Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans
13 września 2022
Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.
Protokół ten opisuje, jak hodować robaki i kompostować mikrokosmosy, umożliwiając eksplorację interakcji gospodarz-mikrobiom w naturalnym kontekście. Metoda ta stanowi alternatywę dla izolowania dzikich robaków od natury lub wykorzystywania syntetycznych zbiorowisk drobnoustrojów o ograniczonej różnorodności mikrobiologicznej. Ten protokół jest prosty i może być wykonany w dowolnym laboratorium, a nawet jest odpowiedni dla początkujących.
Na początek zdobądź kompost lub ziemię ogrodową z dowolnego dogodnego źródła i przechowuj ją w laboratorium w standardowym plastikowym pojemniku kuchennym z otworami wyciętymi w pokrywie w celu napowietrzenia. Zatkaj otwory watą, aby nie dopuścić do przedostania się muszek owocowych i innych bezkręgowców. Wzbogać kompost lub glebę posiekanymi produktami lub mieszanką różnych produktów w glebie, aby uzyskać stosunek dwa do jednego masy.
Mieszaj kompost raz dziennie i dodawaj podłoże M9 w razie potrzeby, aby utrzymać wilgoć bez powodowania błota. Dla każdego mikrokosmosu dodaj 10 gramów wzbogaconego kompostu do 30-mililitrowej szklanej zlewki pokrytej folią aluminiową. Dodaj 30 gramów wzbogaconego kompostu do każdej 50-mililitrowej tubki.
Napełnij rurkę M9 i wiruj. Odwirować probówki o sile 560 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety serologicznej usunąć supernatanty bez naruszania osadu i połączyć je w nowej probówce o pojemności 50 mililitrów.
Zagęścić ekstrakt bakteryjny, odwirowując probówkę z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zawieś granulki w wystarczającej ilości M9, aby mieć 200 mikrolitrów na każdy mikrokosmos i 200 mikrolitrów na płytkę, która posłuży jako widoczny wskaźnik zastępczy dla mikrokosmosów. Dodaj 200 mikrolitrów skoncentrowanego ekstraktu mikrobiologicznego do autoklawizowanej zlewki kompostowej i widocznej płytki proxy NGM.
Dodaj od 500 do 1000 larw L1 do każdego mikrokosmosu i płytki zastępczej. Wyłóż cylindryczną rurę PVC bibułą. Ten cylinder powinien mieć jednomilimetrową nylonową siatkę przyklejoną na dole w lejku.
Umieścić cylinder w lejku Baermanna, umieszczając go w kolbie. Dodaj 20 mililitrów M9 do mikrokosmosu robaków. Wymieszać mieszaninę, a następnie przelać mieszaninę ze zlewki do cylindra wyłożonego bibułką w układzie lejkowym Baermann.
Całkowicie zanurz kompost w lejku, dodając więcej M9. Odpiąć zacisk, aby uwolnić filtrat zawierający zebrane robaki do 50-mililitrowej probówki. Następnie należy zagęścić robaki, odwirowując probówkę o sile 560 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz te kroki i wyciągnij filtraty z różnych rund, jeśli chcesz uzyskać więcej robaków.
Usunąć supernatant pipetą serologiczną, pozostawiając 15 mililitrów w probówce. Przenieś pozostały płyn do 15-mililitrowej probówki i ponownie wiruj przez jedną minutę, aby jeszcze bardziej zagęścić robaki. Usunąć 14 mililitrów supernatantu za pomocą pipety serologicznej.
Jednocześnie zbierz jeden gram pozostałej mikrokosmicznej gleby do 1,5-mililitrowej probówki, przetwarzając próbki gleby zawierające środowiskową społeczność bakteryjną, jak opisano w manuskrypcie. Przenieś jeden mililitr skoncentrowanych zebranych robaków do 1,5 mililitrowej probówki za pomocą szklanej pipety. Inkubować przez dwie minuty, aby robaki osiadły na dnie probówki.
