><tr><td>plazmid pWSK29-sseJ-HA</td><td></td><td></td><td>Nr ref.: elife. 2021, 10, e67789.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Mapa wektorowa PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td></tr> <tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore</td><td>540025</td><td>Klasa białkowa, 10% roztwór</td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan potasu</td><td>Fischer Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan potasu</td><td>Acros Organiczny</td><td>zestaw</td> koktajli inhibitorów proteazy 424220250 <td></td></tr><tr><td>- Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>539131</td><td>100x Roztwór</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6908</td><td></td></tr><tr><td>S. enterica. serowar Typhimurium 14028s</td><td></td><td></td><td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fischer Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM), 100x</td><td>Corning</td><td>25-060-C1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Dysmembrator soniczny Model 100</td><td>Fischer Scientific</td><td>24932</td><td></td></tr><tr><td>STED mikrosocpe (system Leica TCS SP8 STED 3X)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td></tr> <tr><td>ThunderSTORM</td><td></td><td></td><td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td></tr> <tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&nbsp; &nbsp;</td><td>GenDEPOT&nbsp;</td><td>CA014-010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>X-well szkiełka do hodowli tkankowych</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Systemy wydzielania trzeciego typu (T3SS) umożliwiają bakteriom Gram-ujemnym wstrzykiwanie baterii białek efektorowych bezpośrednio do cytozolu eukariotycznych komórek gospodarza. Po wniknięciu wstrzyknięte białka efektorowe kooperatywnie modulują eukariotyczne szlaki sygnałowe i przeprogramowują funkcje komórkowe, umożliwiając wnikanie bakterii i przetrwanie. Monitorowanie i lokalizacja tych wydzielanych białek efektorowych w kontekście infekcji zapewnia podstawę do zdefiniowania dynamicznego interfejsu interakcji gospodarz-patogen. Jednak znakowanie i obrazowanie białek bakteryjnych w komórkach gospodarza bez zakłócania ich struktury/funkcji jest technicznie trudne. 
Konstruowanie fluorescencyjnych białek fuzyjnych nie rozwiązuje tego problemu, ponieważ białka fuzyjne zapychają aparat wydzielniczy i dlatego nie są wydzielane. Aby przezwyciężyć te przeszkody, zastosowaliśmy niedawno metodę specyficznego dla miejsca znakowania fluorescencyjnego efektorów wydzielanych przez bakterie, a także innych trudnych do znakowania białek, za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE). W tym artykule przedstawiono kompletny protokół krok po kroku oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą GCE specyficznego dla miejsca, a następnie wskazówki dotyczące obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM) 
Ostatnie odkrycia sugerują, że włączenie niekanonicznych aminokwasów (ncAA) przez GCE, a następnie bio-ortogonalne znakowanie barwnikami zawierającymi tetrazynę, jest realną techniką selektywnego znakowania i wizualizacji wydzielanych przez bakterie białek oraz późniejszej analizy obrazu w gospodarzu. Celem tego artykułu jest przedstawienie prostego i przejrzystego protokołu, który może być stosowany przez badaczy zainteresowanych przeprowadzaniem obrazowania w super rozdzielczości za pomocą GCE do badania różnych procesów biologicznych w bakteriach i wirusach, a także interakcji gospodarz-patogen.

Niniejszy artykuł opisuje metodę opartą na GCE do specyficznego dla miejsca znakowania fluorescencyjnego i wizualizacji efektorów wydzielanych przez Salmonella, co przedstawiono na Rysunku 1. Struktura chemiczna ncAA posiadającego bioortogonalną grupę trans-cyklooktenu (TCO) oraz barwnika fluorescencyjnego została pokazana na Rysunku 1A. Znakowanie SseJ osiągnięto poprzez genetyczną inkorporację bioortogonalnych ncAAs w ...

