Name: Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj metodę budowy taniego urządzenia PhotoAct do terapii fotodynamicznej w hodowlach komórkowych HeLa. To rozwiązanie umożliwia badaczom dostęp do technologii PDT w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Arthurowi Henrique Gomesowi de Oliveira i Lucasowi Julianowi Cruzowi Gomesowi za pomoc w procesie filmowania. Projekt ten był wspierany przez Brazylijską Radę ds. Badań Naukowych (CNPq, numery grantów 400953/2016-1-404286/2021-6) oraz Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Badanie to zostało również częściowo sfinansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i oprogramowania wykorzystanych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Konstrukcja urządzenia
<ol>
	<li>Dotnij płyty MDF o grubości 3 mm, aby uzyskać elementy o wymiarach przedstawionych na Rysunku 1A. 
	UWAGA: Do wycinania za pomocą sterowania numerycznego (CNC) należy użyć pliku wektorowego (Plik uzupełniający 1).</li>
	<li>Zbuduj dwa pudełka o następujących wymiarach (długość x szerokość x wysokość): 330 mm x 235 mm x 225 mm dla większego pudełka oraz 300 mm x 220 mm x 150 mm dla mniejszego pudełka (Rysunek 1B).</li>
	<li>Wywierć otwór w tylnej części większego pudełka, aby zamontować gniazdo zasilania DC. Wywierć otwory w górnej części większego pudełka oraz w górnej i dolnej części mniejszego pudełka, aby zapewnić przejście dla przewodów elektrycznych (Rysunek 1C).</li>
	<li>Pomaluj wszystkie wewnętrzne powierzchnie na czarno, aby zapewnić jednorodność padania światła (Rysunek 1D).</li>
	<li>Przymocuj równolegle trzy taśmy LED, każda z 10 diodami LED, do górnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka (Rysunek 1E).</li>
	<li>Zainstaluj czujnik natężenia światła w centrum dolnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka (Rysunek 1F).</li>
	<li>Wydrukuj strukturę jednostki sterującej (Rysunek 1G), korzystając z pliku do druku 3D (Plik uzupełniający 2).</li>
	<li>Zainstaluj wszystkie komponenty (przycisk zasilania, potencjometry, panel dotykowy czasu/startu, diody LED, czujnik natężenia światła, wyświetlacz LCD, brzęczyk i zasilacz) w portach płytki sterującej ESP32 zamontowanej wewnątrz jednostki sterującej (Rysunek 2).</li>
	<li>Wgraj kod programu (Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4 oraz Plik uzupełniający 5) i przeprowadź test, aby sprawdzić poprawność wszystkich połączeń (Rysunek 1H).</li>
	<li>Złóż pudełka i przymocuj je do siebie, aby uniknąć szczelin, a tym samym interferencji światła zewnętrznego i strat emitowanego światła. Przymocuj zamontowaną jednostkę sterującą do wywierconego otworu na górze prototypu (Rysunek 1I).</li>
	<li>Zamocuj drzwiczki przednie wykonane z tego samego materiału o wymiarach 330 mm x 225 mm (długość x szerokość) do większego pudełka za pomocą dwóch małych zawiasów. Dodatkowo przymocuj bocznie taśmy rzepowe do większego pudełka, aby wzmocnić domknięcie prototypu (Rysunek 1J). Zamontuj uchwyt do otwierania i zamykania drzwiczek urządzenia.</li>
	<li>Przymocuj cztery gumowe stopki do spodu prototypu, aby zapewnić większą stabilność podczas pracy (Rysunek 1K).</li>
</ol>
2. Linie komórkowe: hodowla, wysiew i traktowanie
<ol>
	<li>Odczynniki chemiczne
	<ol>
		<li>Rozpuścić porfirynę w dimetylosulfoksydzie (DMSO) do uzyskania stężenia 100 mM. 
		OSTROŻNIE: DMSO należy manipulować ostrożnie (pracować przy użyciu środków ochrony osobistej i w wentylowanym pomieszczeniu). Zarówno roztwory zapasowe, jak i rozcieńczone należy manipulować ostrożnie, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na światło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Linie komórkowe
	<ol>
		<li>Hodować linię komórkową HeLa w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) o niskiej zawartości glukozy, uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% gentamycyny.</li>
		<li>Przechowywać kolby z kulturą w inkubatorze do hodowli komórkowej z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Prowadzić hodowlę i kontrolować komórki aż do osiągnięcia 80%-90% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces wysiewania
	<ol>
		<li>Usunąć podłoże hodowlane z kolby.</li>
		<li>Przemyć monowarstwę komórek PBS.</li>
		<li>Odczepić konfluentną kulturę komórek za pomocą trypsyny-EDTA (0,5%) 1x przez 5 min w 37 °C. Zneutralizować działanie trypsyny, resuspendując komórki w podłożu hodowlanym uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% gentamycyny.</li>
		<li>Policzyć zresuspendowane komórki za pomocą komory licznicowej (hemocytometru) i wysiać je do płytki 96-dołkowej w zagęszczeniu 2,0 × 104 komórek/dołek.</li>
		<li>Przygotować dwie płytki: dla warunków ciemności i naświetlania.</li>
		<li>Inkubować płytki przez 24 h w celu adhezji komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces traktowania
	<ol>
		<li>Usunąć podłoże z obu płytek 96-dołkowych.</li>
		<li>Potraktować komórki 100 µL roztworów werteporfiny o rosnących stężeniach (od 0,045 do 24 µM, rozcieńczenie seryjne).</li>
		<li>Inkubować komórki z lekiem przez 24 h, aby umożliwić internalizację werteporfiny.</li>
		<li>Po 24 h usunąć podłoże zawierające lek, przemyć monowarstwę komórek PBS (100 µL) i dodać podłoże wolne od leku (100 µL).</li>
		<li>Przykryć jedną mikropłytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed ekspozycją na światło, i inkubować przez 24 h. Płytka ta dostarczy danych kontrolnych dla wyników PDT (warunki ciemności). Druga mikropłytka zostanie wykorzystana w warunkach ekspozycji na światło w urządzeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obsługa urządzenia
<ol>
	<li>Podłącz urządzenie PDT do gniazda elektrycznego i włącz je, naciskając przycisk zasilania (power).</li>
