Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D
13 stycznia 2023
Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.
Terapia fotodynamiczna, PDT, ma wiele zalet w leczeniu raka, a jej skuteczność zależy od źródła światła, które aktywuje fotouczulacz. Pomimo najnowszych postępów w tej dziedzinie, brakuje dostępu do drogiego i powtarzalnego urządzenia do PTD do modeli in vitro. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, w niniejszej pracy opisano nowatorskie, proste i tanie urządzenie do wykonywania testów PDT na kulturach komórkowych, nazwane PhotoAct.
Aby rozpocząć budowę, przytnij płyty pilśniowe o średniej gęstości o grubości trzech milimetrów, MDF, aby uzyskać kawałki o następujących wymiarach. Zbuduj dwa pudełka o następujących wymiarach. Wywierć tył większego pudełka, aby zainstalować złącze podnośnika baryłkowego.
Wywierć również górną część większej skrzynki, górę i dół mniejszej skrzynki, aby zapewnić przejście dla elektrycznych. Pomaluj wszystkie wewnętrzne powierzchnie czarnym tuszem, aby zapewnić jednorodne padanie światła. Przymocuj równolegle trzy taśmy LED po 10 diod LED każda na górnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka.
Dodatkowo zainstaluj czujnik jasności na środku dolnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka. Wydrukuj strukturę jednostki sterującej za pomocą dodatkowego pliku do druku 3D. Zainstaluj wszystkie komponenty, przycisk zasilania, potencjometry, touchpad czasu startu, diody LED, czujnik jasności, wyświetlacz LCD, brzęczyk i zasilacz oraz części płytki kontrolera ESP-32 zamontowane we wnętrzu jednostki sterującej.
Prześlij kod programowania dostępny w pliku uzupełniającym i uruchom test, aby sprawdzić, czy wszystkie połączenia działają. Zmontuj skrzynki i przymocuj je razem, aby uniknąć szczelin, a co za tym idzie zakłóceń oświetlenia zewnętrznego i natychmiastowej utraty światła. Przymocuj zamontowaną jednostkę sterującą do wywierconego obszaru w górnej części prototypu.
Zbuduj drzwi wejściowe z tego samego materiału w następujących wymiarach i przymocuj je do pudełka zewnętrznego za pomocą zawiasów i taśm rzepowych, aby zapewnić zamknięcie komory i nieprzerwane testy. Zainstaluj również klamkę, aby z łatwością i precyzją manipulować drzwiami wejściowymi. Przymocuj cztery gumowe podkładki pod stopy na spodzie prototypu, aby zapewnić większą stabilność podczas operacji.
Hoduj linię komórkową HeLa w zmodyfikowanym orzele Dulbecco o średniej niskiej glikemii z 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% gentamycyny. Utrzymuj kolby hodowlane na poziomie 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Zarządzaj i kontroluj hodowlę komórkową, aż osiągniesz 80 do 90% zbieżności.
Rozpocznij protokół żywotności komórek od procesu wysiewu. Usunąć pożywkę z kolby z zlewającą się hodowlą komórek HeLa. Przemyć kolbę roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, PBS i odłączyć kulturę trypsyną, postępując zgodnie z zaznaczonymi szczegółami.
Policz ponowne zawieszenie komórek za pomocą hemocytometru i umieść je na wielodołkowej mikropłytce o stężeniu 20 000 komórek na dołek. Przygotuj dwie płytki do ciemnych i jasnych warunków leczenia i inkubuj je przez 24 godziny do przyłączenia komórek. Aby kontynuować leczenie fotouczulaczem, usuń pożywkę z obu płytek i potraktuj komórki 100 mikrolitrami rosnących stężeń werteporfiny.
Utrzymuj komórki w leczeniu przez 24 godziny, aby umożliwić internalizację werteporfiny. Po inkubacji usunąć zabieg, przemyć komórki PBS i dodać pożywkę wolną od leków. Przykryj jedną mikropłytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed ekspozycją na światło i inkubuj przez 24 godziny.
Ta mikropłytka dostarczy danych kontrolnych do dalszej analizy wyników PDT. Druga mikropłytka zostanie wykorzystana w warunkach ekspozycji na światło w PhotoAct. Aby obsługiwać urządzenie, podłącz je do gniazdka i włącz, naciskając przycisk zasilania.
Umieść mikropłytkę wielodołkową w komorze PDT i zamknij urządzenie, mocując przednie drzwiczki bocznymi taśmami rzepowymi. Aby skonfigurować sprzęt, użyj potencjometrów, aby dostosować konfigurację RGB emisji światła. Naciśnij panel dotykowy plus/minus, aby dostosować konfigurację czasu i ustawić czas trwania testu.