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Ekspansja kodu genetycznego (GCE) pokonuje ograniczenia innych strategii znakowania. Pozwala nam to na lokalizację specjalnie znakowanych białek i mamy jasne organiczne fluorofory, które umożliwiają ich wizualizację, dzięki czemu możemy uniknąć strategii, które tworzą, powiedzmy, fluorescencyjne fuzje białek, które mogą zakłócić funkcję białek. Tę metodę można zastosować do dowolnego innego systemu.Na przykład, użyliśmy go do znakowania białka CO wirusa Zika, co pozwala nam dostarczyć i wyprodukować znakowanego wirusa Zika, który następnie możemy obserwować infekujący komórki gospodarza. Na początek przenieś 100 mikrolitrów kultury pierwotnej do pięciu mililitrów pożywki LB zawierającej 35 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,6.Zastąp pożywkę LB zmodyfikowaną pożywką N-minimalną uzupełnioną jednym milimolowym TCO, niekanonicznym aminokwasem. I hoduj bakterie w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodaj 0,2% arabinozy, 25 miligramów na mililitr chloramfenikolu i 100 miligramów na mililitr ampicyliny i hoduj komórki przez kolejne sześć godzin, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.Po sześciu godzinach umyj bakterie cztery razy w odstępie 30 minut świeżymi pożywkami MgM bez niekanonicznych aminokwasów lub ncAA. Odwirować bakterie, ponownie zawiesić w buforze PBS i inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby usunąć nadmiar ncAA. Po godzinie odwirować bakterie w temperaturze 3 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przechowywać je do dalszego wykorzystania.W przypadku eksperymentu kontrolnego powtórz ten sam eksperyment, powodując ekspresję białek zawierających ncAA przy braku ncAA. Ponownie zawiesić komórki salmonelli wykazujące ekspresję SseJ włączone do TCO w przypadku braku lub obecności TCO w PBS. Dostosuj gęstość optyczną przy 600 nanometrach do czterech w PBS i inkubuj komórki z 20 mikromolowymi tetrazenami Janelia Fluor 646 lub 20 mikromolowymi tetrazynami BDPFL w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności i wstrząsaj przez jedną do dwóch godzin z prędkością 250 obr./min.Osadzaj komórki i przemyj trzy do czterech razy PBS zawierającym 5% DMSO i 0,2% Pluronic F-127. Ponownie zawiesić osad w PBS zawierającym 5% DMSO. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, ponownie dwukrotnie przemyć PBS.Natychmiast zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub utrwal je 1,5% paraformaldehydem w PBS przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Hoduj i utrzymuj komórki HeLa w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności w DMEM o wysokim poziomie glukozy uzupełnionym 10% FBS oprócz penicyliny streptomycyny. Posadź bakterie na dzień przed zakażeniem i zaszczep pojedynczą kolonię salmonelli typu dzikiego zawierającą plazmid pEVOL zawierający ortogonalną parę syntetazy tRNA i plazmid pWSK29 zawierający gen SseJ w pięciu milimetrach antybiotyku zawierającego standardowy bulion LB przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min.Napraw rozcieńczony zapas komórek w ilości 100 000 komórek na mililitr i zasiaj 50 000 komórek HeLA na studzienkę w 500 mikrolitrach DMEM zawierającym 10% pożywki wzrostowej FBS w szkiełku z ośmiodołkową komorą. Przechowuj szkiełko komorowe w inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 95%. W przypadku infekcji bakteryjnej subkultura salmonelli typu dzikiego zawierającego plazmid pEVOL i plazmid pWSK29 zawierający gen SseJ poprzez rozcieńczenie 100 mikrolitrów nocnej kultury bakteryjnej w trzech mililitrach pożywki LB zawierającej 35 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez pięć do siedmiu godzin. Aby zainicjować infekcję komórkami HeLa, po wyjęciu komórek HeLa z