	<li>Umieść drugą mikropłytkę (warunki świetlne) w urządzeniu PDT i zamknij sprzęt, mocując przednie drzwiczki za pomocą taśm rzepowych.</li>
	<li>Użyj potencjometrów, aby dostosować konfigurację RGB (w tym przypadku eksperyment RGB 255, 255, 255) i ustawić kolor emitowanego światła. 
	UWAGA: Każda kombinacja RGB ma specyficzne widmo emisji, które musi zostać dostosowane do eksperymentów z różnymi fotosensybilizatorami, a w konsekwencji do różnych krzywych absorbancji.</li>
	<li>Naciśnij panel dotykowy (+)/(-), aby dostosować konfigurację czasu (w tym przypadku eksperyment 60 min) i ustawić czas trwania badania. 
	UWAGA: Konfiguracja czasu, w powiązaniu z wartością natężenia promieniowania, wyznaczy fluencję procesu, czyli dawkę światła zastosowaną w badaniu.</li>
	<li>Sprawdź informacje o ustawieniach (setup) na wyświetlaczu.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć badanie. Upewnij się, że na początku badania usłyszysz pojedynczy sygnał dźwiękowy.</li>
	<li>W trakcie eksperymentu obserwuj informacje w czasie rzeczywistym na wyświetlaczu, takie jak natężenie promieniowania (irradiance) oraz pozostały czas.</li>
	<li>Nie otwieraj przednich drzwiczek ani nie zmieniaj żadnej konfiguracji podczas badania PDT.</li>
	<li>Po zakończeniu badania poczekaj na czterokrotny sygnał dźwiękowy i wygaśnięcie wszystkich diod LED przez system elektroniczny. Na wyświetlaczu pojawi się komunikat Finished oraz końcowa ilość zużytej energii — fluencja — z przebiegu eksperymentu. 
	UWAGA: Końcowa wartość fluencji jest obliczana zgodnie z równaniem (1): 
	<img alt="Równanie fluencji: F=I×s; schemat obliczania ekspozycji energetycznej w badaniach fotonicznych." src="/files/ftp_upload/64391/64391eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> (1) 
	Gdzie F odpowiada J/cm2, a I odpowiada mW/cm2 lub mJ/s·cm2. Wartość natężenia promieniowania uwzględnia moc diod LED (źródła emitującego) oraz jednorodnie naświetlaną powierzchnię komory ciemnej (660 cm2) (równanie [2]): 
	<img alt="Wzór na obliczanie natężenia promieniowania I=Moc/Powierzchnia naświetlana, równanie fizyki optycznej." src="/files/ftp_upload/64391/64391eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> (2) 
	Teoretyczna wartość natężenia promieniowania jest wyświetlana na ekranie urządzenia przez cały czas trwania badania PDT. Po zakończeniu operacji użyj równania (3), aby obliczyć fluencję: 
	Fluencja (F) = natężenie promieniowania (I, wartość stała) × czas operacji (s) (3)</li>
</ol>
4. Test żywotności komórek
<ol>
	<li>Po przeprowadzeniu testu PDT przykryć mikropłytkę, która była wystawiona na działanie światła, i inkubować przez 24 h.</li>
	<li>Po okresie inkubacji usunąć pożywkę z obu płytek, przemyć monowarstwę komórek PBS (100 µL) i dodać roztwór MTT (0,5 mg/ml, 100 µL). Inkubować obie płytki – w warunkach ciemności oraz naświetlonych – przez 4 h, aby umożliwić tworzenie się kryształów formazanu.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć roztwór MTT i rozpuścić fioletowe kryształy w roztworze DMSO/etanol (1:1).</li>
	<li>Po całkowitym rozpuszczeniu kryształów zmierzyć absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy 595 nm. 
	UWAGA: Urządzenie to można wykorzystać w innych istotnych eksperymentach, takich jak analiza śmierci komórkowej indukowanej przez ROS, wywołanej przez fotouczulacze po ekspozycji na światło, z wykorzystaniem cytometrii przepływowej30.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+agency+for+research+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cancer+Observatory%3A+Cancer+Today%22%5BJournal%5D)">International agency for research on cancer.</a> Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).</li>
<li>Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance+in+cancer%3A+role+of+Atp-dependent+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).</li>
<li>Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+multidrug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting multidrug resistance in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).</li>
<li>Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+photodetection+and+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The history of photodetection and photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).</li>
<li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+cancer%3A+what%27s+past+is+prologue%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).</li>
<li>Barr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contrasting+mechanisms+of+colonic+collagen+damage+between+photodynamic+therapy+and+thermal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury.</a> Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).</li>
<li>Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+A+compendium+of+latest+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews.</a> Cancers. 13 (17), 4447(2021).</li>
<li>Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+photodynamic+therapy+on+multidrug+resistant+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer.</a> Cancer Cell International. 19, 91(2019).</li>
<li>Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+photodynamic+therapy+in+overcoming+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).</li>
<li>Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoradiation+therapy.+II.+Cure+of+animal+tumors+with+hematoporphyrin+and+light%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light.</a> Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).</li>
<li>Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+HeLa+cell+cultures+by+using+LED+or+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).</li>
