Ocena funkcji dwukomorowej myszy ex vivo w modelu Langendorffa

Dzięki opisanemu protokołowi możemy porównać lewą komorę serca dawcy i funkcję komory po zachowaniu, a także możemy zbadać różnicę w biologii konserwatorskiej w obu komorach podczas tego procesu konserwacji. Technika ta wykorzystuje system perfuzji ex vivo do badania funkcji serca po konserwacji. Zapewnia solidne i niezawodne narzędzia do badań przesiewowych nowych metod leczenia w celu poprawy funkcji serca dawcy po jego zachowaniu.

Rozpocznij od przygotowania ciasta zgodnie z opisem w tekście i uformuj mały kawałek ciasta w owalny kształt, aby uzyskać głowę. Przymocuj go do końca suchego pasma spaghetti. Zanurz głowę w już przygotowanym roztworze cukru i powoli ją wyjmij, gdy zostanie dobrze pokryta cienką warstwą roztworu.

Następnie zawieś pasmo spaghetti na bloku styropianu lub innych uchwytach, aby umożliwić utworzenie równej i błyszczącej powłoki na głowie i wysusz je przez noc. Następnego dnia zanurz formę w elastomerze silikonowym zdyspergowanym w ksylenie i umieść pasmo spaghetti z powrotem w bloku styropianu w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny lub do wyschnięcia. Powtórz ten krok jeszcze raz.

Następnie umieść formę w wodzie, aby oddzielić i zebrać balon. Przechowywać balon w 0,02% azydku sodu. Teraz odetnij dwie końcówki z igły o rozmiarze 22 i zamontuj jeden koniec do silikonowego balonu, a drugi koniec do rurki PE.

Użyj jedwabnego szwu 4-0, aby zawiązać balon na miejscu na igle. Weźmy mysz C57Black/6 i wstrzyknąć dootrzewnowo 200 jednostek heparyny do brzucha zwierzęcia w celu antykoagulacji. Po potwierdzeniu prawidłowego znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi należy wykonać nacięcie tuż pod mostkiem.

I za pomocą nożyczek otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę w żebrach. Następnie złóż przednią ścianę klatki piersiowej, aby całkowicie odsłonić klatkę piersiową przed wykonaniem nacięcia w aorcie zstępującej w pobliżu łuku aorty. Teraz przenieś serce, płuca i grasicę myszy do lodowatego buforu histydyno-tryptofanu-ketoglutaranu lub HTK, aby wyizolować narządy.

Odsłoń aortę, usuwając tkankę łączną. Połącz koniec aorty z igłą o rozmiarze 22 i zawiąż ją jedwabnym szwem 6-0. Upewnij się, że kaniula znajduje się powyżej korzenia aorty, aby nie kolidować z zastawką aortalną.

Płucz aortę przez około 10 minut za pomocą 10 mililitrów buforu HTK, wstępnie schłodzonego do czterech stopni Celsjusza. W zależności od rodzaju eksperymentu, albo przechowuj serce w 50-mililitrowej tubce z lodowatym HTK przez osiem godzin, albo natychmiast wykonaj obfitość. Aby wykonać profuzję, należy połączyć serce zamontowane na igle z kaniulą w aparacie Langendorffa i zawiązać je jedwabnym szwem.

Rozpocznij obfitowanie w trybie stałego przepływu przy trzech mililitrach na minutę, a następnie po zmianie na tryb stałego ciśnienia przy 70 do 80 milimetrach słupa rtęci dostosuj szybkość perfuzji do około sześciu mililitrów na minutę. Następnie podłącz opróżniony balon silikonowy wypełniony wodą do przetwornika ciśnienia i strzykawki wypełnionej wodą za pomocą kranu trójdrożnego. Po 15 do 20 minutach okresu równowagi następującego po poprzedniej perfuzji, przeciąć prawy przedsionek lub RA i włożyć balon do prawej komory lub RV przez RA. Użyj taśmy, aby przytrzymać balon wewnątrz RV i zminimalizować otwartą przestrzeń RA, aby pomóc unieruchomić balon w komorze.