inkubatora, umyj komórki wstępnie podgrzanym DPBS i dodaj 500 mikrolitrów świeżego DMEM zawierającego 10% FBS do każdej studzienki. Umieść szkiełko komory z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla, aż rozpocznie się infekcja.Po pięciu do siedmiu godzinach inkubacji rozcieńczyć kulturę salmonelli tak, aby gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosiła 0,2 w jednym mililitrze pożywki wzrostowej DMEM i dodać wymagane ilości inokulum salmonelli do każdej studzienki szkiełka komorowego, tak aby wielokrotność infekcji wynosiła 100. Po inkubacji zakażonych komórek w inkubatorze dwutlenku węgla przez 30 minut, umyj komórki trzykrotnie podgrzanym DPBS w celu usunięcia zewnątrzkomórkowej salmonelli. Ustaw ten punkt czasowy na zero godzin po zakażeniu i dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki zawierającej 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny przez jedną godzinę.Po inkubacji, ponownie, przemyć komórki trzykrotnie DPBS, jak pokazano wcześniej, i dodać 500 mikrolitrów kompletnej pożywki uzupełnionej 0,2% arabinozą, 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny do każdego dołka szkiełka komorowego. W eksperymencie kontrolnym wykonaj podobne infekcje komórek HeLa bez TCO. Po inkubacji szkiełka komorowego przez 10 godzin w inkubatorze dwutlenku węgla, należy zastąpić kompletną pożywkę świeżą kompletną pożywką bez TCO i umyć komórki HeLa cztery razy w odstępie 30 minut każda za pomocą wstępnie podgrzanego DPBS.Następnie umyj komórki świeżą, kompletną pożywką bez TCO. Po 12 godzinach od zakażenia odessać pożywkę z komórek i umyć komórkę podgrzanym DPBS dwa lub trzy razy. W jednej grupie studzienek dodać 500 mikrolitrów mieszaniny roztworu barwnika jeden, a w innej grupie studzienek tego samego szkiełka komorowego dodać 500 mikrolitrów mieszaniny roztworu barwnika dwa.Umieść szkiełka z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla na jedną i 1/2 do dwóch godzin. Po 13,5 do 14 godzinach po zakażeniu dwukrotnie przepłucz komórki HeLa wstępnie podgrzanym DPBS i dodaj 500 mikrolitrów świeżego DMEM uzupełnionego FBS. Po inkubacji przez 30 minut ponownie przemyj komórki wstępnie podgrzanym DPBS, jak pokazano wcześniej, a następnie przemyj świeżym DMEM cztery razy w odstępie 30 minut.Po 16 godzinach od infekcji utrwal komórki HeLa za pomocą paraformaldehydu, dodając 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odessać paraformaldehyd. Spłucz trzy razy PBS i przechowuj komórki w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Przynieś komórki do mikroskopu i umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu w uchwycie próbki. Następnie zmień pożywkę w studzience na 0,4 mililitra świeżo przygotowanego bufora obrazującego GLOX BME. Zmniejsz moc lasera do około jednego miliwata, aby zidentyfikować komórkę HeLa będącą przedmiotem zainteresowania i dostosować płaszczyznę ogniskową oraz kąt wiązki laserowej, jednocześnie oświetlając próbkę niską gęstością lasera 647 nanometrów.Dostosuj kąt oświetlenia HILO. Uchwyć odniesienie do ograniczonego ułamkowo obrazu struktury docelowej i przełącz fluorofory w stan ciemny, obracając laser do jego maksymalnej mocy. Ustaw wzmacniacz wzmocnienia na trzy i aktywuj przenoszenie klatek.Następnie ustaw wzmocnienie EM na 200, aby uzyskać wyższą czułość w pomiarach dSTORM. Dostosuj siłę lasera do odpowiedniego poziomu, w którym zdarzenia są oddzielone w przestrzeni i czasie. Ustaw czas ekspozycji na 30 milisekund i rozpocznij akwizycję.Zdobądź od 10 000 do 30 000 klatek. Powtórz podobne pozyskiwanie przy różnych zwrotach z inwestycji. Aby zrekonstruować zobrazowanie dSTORM, otwórz obraz J i zaimportuj nieprzetworzone dane.Otwórz wtyczkę Thunderstorm i skonfiguruj ustawienia kamery odpowiednie dla urządzenia. Przejdź do uruchamiania analizy i ustaw odpowiednie ustawienia, takie jak filtrowanie obrazu, metody lokalizacji i lokalizacja subpikseli cząsteczek. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć rekonstrukcję obrazu i rozpocząć analizę wyników końcowych przetwarzania końcowego.Salmonelli wykazującą ekspresję SseJ włączoną do TCO traktuje się tetrazyną Janelia Fluor 646 i obrazuje fluorescencją Janelia Fluor 646 przy braku lub obecności TCO. Fluorescencja SseJ jest wykrywana tylko wtedy, gdy obecny jest TCO. Komórki HeLa są zakażone salmonellą zawierającą psseJ-HA przez 16 godzin, utrwalone i wybarwione immunologicznie przeciwciałem anty HA, LPS i DAPI.Zgodnie z oczekiwaniami, w zakażonych komórkach powstają zależne od SseJ włókna indukowane salmonellą lub SIF. W przypadku braku TCO, bursztynowy kodon nie jest tłumiony, a zależne od SseJ SIF są nieobecne w zakażonych komórkach HeLa. Sif zależne od SseJ obserwuje się w obecności TCO, co wyraźnie wskazuje, że SseJ został uratowany przez ekspresję SseJF10TCOHA za pomocą ekspansji kodu genetycznego lub GCE.Specyficzność znakowania wydzielanego SseJF10TCOHA w komórkach HeLa za pomocą reakcji kliknięcia SPIEDAC przy użyciu dwóch alternatywnych mieszanin barwników jednej i mieszaniny barwników drugiej pokazano tutaj. Barwnik klikający Janelia Fluor 646 TZ został następnie wykorzystany do obserwacji, czy w komórkach HeLa zakażonych Salmanellą typu dzikiego przenoszących SseJ HA występuje jakiekolwiek znakowanie tła w obecności plazmidu TCO i sklepienia P. SseJ został uwolniony do cytoplazmy komórki gospodarza bez wewnątrzkomórkowych lub niespecyficznych sygnałów fluorescencyjnych, co pokazuje, że sygnał fluorescencyjny był specyficzny dla SseJ.Obrazowanie w super rozdzielczości SseJ znakowanego GCE w komórkach HeLa przedstawiono na tym rysunku. Obraz w jasnym polu obserwowanej komórki HeLa jest pokazany tutaj. Ograniczony dyfrakcją obraz szerokokątny wydzielanego SseJ oznaczonego TCO i Janelia Fluor 646 oraz odpowiadający mu obraz dSTORM SFI ozdobionych SseJ są przedstawione tutaj.Wkładka pokazuje powiększony widok super rozdzielczego SseJ w obszarze ramkowym. Roztwory podstawowe NCAA przygotowano w NaOH. Nie zapomnij go zneutralizować przed lub po dodaniu do podłoża.Po znakowaniu interesującego białka dokładnie umyj komórkę, tak aby sygnał tła był minimalny. Postępując zgodnie z naszą procedurą GCE, możemy teraz oznaczyć dowolny czynnik wirulencji u bakterii i śledzić jego aktywność za pomocą naszych technik obrazowania.

super-resolution-imaging-bacterial-secreted-proteins-using-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół produkcji gram-ujemnych sferoplastów Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich protoplastów Bacillus megaterium (B. megaterium), aby wyraźnie zwizualizować i szybko scharakteryzować interakcje peptyd-bakteria. Zapewnia to systematyczną metodę definiowania peptydów lokalizujących i translokujących błonę.

Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację znakowanych fluorescencyjnie białek komórkowych za pomocą mikroskopii ekspansywnej, co prowadzi do rozdzielczości 70 nm na konwencjonalnym mikroskopie.

Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Badanie to ustanowiło metodę wykorzystującą rozszerzenie kodu genetycznego do skutecznej inkorporacji laktylizyny (Klac) w określonych miejscach ludzkiej enolazy-1 (hENO1) i superfolderu GFP (sfGFP) w komórkach Escherichia coli i ssaków.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Poznaj metodę ekspansji kodu genetycznego do etykietowania efektorów Salmonella i ich obrazowania w superrozdzielczości w komórkach HeLa za pomocą mikroskopii dSTORM.

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Przeglądaj więcej filmów