<li>Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+human+cervical+cancer+via+the+activation+of+microRNA-143+and+suppression+of+the+Bcl-2%2FBax+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).</li>
<li>Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+photodynamic+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer.</a> Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).</li>
<li>Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+photosensitizer+to+the+mitochondrion+enhances+the+potency+of+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy.</a> ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).</li>
<li>Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+treatment+with+benzoporphyrin+derivative+monoacid+ring+A+produces+protein+tyrosine+phosphorylation+events+and+DNA+fragmentation+in+murine+P815+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells.</a> Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).</li>
<li>Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+in+photodynamic+therapy%3A+part+two+-+cellular+signaling%2C+cell+metabolism+and+modes+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death.</a> Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+clinical+and+preclinical+photosensitizers+for+use+in+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).</li>
<li>Allison, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+oncologic+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: oncologic horizons.</a> Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).</li>
<li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+with+laser+scanning+mode+of+tumor+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Fibers+and+Their+Applications+2015%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation.</a> Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).</li>
<li>Huang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+clinical+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Technology+in+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A review of progress in clinical photodynamic therapy.</a> Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).</li>
<li>Chepurna, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LED-based+portable+light+source+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+in+Health+Care+and+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">LED-based portable light source for photodynamic therapy.</a> Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).</li>
<li>Hasson, O., Wishkerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CultureLED%3A+A+3D+printer-based+LED+illumination+cultivation+system+for+multi-well+culture+plates%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates.</a> HardwareX. 12, 00323(2022).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localised+light+delivery+on+melanoma+cells+using+optical+microneedles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles.</a> Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).</li>
<li>Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+diodes+in+photodynamic+therapy+in+non-melanoma+skin+cancers-own+observations+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+and+Laser+Therapy%22%5BJournal%5D)">Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review.</a> Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).</li>
<li>Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+light+emitting+diodes+in+the+photodynamic+therapy+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).</li>
<li>Lins, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+785-nm+laser+diode-based+system+for+standardization+of+cell+culture+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Photomedicine+and+Laser+Surgery%22%5BJournal%5D)">A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation.</a> Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).</li>
<li>Hopkins, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+cell+irradiation+protocol+for+testing+photopharmaceuticals+and+the+effect+of+blue%2C+green%2C+and+red+light+on+human+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).</li>
<li>Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+and+stable+LED+array+illumination+system+for+multiwell+plate+cell+culture+photodynamic+therapy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments.</a> Research Square. , 1-18 (2022).</li>
<li>Gálvez, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+evaluation+of+the+operational+characteristics+of+a+new+photodynamic+therapy+device%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719(2022).</li>
<li>Bretin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+activity+of+new+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer.</a> Cancers. 11 (10), 1474(2019).</li>
<li>T. SketchUp. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sketchup.com/">https://www.sketchup.com/</a> (2022).</li>
<li>LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/PhotoDynamicTherapy">https://github.com/PhotoDynamicTherapy</a> (2022).</li>
<li>W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB">https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB</a> (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Ostateczne urządzenie PhotoACT było wygodne do zbudowania z dostępnych na rynku, tanich komponentów za łączny koszt poniżej 50 USD. Dodatkowe zalety to niskie wymagania konserwacyjne, możliwość napromieniania wielu rodzajów płytek hodowlanych, jednoczesne stosowanie do czterech jednostek na test, niska waga (2 kg)/rozmiar (44 cm3), która umożliwia przenośność, dokładne i powtarzalne napromieniowanie (dane nie są pokazane) oraz przyjazny dla użytkownika i prosty interfejs konfiguracji, który nie wymaga połączen...