Sprawdź, czy na wyświetlaczu pojawiają się prawidłowe informacje o teście i w razie potrzeby dokonaj ostatecznych korekt. Naciśnij początkowy panel dotykowy, aby rozpocząć test. Na początku eksperymentu musi być słyszalny brzęczyk z jednym sygnałem dźwiękowym.
Podczas eksperymentu na wyświetlaczu można obserwować informacje o postępie, takie jak natężenie promieniowania i pozostały czas. Nie otwieraj drzwi wejściowych ani nie zmieniaj żadnej konfiguracji podczas testu PDT. Pod koniec testu musi być słyszalny brzęczyk z czterema sygnałami dźwiękowymi, a system elektroniczny wyłączy wszystkie diody LED.
Na wyświetlaczu można zaobserwować gotową wiadomość i końcową ilość energii rozprężonej podczas eksperymentu. Końcowa wartość fluencji jest obliczana zgodnie z podświetlonym równaniem. Przykryj mikropłytkę, która została wystawiona na działanie światła i kontynuuj 24-godzinną inkubację.
Po okresie inkubacji usunąć pożywkę z obu płytek, przemyć monowarstwę komórek PBS i dodać roztwór MTT. Inkubuj obie płytki w ciemnościach i jasności przez cztery godziny, aby umożliwić tworzenie się kryształów formazanu. Ostrożnie usuń roztwór MTT i rozpuść fioletowe kryształy w roztworze DMSO i etanolu.
Po całkowitym rozpuszczeniu kryształów przeprowadzić pomiar absorbancji za pomocą czytnika mikropłytek o długości 595 nanometrów. Produkt końcowy składa się z ciemnej komory, której górna powierzchnia wewnętrzna wyposażona jest w zestaw 30 diod elektroluminescencyjnych światła rozproszonego, diod LED, zaprogramowanych tak, aby emitować wyraźne widma światła widzialnego. Jednorodne padanie światła uzyskuje się dzięki niskiemu współczynnikowi odbicia powierzchni wewnętrznych i równomiernemu rozkładowi konfiguracji diod LED.
Interfejs konfiguracji jest przyjazny dla użytkownika, a ustalony warunek eksperymentu był powtarzalny. Jako dowód słuszności koncepcji, urządzenie wykorzystano do wzmocnienia cytotoksycznego działania werteporfiny w hodowli komórkowej 2D HeLa po ekspozycji na światło. Jak pokazano na rysunku, wartość GI50 wynosiła 3,1 mikromola dla warunków oświetleniowych.
i 13,8 mikromola dla ciemnych warunków Dlatego ponad czterokrotny wzrost skuteczności w porównaniu z warunkami potwierdza zastosowanie Verteporfin jako fotouczulacza i możliwość zastosowania PhotoAct w testach PDT. Aby zweryfikować zastosowanie prototypu opisanego w tej pracy, użyto komercyjnego urządzenia PDT w tych samych warunkach eksperymentalnych, w tym fotosensybilizatora, komórek i fluencji, a wyniki porównano. Jak pokazano na rysunku, oba urządzenia fotoaktywowały werteporfinę w równym stopniu, wzmacniając efekt cytotoksyczny.
Wreszcie, śmierć komórki, w której pośredniczy ROS, wywołana przez werteporfinę po ekspozycji na światło, została potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu testu DCFDA. Podsumowując, urządzenie zostało łatwo zbudowane z dostępnych na rynku tanich komponentów o łącznym koszcie poniżej 50 sztuk. Główną inną zaletą urządzenia jest przenośność, niskie wymagania konserwacyjne, zdolność do napromieniania wielu rodzajów płytek hodowlanych, jednoczesne stosowanie do czterech jednostek na test, dokładne i powtarzalne napromienianie, przyjazny dla użytkownika i prosty interfejs konfiguracji, który nie wymaga połączenia z komputerami lub innymi maszynami.
Ponadto prezentowany jest schemat blokowy decyzji, aby zapewnić systematyczne podejście do rozwiązywania problemów w celu znalezienia i skorygowania problemów lub błędów podczas operacji. Odkrycia te pozwalają rozszerzyć korzyści płynące z PhotoAct w celu ułatwienia PDT na badania naukowe, badając mechanizm działania fotouczulaczy i ich zastosowania kliniczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono nowatorskie, niskokosztowe urządzenie zaprojektowane do testów terapii fotodynamicznej (PDT) in vitro z wykorzystaniem kultur komórek HeLa. Urządzenie o nazwie PhotoAct odpowiada na potrzebę zapewnienia dostępnej technologii PDT w badaniach nad rakiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia fotodynamiczna
- Leczenie nowotworów
- Technologia hodowli komórkowych
Wstęp
- Terapia fotodynamiczna (PDT) jest skuteczną metodą leczenia nowotworów.
