Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Ekspansja kodu genetycznego (GCE) pokonuje ograniczenia innych strategii znakowania. Pozwala nam to na lokalizację specjalnie znakowanych białek i mamy jasne organiczne fluorofory, które umożliwiają ich wizualizację, dzięki czemu możemy uniknąć strategii, które tworzą, powiedzmy, fluorescencyjne fuzje białek, które mogą zakłócić funkcję białek. Tę metodę można zastosować do dowolnego innego systemu.

Na przykład, użyliśmy go do znakowania białka CO wirusa Zika, co pozwala nam dostarczyć i wyprodukować znakowanego wirusa Zika, który następnie możemy obserwować infekujący komórki gospodarza. Na początek przenieś 100 mikrolitrów kultury pierwotnej do pięciu mililitrów pożywki LB zawierającej 35 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,6.

Zastąp pożywkę LB zmodyfikowaną pożywką N-minimalną uzupełnioną jednym milimolowym TCO, niekanonicznym aminokwasem. I hoduj bakterie w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodaj 0,2% arabinozy, 25 miligramów na mililitr chloramfenikolu i 100 miligramów na mililitr ampicyliny i hoduj komórki przez kolejne sześć godzin, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.

Po sześciu godzinach umyj bakterie cztery razy w odstępie 30 minut świeżymi pożywkami MgM bez niekanonicznych aminokwasów lub ncAA. Odwirować bakterie, ponownie zawiesić w buforze PBS i inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby usunąć nadmiar ncAA. Po godzinie odwirować bakterie w temperaturze 3 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przechowywać je do dalszego wykorzystania.

W przypadku eksperymentu kontrolnego powtórz ten sam eksperyment, powodując ekspresję białek zawierających ncAA przy braku ncAA. Ponownie zawiesić komórki salmonelli wykazujące ekspresję SseJ włączone do TCO w przypadku braku lub obecności TCO w PBS. Dostosuj gęstość optyczną przy 600 nanometrach do czterech w PBS i inkubuj komórki z 20 mikromolowymi tetrazenami Janelia Fluor 646 lub 20 mikromolowymi tetrazynami BDPFL w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności i wstrząsaj przez jedną do dwóch godzin z prędkością 250 obr./min.

Osadzaj komórki i przemyj trzy do czterech razy PBS zawierającym 5% DMSO i 0,2% Pluronic F-127. Ponownie zawiesić osad w PBS zawierającym 5% DMSO. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, ponownie dwukrotnie przemyć PBS.

Natychmiast zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub utrwal je 1,5% paraformaldehydem w PBS przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Hoduj i utrzymuj komórki HeLa w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności w DMEM o wysokim poziomie glukozy uzupełnionym 10% FBS oprócz penicyliny streptomycyny. Posadź bakterie na dzień przed zakażeniem i zaszczep pojedynczą kolonię salmonelli typu dzikiego zawierającą plazmid pEVOL zawierający ortogonalną parę syntetazy tRNA i plazmid pWSK29 zawierający gen SseJ w pięciu milimetrach antybiotyku zawierającego standardowy bulion LB przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min.

Napraw rozcieńczony zapas komórek w ilości 100 000 komórek na mililitr i zasiaj 50 000 komórek HeLA na studzienkę w 500 mikrolitrach DMEM zawierającym 10% pożywki wzrostowej FBS w szkiełku z ośmiodołkową komorą. Przechowuj szkiełko komorowe w inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 95%. W przypadku infekcji bakteryjnej subkultura salmonelli typu dzikiego zawierającego plazmid pEVOL i plazmid pWSK29 zawierający gen SseJ poprzez rozcieńczenie 100 mikrolitrów nocnej kultury bakteryjnej w trzech mililitrach pożywki LB zawierającej 35 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez pięć do siedmiu godzin. Aby zainicjować infekcję komórkami HeLa, po wyjęciu komórek HeLa z inkubatora, umyj komórki wstępnie podgrzanym DPBS i dodaj 500 mikrolitrów świeżego DMEM zawierającego 10% FBS do każdej studzienki. Umieść szkiełko komory z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla, aż rozpocznie się infekcja.

Po pięciu do siedmiu godzinach inkubacji rozcieńczyć kulturę salmonelli tak, aby gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosiła 0,2 w jednym mililitrze pożywki wzrostowej DMEM i dodać wymagane ilości inokulum salmonelli do każdej studzienki szkiełka komorowego, tak aby wielokrotność infekcji wynosiła 100. Po inkubacji zakażonych komórek w inkubatorze dwutlenku węgla przez 30 minut, umyj komórki trzykrotnie podgrzanym DPBS w celu usunięcia zewnątrzkomórkowej salmonelli. Ustaw ten punkt czasowy na zero godzin po zakażeniu i dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki zawierającej 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny przez jedną godzinę.

Po inkubacji, ponownie, przemyć komórki trzykrotnie DPBS, jak pokazano wcześniej, i dodać 500 mikrolitrów kompletnej pożywki uzupełnionej 0,2% arabinozą, 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny do każdego dołka szkiełka komorowego. W eksperymencie kontrolnym wykonaj podobne infekcje komórek HeLa bez TCO. Po inkubacji szkiełka komorowego przez 10 godzin w inkubatorze dwutlenku węgla, należy zastąpić kompletną pożywkę świeżą kompletną pożywką bez TCO i umyć komórki HeLa cztery razy w odstępie 30 minut każda za pomocą wstępnie podgrzanego DPBS.