Wśród najbardziej śmiertelnych chorób niezakaźnych, rak stanowi główną globalną przyczynę przedwczesnych zgonów. W 2020 roku było to prawie 10 milionów zgonów, co stanowi około jeden na sześć zgonów na całym świecie1. Ponadto zjawisko oporności wielolekowej (MDR) stanowi ogromne zagrożenie dla zdrowia publicznego, ponieważ zatwierdzone protokoły chemioterapeutyczne nie osiągają etapów remisji w tym stanie klinicznym2. Komórki rakowe mogą rozwinąć oporność na chemioterapię poprzez kilka mechanizmów; jednak nadekspresja niektórych transporterów kasetowych wiążących ATP (ABC) - pomp wypływowych zależnych od ATP - jest uważana za główną przyczynę rozwoju MDR w mikrośrodowisku guza3. Oprócz MDR, inne powikłania nowotworowe, takie jak nawroty i przerzuty, wzmacniają pilną potrzebę opracowania i ulepszenia podejść terapeutycznych w celu przezwyciężenia tego wyzwania onkologicznego.
Lecznicze wykorzystanie światła jest praktykowane od wieków4, a terapia fotodynamiczna (PDT) reprezentuje klinicznie zatwierdzone podejście terapeutyczne dla guzów litych. PDT łączy w sobie podanie fotouczulacza (PS), a następnie naświetlanie światłem w celu wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS) w celu wywarcia selektywnej cytotoksyczności w komórkach nowotworowych. To podejście terapeutyczne jest lepsze od konwencjonalnych metod, w tym chirurgii, radioterapii i chemioterapii5; Jest to technika małoinwazyjna wykazująca niższą cytotoksyczność w tkankach łącznych<klasa SUP="xref">6. Lekka aplikacja i akumulacja PS bezpośrednio w guzie lub jego mikrośrodowisku zapewniają precyzyjne celowanie, a co za tym idzie, niewielkie, niepożądane ogólnoustrojowe skutki uboczne7 oraz możliwość powtórzenia leczenia w tym samym miejscu. Co więcej, koszt jest niższy niż w przypadku innych podejść. Ze względu na swoje obiecujące cechy, PDT może być uważana za odpowiednią opcję zarówno dla pojedynczego, zwłaszcza w przypadku guzów nieoperacyjnych, jak i uzupełniającego leczenia raka7, i stanowi alternatywę dla MDR związanego z chemioterapią8,9.
Pierwszy raport pokazujący wysoki wskaźnik obiektywnych odpowiedzi przy użyciu PDT został opisany w 1975 roku w modelu myszy i szczura10. Od tego czasu przeprowadzono badania z użyciem PDT z pozytywnymi wynikami7 zarówno in vivo, jak i in vitro z ludzkimi liniami komórek nowotworowych w hodowli komórkowej 2D11,12. Biorąc pod uwagę szerokie zastosowanie klinicznie zatwierdzonych PS, niezależnie od ich specyficznych szlaków akumulacji i zakresów długości fal pików absorpcyjnych, ogólny proces jest następujący: (i) wychwyt PS, (ii) szczyt stężenia PS w guzie lub jego mikrośrodowisku, (iii) zastosowanie światła, (iv) interakcja PS-światło, (v) transfer energii stanu wzbudzonego PS do substratu tkankowego lub otaczających cząsteczek tlenu, (vi) produkcja ROS z udziałem tlenu singletowego lub anionu ponadtlenkowego, (vii) śmierć komórek nowotworowych poprzez zasadniczo martwicę lub apoptozę (śmierć bezpośrednia), autofagię (mechanizm cytoprotekcyjny), niedokrwienie tkanek (uszkodzenie naczyń krwionośnych), modulację immunologiczną lub nakładanie się tych mechanizmów7. W tym końcowym etapie aktywacja określonego szlaku śmierci komórki zależy od wielu czynników, takich jak charakterystyka komórki, projekt eksperymentu i, co najważniejsze, lokalizacja wewnątrzkomórkowa PS i ukierunkowane uszkodzenie związane z PDT13.
Verteporfin to PS drugiej generacji, zatwierdzony przez agencje regulacyjne do użytku klinicznego w Norwegii i Chinach do leczenia zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem7. Po podaniu dawki doniesiono, że ten prolek częściowo gromadzi się w mitochondriach14 i indukuje fosforylację tyrozyny białek komórkowych i fragmentację DNA, prowadząc do apoptozy komórek nowotworowych15,16. Po 24 godzinach inkubacji w celu internalizacji werteporfiny zaleca się protokół PDT wykorzystujący konfigurację długości fali 690 nm w celu osiągnięcia efektywnych poziomów transferu promieniowania elektromagnetycznego do sąsiednich cząsteczek7,17.
Jeśli chodzi o źródło światła dla PDT, klasyczne systemy laserów diodowych są zazwyczaj drogie, skomplikowane technicznie, przewymiarowane, a tym samym nieprzenośne18,19. W związku z jego profilem pojedynczej długości fali, który można również zaobserwować w urządzeniach PDT opartych na diodach LED, zapotrzebowanie na niezależne jednostki dla każdego zastosowania fotosensybilizatora sprawia, że wykorzystanie systemów lasera diodowego jest jeszcze bardziej złożone i ekonomicznie niewykonalne20,21. Dlatego wykorzystanie maszyn LED jest uważane za najbardziej obiecującą alternatywę nie tylko w celu rozwiązania problemów związanych z kosztami22 i konserwacją, ale także w celu zapewnienia wysokiej mocy wyjściowej i mniej szkodliwych23 i szersze możliwości oświetlenia24,25,26,27.
Pomimo potencjalnego wkładu, jaki sprzęt oparty na diodach LED może zaoferować do eksperymentów PDT28, większość opcji komercyjnych nadal ma wady, takie jak brak przenośności, wysokie koszty oraz skomplikowane projekty budowlane i eksploatacja29. Głównym celem tych prac było zaoferowanie prostego i niezawodnego narzędzia do oznaczania PDT in vitro. W tym artykule opisano PhotoACT, wbudowane przez nas urządzenie PDT oparte na diodach LED, które jest niedrogie, przyjazne dla użytkownika i przenośne. Jako dowód słuszności koncepcji, wykazano, że urządzenie to zwiększa cytotoksyczność werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D, a zatem może być wykorzystywane jako narzędzie badawcze w eksperymentach PDT.