- Skuteczność PDT opiera się na zastosowaniu źródła światła do aktywacji fotousensybilizatorów.
- Obecne urządzenia do PDT są często kosztowne i trudne do odtworzenia.
- W badaniach naukowych rośnie zapotrzebowanie na przystępne cenowo rozwiązania w zakresie PDT.
Cel badania
- Opracowanie prostego i kosztowo efektywnego urządzenia do testów PDT.
- Ułatwienie badań in vitro z wykorzystaniem kultur komórek HeLa.
- Zwiększenie dostępności technologii PDT dla badaczy.
Zastosowane metody
- Budowa urządzenia PhotoAct z wykorzystaniem płyt pilśniowych o średniej gęstości (MDF).
- Projektowanie i montaż obudów o określonych wymiarach.
- Instalacja gniazda zasilania typu barrel jack.
- Testowanie skuteczności urządzenia w badaniach PDT.
Główne wyniki
- Urządzenie PhotoAct z powodzeniem przeprowadza testy PDT na kulturach komórek HeLa.
- Stanowi ono niskokosztową alternatywę dla istniejących urządzeń do PDT.
- Urządzenie jest łatwe w konstrukcji i obsłudze w warunkach laboratoryjnych.
- Wyniki wskazują na potencjał do szerszego zastosowania w badaniach nad rakiem.
Wnioski
- Opracowanie urządzenia PhotoAct odpowiada na zapotrzebowanie na przystępną cenowo technologię PDT.
- Ta innowacja może zwiększyć możliwości badawcze w zakresie terapii fotodynamicznej.
- Przyszłe badania mogą zgłębić zastosowanie tego urządzenia w różnych modelach nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dostępne i powtarzalne platformy do terapii fotodynamicznej (PDT) są kluczowe dla wczesnych etapów badań onkologicznych oraz mechanistycznej oceny ryzyka kandydatów na fotouczulacze. Urządzenie PhotoACT umożliwia standaryzowane, ilościowe analizy PDT in vitro, zwiększając wiarygodność przewidywań w zakresie cytotoksyczności i badania szlaków sygnałowych. Możliwość ta usprawnia selekcję projektów w portfolio oraz walidację celów w przedklinicznych programach onkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę mechanizmów działania fotouczulaczy w kontrolowanych modelach komórkowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe określenie cytotoksyczności zależnej od światła.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki powtarzalnym testom śmierci komórek indukowanej przez ROS.
- Zapewnia ilościowe punkty odniesienia służące do priorytetyzacji kandydatów.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowaną, programowalną ekspozycję na światło w celu zapewnienia powtarzalności testów.
- Umożliwia pracę z wieloma mikropłytkami, zwiększając przepustowość oceny związków.
- Generuje ilościowe odczyty żywotności dla niezawodnych procesów przesiewowych.
- Umożliwia bezpośrednie porównanie z komercyjnymi platformami PDT w celu walidacji testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje cytotoksyczność in vitro z biomarkerami mechanicznymi, takimi jak generowanie ROS.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając porównanie danych międzyplatformowych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez standaryzację parametrów dostarczania światła i ekspozycji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Urządzenie PhotoACT integruje się z kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie testów PDT opartych na hipotezach, ilościowe pomiary żywotności oraz walidację mechanistyczną fotouczulaczy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej w zakresie aktywowanej światłem cytotoksyczności i udziału ROS.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalną, programowalną ekspozycję na światło w celu standaryzacji analizy.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane dotyczące żywotności i ROS do porównania warunków.
- Badania translacyjne: Ułatwia walidację międzyplatformową i dopasowanie mechanistyczne do punktów końcowych badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, niskokosztową platformę do bieżących badań nad PDT i rozwoju metod analizy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie skuteczności i mechanizmu działania fotouczulaczy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie światła oraz warunki analizy w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza ryzyko biologiczne na późniejszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów do PDT oraz programów mechanistycznych w oparciu o dostosowanie do ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu hodowli komórkowej i fotobiologii w celu przeprowadzenia procedury i interpretacji danych.
- Wymaga standardowej infrastruktury laboratoryjnej, w tym czytników mikropłytek i zaplecza do hodowli komórkowej.
- Wymaga uzgodnienia parametrów ekspozycji na światło pomiędzy zespołami w celu standaryzacji analizy.
- Możliwość adaptacji do różnych linii komórkowych i formatów płytek przy niewielkich modyfikacjach protokołu.
- Ograniczone do zastosowań in vitro; przeniesienie wyników na model in vivo wymaga dodatkowej walidacji.