Po 20 minutach zbierania danych funkcjonalnych dla RV przetnij lewy przedsionek lub LA i włóż opróżniony balon wypełniony wodą do lewej komory lub LV przez LA. Użyj taśmy, aby przytrzymać balon wewnątrz LV.To skalibruj przetwornik ciśnienia, najpierw napełnij 10-mililitrową strzykawkę ciepłą solą fizjologiczną i podłącz strzykawkę do kopuły przez trójdrożny kran. Otwórz kran i powoli napełnij kopułę solą fizjologiczną, a następnie zamknij wszystkie krany i wyjmij strzykawkę. Następnie przymocuj napełnioną kopułę do przetwornika, podłączając manometr do trzeciego końca kranu trójdrożnego.

W oprogramowaniu do nagrywania, z menu rozwijanego kanału łączącego się z przetwornikiem, wybierz opcję Bridge Amp. Kliknij 0 przed rozpoczęciem nagrywania, aby ustawić odczyt przetwornika na zero milimetrów słupa rtęci. Po kilku sekundach nagrywania powoli popchnij strzykawkę i zwiększ ciśnienie do 100.

Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć nagrywanie. W oknie dialogowym Konwersja jednostek wybierz obszar zapisu dla zera milimetrów słupa rtęci i kliknij strzałkę do 1 przed wpisaniem zero milimetrów słupa rtęci. Podobnie wybierz obszar nagrywania dla 100 milimetrów słupa rtęci.

Kliknij strzałkę 2 i wpisz 100 milimetrów słupa rtęci. Teraz kliknij OK, aby skalibrować przetwornik. Po zakończeniu kalibracji zmień nazwę kanału odpowiadającego przetwornikowi ciśnienia z balonem na Ciśnienie w komorze lub Ciśnienie LV i rozpocznij nagrywanie, gdy serce jest podłączone do systemu.

Po włożeniu balonu do komory wyreguluj objętość wody w balonie za pomocą strzykawki mikrometrycznej przez trzykierunkowy kran, aby utrzymać końcowe ciśnienie rozkurczowe na poziomie od pięciu do 10 milimetrów słupa rtęci. Następnie zmień nazwę pustego kanału na dP/dt i zachowaj pochodny kanał źródłowy jako ciśnienie w komorze ciśnienia. Kanał ten rejestruje stosunek zmian ciśnienia w komorze podczas skurczu.

Wybierz stabilny okres pomiaru przed przejściem do ustawień w module ciśnienia krwi. Następnie wybierz LV Pressure jako kanał wejściowy i kliknij wybór przed naciśnięciem OK. Teraz kliknij Widok klasyfikatora, aby usunąć wszelkie odstające cykle serca, i Widok tabeli, aby wygenerować tabele dla średniej maksymalnej wartości dP/dt i minimalnej wartości dP/dt dla wybranego okresu. Gdy serce myszy było przechowywane w buforze HTK przez zero godzin przed perfuzją, zarejestrowano wyższe ciśnienie skurczowe dla LV w porównaniu z RV. Dodatkowo, w porównaniu do RV, LV wykazywał również znacznie większy skurcz mięśni, a także rozluźnienie.

Jednakże, gdy perfuzja została przeprowadzona na sercu po poddaniu go ośmiogodzinnemu przechowywaniu w chłodni, zarówno LV, jak i RV wykazały znaczną redukcję funkcjonalną w porównaniu z etapem godziny zero. Zaobserwowano, że spadki były bardziej dotkliwe w LV w porównaniu z RV. Skurczenie i złagodzenie LV po ośmiogodzinnym przechowywaniu wynosiło 25,1% i 30,7% funkcji odpowiadającej przechowywaniu zerogodzinnemu, podczas gdy RV wykazywało 32,5% i 29,1% funkcji, w porównaniu z punktem odniesienia zerogodzinnym. Wskazanie pierwotnej dysfunkcji przeszczepu LV po długotrwałym przechowywaniu było bardziej znaczące niż w przypadku RV. Jakość konserwacji zależy w dużej mierze od perfuzji HTK.

Ważne jest, aby upewnić się, że perfuzja jest spójna, aby precyzyjnie porównać różne zabiegi. Dzięki precyzyjnemu pomiarowi funkcji zachowania serca dawcy, metodę tę można łatwo dostosować do badań przesiewowych leków, które mogą poprawić czynność serca dawcy, a następnie przeprowadzić dalszą walidację przy użyciu heterotopowego modelu przeszczepu.