<table><tbody><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>Odczynnik do dysocjacji hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Flashforge</td><td></td><td>Finder model</td></tr><tr><td>96-dołkowe Niesterylne</td><td></td><td></td><td>, polistyrenowe i o wysokim poziomie wiązania płytki powierzchniowe z płaskim dnem używane do hodowli komórkowych 2D</td></tr><tr><td>Czujnik</td> jasności Arduino <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Model TSL2561 z poziomami detekcji 0,1-40,000+ luksów i interfejsem I2C Przyciski</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brzęczyk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby</td><td></td><td></td> do hodowli komórkowych <td>Sterylna, polistyrenowa, prostokątna kolba dolna z powierzchnią poddaną kulturom tkankowym (TC), pochyloną szyjką i nasadką odpowietrzającą (rozmiary)</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td> <td>wirówkoweSterylne, polipropylenowe probówki o pojemności 15/50 ml używane do rozcieńczania kultur komórkowych na etapie wysiewu testu</td></tr><tr><td>CO2 Płyta sterująca inkubatora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> projektowe <td>ESP32</td></tr><tr><td></td><td>Trimble</td><td></td><td>SketchUp</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) jest szeroko stosowanym podłożem podstawowym do wspomagania wzrostu wielu różnych komórek ssaków.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540-500ML</td><td>Dimetylosulfotlenek, &ge; 99,5% (GC), nadaje się do hodowli komórek roślinnych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12657029</td><td>FBS zapewnia najlepszą wartość, zapewniając spójność wzrostu komórek w czasie i przejściach.</td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td>Antybiotyk rozpuszczalny w wodzie, pierwotnie oczyszczony z grzyba&nbsp; Micromonospora purpurea. Gentamycyna działa poprzez zapobieganie zanieczyszczeniu kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td>Komora o wzorze Neubauera używana do zliczania komórek na etapie wysiewu testu</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop laboratoryjny</td><td>Leica</td><td></td><td>DM IL</td></tr><tr><td>LED Okap</td><td></td><td></td> z przepływem laminarnym <td>Kabina zaprojektowana w celu ochrony środowiska pracy przed zanieczyszczeniami poprzez utrzymanie stałego, jednokierunkowego przepływu powietrza przefiltrowanego przez HEPA nad pracą obszar. Stosowany na kilku etapach hodowli komórek i procedur zabiegowych</td></tr>: <tr><td>Wyświetlacz</td><td></td><td></td><td></td>LCD</tr><tr>,<td>model LED RGB WS2812</td><td></td><td></td><td>5050 RGB SMD z wbudowanym procesorem. Taśma z 30 diodami LED, długością 1 metra i mocą 9 W Płyty</td></tr><tr><td></td><td></td><td>pilśniowe MDF</td><td>Płyty pilśniowe o grubości 3 mm Płyty pilśniowe o średniej gęstości</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td> do mikrowirówek <td>Sterylne, polipropylenowe probówki z pokrywką zabezpieczającą o pojemności 1,5/2,0 mL. Wygodne narzędzia do manipulowania małymi objętościami na etapie obróbki testu Czytnik</td></tr><tr><td>mikropłytek</td><td>TermoFischer</td><td></td><td>Multiskan FC Fotometr mikropłytkowy przeznaczony do wykrywania szerokiego zakresu długości fal (340-850 nm). Sprzęt wykorzystano do oceny żywotności komórek po inkubacji MTT.</td></tr><tr><td>Odczynnik MTT</td><td>Invitrogen</td><td>M6494</td><td>bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium. Używany do testów żywotności komórek</td></tr><tr><td>Operational System</td><td>Real Time Engineers ltd.</td><td></td> Micripipet FreeRTOS <td></td></tr><tr><td>P10</td> Nieelektroniczny, jednokanałowy, 1-10 &mu;<td></td><td></td><td> </td></tr><tr>Mikropipeta <td></td><td></td><td>P1000</td> o pojemności L <td>Nieelektroniczna, jednokanałowa, 10-1000 &mu; </td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td></td><td></td> P200 o pojemności L <td>Nieelektroniczna, jednokanałowa, 20-200 &mu; L pojemność</td></tr><tr><td>Sprzęt PDT</td><td>LumaCare</td><td></td><td>Model LC-122</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Zrównoważona formuła soli stosowana do mycia komórek podczas hodowli i procedur testowych</td></tr><tr><td>Potencjometry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td><td></td><td></td><td>Niesterylne, uniwersalne dopasowanie, 10/200/1000 &mu; L maksymalne objętości</td></tr><tr><td>Verteporfin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0534-5MG</td><td>Verteporfin, &ge; 94% (HPLC)</td></tr></tbody></table>

zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2d

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

Ten artykuł opisuje nowatorskie, proste i tanie urządzenie do przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT), nazwane PhotoACT. Urządzenie zostało zbudowane przy użyciu zestawu konwencjonalnych programowalnych diod elektroluminescencyjnych (LED), modułu wyświetlacza ciekłokrystalicznego (LCD) oraz czujnika światła podłączonego do komercyjnej płytki mikrokontrolera. Pudełkowa konstrukcja prototypu została wykonana z płyt pilśniowych (MDF) o średniej gęstości. Wewnętrzna komora może jednocześnie przydzielić cztery mikropłytki wielodołkowe do hodowli komórkowych.
Jako dowód słuszności koncepcji, badaliśmy cytotoksyczne działanie werteporfiny fotosensybilizatora (PS) przeciwko linii komórkowej HeLa w dwuwymiarowej (2D) hodowli. Komórki HeLa traktowano zwiększonym stężeniem werteporfiny przez 24 godziny. Pożywkę supernatantową zawierającą lek odrzucono, przylegające komórki przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodano pożywkę wolną od leku. W tym badaniu badano wpływ werteporfiny na komórki bez ekspozycji na światło lub po ekspozycji na światło przez 1 godzinę przy użyciu wartości czerwono-zielono-niebieskich (RGB) wynoszących 255, 255 i 255 (średnia fluencja 49,1 ± 0,6 J/cm2). Po 24 godzinach żywotność komórek oceniano za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT).
Wyniki eksperymentalne pokazały, że ekspozycja komórek leczonych werteporfiną na światło z urządzenia wzmacnia cytotoksyczne działanie leku poprzez mechanizm, w którym pośredniczą reaktywne formy tlenu (ROS). Ponadto zastosowanie prototypu opisanego w tej pracy zostało zweryfikowane poprzez porównanie wyników z komercyjnym urządzeniem PDT. W związku z tym ten prototyp terapii fotodynamicznej opartej na diodach LED stanowi dobrą alternatywę dla badań in vitro PDT.

Końcowe urządzenie do PDT, nazwane PhotoACT, zawierało ciemną komorę przeznaczoną do umieszczenia do czterech wielodołkowych mikropłytek, której górna powierzchnia wewnętrzna została wyposażona w zestaw 30 rozproszonych diod LED zaprogramowanych do emitowania różnych widm światła widzialnego (Rysunek 3 oraz Plik uzupełniający 6). Urządzenie zbudowano z dwóch powiązanych obudów: wewnętrznej, zaprojektowanej jako ciemna komora do testów PDT, oraz zewnętrznej, która przykrywa k...

Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

Terapia fotodynamiczna, PDT, ma wiele zalet w leczeniu raka, a jej skuteczność zależy od źródła światła, które aktywuje fotouczulacz. Pomimo najnowszych postępów w tej dziedzinie, brakuje dostępu do drogiego i powtarzalnego urządzenia do PTD do modeli in vitro. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, w niniejszej pracy opisano nowatorskie, proste i tanie urządzenie do wykonywania testów PDT na kulturach komórkowych, nazwane PhotoAct.Aby rozpocząć budowę, przytnij płyty pilśniowe o średniej gęstości o grubości trzech milimetrów, MDF, aby uzyskać kawałki o następujących wymiarach. Zbuduj dwa pudełka o następujących wymiarach. Wywierć tył większego pudełka, aby zainstalować złącze podnośnika baryłkowego.Wywierć również górną część większej skrzynki, górę i dół mniejszej skrzynki, aby zapewnić przejście dla elektrycznych. Pomaluj wszystkie wewnętrzne powierzchnie czarnym tuszem, aby zapewnić jednorodne padanie światła. Przymocuj równolegle trzy taśmy LED po 10 diod LED każda na górnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka.Dodatkowo zainstaluj czujnik jasności na środku dolnej wewnętrznej powierzchni mniejszego pudełka. Wydrukuj strukturę jednostki sterującej za pomocą dodatkowego pliku do druku 3D. Zainstaluj wszystkie komponenty, przycisk zasilania, potencjometry, touchpad czasu startu, diody LED, czujnik jasności, wyświetlacz LCD, brzęczyk i zasilacz oraz części płytki kontrolera ESP-32 zamontowane we wnętrzu jednostki sterującej.Prześlij kod programowania dostępny w pliku uzupełniającym i uruchom test, aby sprawdzić, czy wszystkie połączenia działają. Zmontuj skrzynki i przymocuj je razem, aby uniknąć szczelin, a co za tym idzie zakłóceń oświetlenia zewnętrznego i natychmiastowej utraty światła. Przymocuj zamontowaną jednostkę sterującą do wywierconego obszaru w górnej części prototypu.Zbuduj drzwi wejściowe z tego samego materiału w następujących wymiarach i przymocuj je do pudełka zewnętrznego za pomocą zawiasów i taśm rzepowych, aby zapewnić zamknięcie komory i nieprzerwane testy. Zainstaluj również klamkę, aby z łatwością i precyzją manipulować drzwiami wejściowymi. Przymocuj cztery gumowe podkładki pod stopy na spodzie prototypu, aby zapewnić większą stabilność podczas operacji.Hoduj linię komórkową HeLa w zmodyfikowanym orzele Dulbecco o średniej niskiej glikemii z 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% gentamycyny. Utrzymuj kolby hodowlane na poziomie 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Zarządzaj i kontroluj hodowlę komórkową, aż osiągniesz 80 do 90% zbieżności.Rozpocznij protokół żywotności komórek od procesu wysiewu. Usunąć pożywkę z kolby z zlewającą się hodowlą komórek HeLa. Przemyć kolbę roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, PBS i odłączyć kulturę trypsyną, postępując zgodnie z zaznaczonymi szczegółami.Policz ponowne zawieszenie komórek za pomocą hemocytometru i umieść je na wielodołkowej mikropłytce o stężeniu 20 000 komórek na dołek. Przygotuj dwie płytki do ciemnych i jasnych warunków leczenia i inkubuj je przez 24 godziny do przyłączenia komórek. Aby kontynuować leczenie fotouczulaczem, usuń pożywkę z obu płytek i potraktuj komórki 100 mikrolitrami rosnących stężeń werteporfiny.Utrzymuj komórki w leczeniu przez 24 godziny, aby umożliwić internalizację werteporfiny. Po inkubacji usunąć zabieg, przemyć komórki PBS i dodać pożywkę wolną od leków. Przykryj jedną mikropłytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed ekspozycją na światło i inkubuj przez 24 godziny.Ta mikropłytka dostarczy danych kontrolnych do dalszej analizy wyników PDT. Druga mikropłytka zostanie wykorzystana w warunkach ekspozycji na światło w PhotoAct. Aby obsługiwać urządzenie, podłącz je do gniazdka i włącz, naciskając przycisk zasilania.Umieść mikropłytkę wielodołkową w komorze PDT i zamknij urządzenie, mocując przednie drzwiczki bocznymi taśmami rzepowymi. Aby skonfigurować sprzęt, użyj potencjometrów, aby dostosować konfigurację RGB emisji światła. Naciśnij panel dotykowy plus/minus, aby dostosować konfigurację czasu i ustawić czas trwania testu.Sprawdź, czy na wyświetlaczu pojawiają się prawidłowe informacje o teście i w razie potrzeby dokonaj ostatecznych korekt. Naciśnij początkowy panel dotykowy, aby rozpocząć test. Na początku eksperymentu musi być słyszalny brzęczyk z jednym sygnałem dźwiękowym.Podczas eksperymentu na wyświetlaczu można obserwować informacje o postępie, takie jak natężenie promieniowania i pozostały czas. Nie otwieraj drzwi wejściowych ani nie zmieniaj żadnej konfiguracji podczas testu PDT. Pod koniec testu musi być słyszalny brzęczyk z czterema sygnałami dźwiękowymi, a system elektroniczny wyłączy wszystkie diody LED.Na wyświetlaczu można zaobserwować gotową wiadomość i końcową ilość energii rozprężonej podczas eksperymentu. Końcowa wartość fluencji jest obliczana zgodnie z podświetlonym równaniem. Przykryj mikropłytkę, która została wystawiona na działanie światła i kontynuuj 24-godzinną inkubację.Po okresie inkubacji usunąć pożywkę z obu płytek, przemyć monowarstwę komórek PBS i dodać roztwór MTT. Inkubuj obie płytki w ciemnościach i jasności przez cztery godziny, aby umożliwić tworzenie się kryształów formazanu. Ostrożnie usuń roztwór MTT i rozpuść fioletowe kryształy w roztworze DMSO i etanolu.Po całkowitym rozpuszczeniu kryształów przeprowadzić pomiar absorbancji za pomocą czytnika mikropłytek o długości 595 nanometrów. Produkt końcowy składa się z ciemnej komory, której górna powierzchnia wewnętrzna wyposażona jest w zestaw 30 diod elektroluminescencyjnych światła rozproszonego, diod LED, zaprogramowanych tak, aby emitować wyraźne widma światła widzialnego. Jednorodne padanie światła uzyskuje się dzięki niskiemu współczynnikowi odbicia powierzchni wewnętrznych i równomiernemu rozkładowi konfiguracji diod LED.Interfejs konfiguracji jest przyjazny dla użytkownika, a ustalony warunek eksperymentu był powtarzalny. Jako dowód słuszności koncepcji, urządzenie wykorzystano do wzmocnienia cytotoksycznego działania werteporfiny w hodowli komórkowej 2D HeLa po ekspozycji na światło. Jak pokazano na rysunku, wartość GI50 wynosiła 3,1 mikromola dla warunków oświetleniowych.i 13,8 mikromola dla ciemnych warunków Dlatego ponad czterokrotny wzrost skuteczności w porównaniu z warunkami potwierdza zastosowanie Verteporfin jako fotouczulacza i możliwość zastosowania PhotoAct w testach PDT. Aby zweryfikować zastosowanie prototypu opisanego w tej pracy, użyto komercyjnego urządzenia PDT w tych samych warunkach eksperymentalnych, w tym fotosensybilizatora, komórek i fluencji, a wyniki porównano. Jak pokazano na rysunku, oba urządzenia fotoaktywowały werteporfinę w równym stopniu, wzmacniając efekt cytotoksyczny.Wreszcie, śmierć komórki, w której pośredniczy ROS, wywołana przez werteporfinę po ekspozycji na światło, została potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu testu DCFDA. Podsumowując, urządzenie zostało łatwo zbudowane z dostępnych na rynku tanich komponentów o łącznym koszcie poniżej 50 sztuk. Główną inną zaletą urządzenia jest przenośność, niskie wymagania konserwacyjne, zdolność do napromieniania wielu rodzajów płytek hodowlanych, jednoczesne stosowanie do czterech jednostek na test, dokładne i powtarzalne napromienianie, przyjazny dla użytkownika i prosty interfejs konfiguracji, który nie wymaga połączenia z komputerami lub innymi maszynami.Ponadto prezentowany jest schemat blokowy decyzji, aby zapewnić systematyczne podejście do rozwiązywania problemów w celu znalezienia i skorygowania problemów lub błędów podczas operacji. Odkrycia te pozwalają rozszerzyć korzyści płynące z PhotoAct w celu ułatwienia PDT na badania naukowe, badając mechanizm działania fotouczulaczy i ich zastosowania kliniczne.