Następnie umyj komórki świeżą, kompletną pożywką bez TCO. Po 12 godzinach od zakażenia odessać pożywkę z komórek i umyć komórkę podgrzanym DPBS dwa lub trzy razy. W jednej grupie studzienek dodać 500 mikrolitrów mieszaniny roztworu barwnika jeden, a w innej grupie studzienek tego samego szkiełka komorowego dodać 500 mikrolitrów mieszaniny roztworu barwnika dwa.

Umieść szkiełka z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla na jedną i 1/2 do dwóch godzin. Po 13,5 do 14 godzinach po zakażeniu dwukrotnie przepłucz komórki HeLa wstępnie podgrzanym DPBS i dodaj 500 mikrolitrów świeżego DMEM uzupełnionego FBS. Po inkubacji przez 30 minut ponownie przemyj komórki wstępnie podgrzanym DPBS, jak pokazano wcześniej, a następnie przemyj świeżym DMEM cztery razy w odstępie 30 minut.

Po 16 godzinach od infekcji utrwal komórki HeLa za pomocą paraformaldehydu, dodając 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odessać paraformaldehyd. Spłucz trzy razy PBS i przechowuj komórki w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Przynieś komórki do mikroskopu i umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu w uchwycie próbki. Następnie zmień pożywkę w studzience na 0,4 mililitra świeżo przygotowanego bufora obrazującego GLOX BME. Zmniejsz moc lasera do około jednego miliwata, aby zidentyfikować komórkę HeLa będącą przedmiotem zainteresowania i dostosować płaszczyznę ogniskową oraz kąt wiązki laserowej, jednocześnie oświetlając próbkę niską gęstością lasera 647 nanometrów.

Dostosuj kąt oświetlenia HILO. Uchwyć odniesienie do ograniczonego ułamkowo obrazu struktury docelowej i przełącz fluorofory w stan ciemny, obracając laser do jego maksymalnej mocy. Ustaw wzmacniacz wzmocnienia na trzy i aktywuj przenoszenie klatek.

Następnie ustaw wzmocnienie EM na 200, aby uzyskać wyższą czułość w pomiarach dSTORM. Dostosuj siłę lasera do odpowiedniego poziomu, w którym zdarzenia są oddzielone w przestrzeni i czasie. Ustaw czas ekspozycji na 30 milisekund i rozpocznij akwizycję.

Zdobądź od 10 000 do 30 000 klatek. Powtórz podobne pozyskiwanie przy różnych zwrotach z inwestycji. Aby zrekonstruować zobrazowanie dSTORM, otwórz obraz J i zaimportuj nieprzetworzone dane.

Otwórz wtyczkę Thunderstorm i skonfiguruj ustawienia kamery odpowiednie dla urządzenia. Przejdź do uruchamiania analizy i ustaw odpowiednie ustawienia, takie jak filtrowanie obrazu, metody lokalizacji i lokalizacja subpikseli cząsteczek. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć rekonstrukcję obrazu i rozpocząć analizę wyników końcowych przetwarzania końcowego.

Salmonelli wykazującą ekspresję SseJ włączoną do TCO traktuje się tetrazyną Janelia Fluor 646 i obrazuje fluorescencją Janelia Fluor 646 przy braku lub obecności TCO. Fluorescencja SseJ jest wykrywana tylko wtedy, gdy obecny jest TCO. Komórki HeLa są zakażone salmonellą zawierającą psseJ-HA przez 16 godzin, utrwalone i wybarwione immunologicznie przeciwciałem anty HA, LPS i DAPI.

Zgodnie z oczekiwaniami, w zakażonych komórkach powstają zależne od SseJ włókna indukowane salmonellą lub SIF. W przypadku braku TCO, bursztynowy kodon nie jest tłumiony, a zależne od SseJ SIF są nieobecne w zakażonych komórkach HeLa. Sif zależne od SseJ obserwuje się w obecności TCO, co wyraźnie wskazuje, że SseJ został uratowany przez ekspresję SseJF10TCOHA za pomocą ekspansji kodu genetycznego lub GCE.

Specyficzność znakowania wydzielanego SseJF10TCOHA w komórkach HeLa za pomocą reakcji kliknięcia SPIEDAC przy użyciu dwóch alternatywnych mieszanin barwników jednej i mieszaniny barwników drugiej pokazano tutaj. Barwnik klikający Janelia Fluor 646 TZ został następnie wykorzystany do obserwacji, czy w komórkach HeLa zakażonych Salmanellą typu dzikiego przenoszących SseJ HA występuje jakiekolwiek znakowanie tła w obecności plazmidu TCO i sklepienia P. SseJ został uwolniony do cytoplazmy komórki gospodarza bez wewnątrzkomórkowych lub niespecyficznych sygnałów fluorescencyjnych, co pokazuje, że sygnał fluorescencyjny był specyficzny dla SseJ.

Obrazowanie w super rozdzielczości SseJ znakowanego GCE w komórkach HeLa przedstawiono na tym rysunku. Obraz w jasnym polu obserwowanej komórki HeLa jest pokazany tutaj. Ograniczony dyfrakcją obraz szerokokątny wydzielanego SseJ oznaczonego TCO i Janelia Fluor 646 oraz odpowiadający mu obraz dSTORM SFI ozdobionych SseJ są przedstawione tutaj.

Wkładka pokazuje powiększony widok super rozdzielczego SseJ w obszarze ramkowym. Roztwory podstawowe NCAA przygotowano w NaOH. Nie zapomnij go zneutralizować przed lub po dodaniu do podłoża.

Po znakowaniu interesującego białka dokładnie umyj komórkę, tak aby sygnał tła był minimalny. Postępując zgodnie z naszą procedurą GCE, możemy teraz oznaczyć dowolny czynnik wirulencji u bakterii i śledzić jego aktywność za pomocą naszych technik obrazowania.