Usunąć supernatant, pozostawiając 100 mikrolitrów osadu w spokoju na dnie probówki. Umyj granulat 1,5 mililitra M9 plus Triton X, pozwalając robakom za każdym razem osiąść na dnie. Przenieś umyte robaki w objętości 100 mikrolitrów do nowej 1,5 mililitrowej probówki za pomocą szklanej pipety.
Aby sparaliżować robaki, dodaj 100 mikrolitrów 25-milimolowego chlorowodorku lewamizolu i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 200 mikrolitrów 4% roztworu wybielacza i inkubuj przez dwie minuty. Usuń supernatant, pozostawiając nienaruszone 150 mikrolitrów na dole, a następnie trzykrotnie umyj granulkę robaka M9 plus Triton X. Te wysterylizowane powierzchniowo robaki mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia i mogą być używane później do dalszych zastosowań.
Porównanie mikrobiomów jelitowych robaków i społeczności środowiskowych przy użyciu podstawowej analizy współrzędnych opartej na nieważonej lub ważonej odległości UniFrac wykazało wyraźne grupowanie mikrobiomów jelitowych robaków z dala od tych w ich odpowiednich środowiskach. Podczas gdy podstawowa analiza współrzędnych oparta na nieważonych odległościach UniFrac nie rozróżniała mikrobiomów glebowych i robaków, grupowanie oparte na odległościach ważonych ujawniło wyraźne oddzielenie mikrobiomów jelitowych i kompostowych. W tym badaniu robaki hodowane w mikrokosmosach kompostu zostały wykorzystane do sekwencjonowania 16S, ale mogą być również wykorzystane do przetestowania wpływu różnych mikrobiomów środowiskowych na odporność gospodarza na niekorzystne warunki.
Alternatywnie, nowe taksony bakteryjne można wyizolować z robaków zebranych z mikrokosmosów kompostu w celu rozszerzenia znanej różnorodności taksonomicznej i funkcjonalnej komensali jelitowych robaków. Po jego opracowaniu, projekt Microcosms Pipeline ułatwił ocenę wpływu czynników genetycznych środowiska i gospodarza w kształtowanie mikrobiomu jelitowego.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje interakcje między gospodarzem a mikrobiomem z wykorzystaniem mikrokosmosów kompostowych u Caenorhabditis elegans, dostarczając laboratoryjnej metody badania zależności między środowiskową różnorodnością drobnoustrojów a mikrobiomem jelitowym nicieni. Metoda ta umożliwia stworzenie warunków zbliżonych do naturalnych bez konieczności izolowania dzikich nicieni lub polegania na ograniczonych społecznościach syntetycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Badania nad mikrobiomem
- Interakcje gospodarz-mikrob
- Środowiskowa różnorodność mikrobiologiczna
Wprowadzenie
- Naturalne społeczności drobnoustrojów są złożone i zróżnicowane.
- Wcześniejsze metody nie zapewniały wierności ekologicznej.
- Niniejszy protokół wykorzystuje kompost, aby ściśle naśladować warunki naturalne.
Zastosowane metody
- Tworzenie mikrokosmosów kompostowych w warunkach laboratoryjnych
- Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako organizmu modelowego
- Sekwencjonowanie 16S i analiza głównych współrzędnych
Główne wyniki
- Wyraźne różnice w klastrowaniu mikrobiomów jelitowych nicieni w stosunku do społeczności środowiskowych
- Wykazanie wpływu czynników środowiskowych w porównaniu z czynnikami genetycznymi gospodarza na skład mikrobiomu jelitowego
- Umożliwienie izolacji nowych taksonów bakteryjnych z nicieni
Wnioski
- Badanie pokazuje, w jaki sposób mikrokosmosy kompostowe mogą usprawnić badania nad mikrobiomem w warunkach laboratoryjnych.