an-house-built-light-emitting-diode-based-photodynamic-therapy-device

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę selektywnego usuwania określonych komórek z mieszanej hodowli komórek 3D za pomocą fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni. W tej metodzie docelowe komórki są dokładnie identyfikowane za pomocą przeciwciała sprzężonego z fotoabsorberem NIR. Późniejsze naświetlanie światłem podczerwonym indukuje śmierć komórki, skutecznie eliminując docelowe komórki z hodowli 3D.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni do celowanej eliminacji komórek w mieszanych kulturach 3D

Opisany tutaj protokół pozwala na ocenę skuteczności terapii fotodynamicznej (PDT) w liniach komórkowych i optymalizację ustawień PDT przed zastosowaniem terapii na modelach zwierzęcych.

Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Ten protokół opisuje metodę wytwarzania przewodzących nanocząstek polimerowych zmieszanych z fulerenem. Nanocząstki te zostały zbadane pod kątem ich potencjalnego zastosowania jako fotouczulacze nowej generacji w terapii fotodynamicznej (PDT).

Terapia fotodynamiczna z mieszanymi fotouczulaczami z przewodzącego polimeru / fulerenu

Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, jednak istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D z wykorzystaniem fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT).

Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie zastosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy. Przedstawiamy protokół PDT in vitro przeznaczony do symulacji PDT, który może być wykorzystany do badania różnic w inkubacji PS i parametrach leczenia światłem.

Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.

Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Manuskrypt ten przedstawia nowatorskie, innowacyjne urządzenie oświetleniowe wydrukowane w 3D do badania terapii fotodynamicznej za pośrednictwem Rose Bengal in vitro.

Opracowanie innowacyjnego urządzenia oświetleniowego opartego na diodach LED do zastosowania terapii fotodynamicznej in vitro z użyciem róży bengalskiej

Poznaj metodę budowy taniego urządzenia PhotoAct do terapii fotodynamicznej w hodowlach komórkowych HeLa. To rozwiązanie umożliwia badaczom dostęp do technologii PDT w badaniach nad rakiem.

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D (Wideo) | JoVE Journal

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

Przeglądaj więcej filmów