- Podkreśla ono znaczenie kontekstu środowiskowego w kształtowaniu różnorodności mikrobiomu, co ma istotne znaczenie dla przyszłych badań nad odpornością gospodarza i zdrowiem jelit.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Mikrokosmosy kompostowe umożliwiają laboratoryjne modelowanie interakcji między gospodarzem a mikrobiomem u Caenorhabditis elegans, stanowiąc skalowalną alternatywę dla pobierania próbek z terenu lub tworzenia społeczności syntetycznych. Podejście to wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka oraz zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad mikrobiomem dzięki odwzorowaniu naturalnej różnorodności mikrobiologicznej. Metoda ta usprawnia wczesne etapy odkryć oraz zapewnia ciągłość translacyjną dla portfeli badawczo-rozwojowych ukierunkowanych na mikrobiom.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie molekularnych mechanizmów interakcji między gospodarzem a mikrobiomem w kontekście zbliżonym do naturalnego.
- Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie wpływów środowiskowych i genetycznych na kształtowanie się mikrobiomu jelitowego.
- Zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji gatunkowo specyficznych rdzeni mikrobiomu.
- Pozwala na walidację funkcjonalnych celów w fenotypach zależnych od mikrobiomu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, zróżnicowane mikrobiologicznie układy do dalszych analiz funkcjonalnych.
- Umożliwia powtarzalne i ilościowe porównanie mikrobiomów jelitowych oraz środowiskowych z wykorzystaniem sekwencjonowania 16S i analizy głównych współrzędnych.
- Wspiera standaryzację testów służących do oceny oporności gospodarza na mikrobiomy środowiskowe.
- Zapewnia platformę do skalowalnego przesiewu wpływu drobnoustrojów na fenotypy gospodarza.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli laboratoryjnych do ekspozycji środowiskowych istotnych dla danej choroby w celu translacyjnego odkrywania biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację interwencji w mikrobiomie.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnienie wkładu czynników środowiskowych w stosunku do genetycznych.
- Rozszerza znaną różnorodność taksonomiczną i funkcjonalną komensali jelitowych na potrzeby badań przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz walidację funkcjonalną w kontekstach mikrobiomu zbliżonych do naturalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez mechanistycznych dotyczących interakcji między gospodarzem a mikrobiomem oraz ograniczanie ryzyka środowiskowego.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty mikrobiomu do analizy porównawczej.
- Analityka: Dostarcza analizę głównych współrzędnych oraz grupowanie w oparciu o UniFrac w celu rozróżnienia społeczności jelitowych i środowiskowych.
- Badania translacyjne: Łączy ekspozycje laboratoryjne i naturalne w celu dopasowania biomarkerów i oceny interwencji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, skalowalną platformę dla różnorodnych zastosowań w badaniach nad mikrobiomem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mikrobiomem.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje modelowanie mikrobiomu w warunkach zbliżonych do naturalnych do użytku w wielu zespołach.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie wpływu czynników środowiskowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów ukierunkowanych na mikrobiom z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w analizie mikrobiomu oraz w pracy z C. elegans.
- Konieczny jest dostęp do infrastruktury sekwencjonowania 16S oraz analizy głównych współrzędnych (PCoA).
- Wymagana jest standaryzacja przygotowania kompostu i wzbogacania mikrobiologicznego pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do różnych systemów modelowych środowiskowych i genetycznych.
- Wyniki zależą od powtarzalności źródeł kompostu i zarządzania różnorodnością mikrobiologiczną.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Preparation of Compost
1:20
Preparation of Compost Microcosms and Raising Worms in Compost Microcosms
2:39
Preparing a Baermann Funnel, Harvesting Worms from Microcosms, and Collecting the Respective Soil Samples
4:17
Washing and Surface Sterilization of the Harvested Worms
5:43
Results: Comparisons of Worm Gut Microbiomes and Environmental Communities
6:26
Conclusion
