Name: Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę mikrokosmów kompostowych do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala na badanie interakcji gospodarz-mikrobiom w warunkach zbliżonych do naturalnych, oferując alternatywę dla izolacji dzikich robaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca opisana w tym manuskrypcie była wspierana przez granty NIH R01OD024780 a R01AG061302. K.T. był dodatkowo wspierany przez Letnie Stypendium Badawcze Studiów Licencjackich z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley, ufundowane przez Fundację Rose Hills. Projekty kreskówek na rysunku 1 uzyskano z BioRender.com.

1. Przygotowanie kompostu
<ol>
	<li>Pozyskać kompost lub ziemię ogrodową z dowolnego dostępnego źródła i przechowywać w laboratorium w standardowym plastikowym pojemniku kuchennym z otworami w pokrywie, aby zapewnić dopływ powietrza. Otwory należy zatkać watą, aby zapobiec dostawaniu się muszek owocówek i innych bezkręgowców (Rysunek 1A). 
	UWAGA: Pięćset gramów ziemi (mieszczące się w pojemniku o pojemności 1,5 galona, wymiary: 30 cm x 20 cm x 10 cm) zapewni wystarczającą ilość materiału do 12 mikrokosmosów.</li>
	<li>Wzbogacić kompost lub ziemię posiekanymi produktami roślinnymi lub ich mieszanką w stosunku masowym produktów do ziemi 1:2.</li>
	<li>Inkubować przez 7-14 dni w temperaturze 20-25 °C, mieszając raz dziennie i dodając pożywkę M9 w razie potrzeby, aby utrzymać wilgotność bez doprowadzenia do powstania błota. 
	UWAGA: Ziemie niewzbogacone produktami roślinnymi zazwyczaj nie wspierają wzrostu C. elegans; wybór konkretnych produktów roślinnych zależy od badacza, przy czym wiele rodzajów i mieszanek pozwala na wzrost nicieni. Wzbogacanie różnymi produktami roślinnymi będzie w różny sposób promować dywersyfikację społeczności bakteryjnych, co umożliwi badanie formowania się mikrobiomu jelitowego z różnych punktów wyjścia (patrz sekcja dyskusji).</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrokosmosów kompostowych
<ol>
	<li>Do każdego mikrokosmosu dodaj 10 g wzbogaconego kompostu do zlewki szklanej o pojemności 30 mL przykrytej folią aluminiową, a następnie poddaj autoklawowaniu (Rycina 1B).</li>
	<li>Aby przygotować ekstrakt mikrobiologiczny do uzupełnienia autoklawowanego kompostu, zacznij od dodania 30 g tego samego kompostu, którego użyto w kroku 2.1, do każdej z trzech probówek o pojemności 50 mL i wypełnij je pożywką M9. Mieszaj w wstrząsarku typu vortex przez 1 min (Rycina 1C). 
	UWAGA: Powinno to zapewnić wystarczającą ilość bakterii dla dziewięciu mikrokosmosów, z których każdy umożliwi rozwój setek nicieni.</li>
	<li>Odwiruj zawartość probówek w wirówce z prędkością 560 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Uważając, aby nie naruszyć osadu, usuń nadsącz za pomocą pipety serologicznej i przelej go do nowej probówki o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Skoncentruj ekstrakt bakteryjny poprzez wirowanie z maksymalną prędkością (2,000 × g) przez 15 min w RT. Resuspenduj osad w takiej ilości M9, aby uzyskać 200 µL dla każdego mikrokosmosu oraz dodatkowe 200 µL do dodania na płytkę, która będzie służyć jako widoczny wskaźnik rozwoju nicieni wewnątrz mikrokosmosów. 
	UWAGA: Na przykład dla dziewięciu mikrokosmosów resuspenduj osad mikrobiologiczny w 2 mL M9.</li>
	<li>Dodaj 200 µL skoncentrowanego ekstraktu mikrobiologicznego do każdej zlewki z autoklawowanym kompostem, a także na płytkę NGM, która będzie służyć jako płytka wskaźnikowa.</li>
	<li>Inkubuj mikrokosmosy i płytkę wskaźnikową przez 24 h w temperaturze 20-25 °C przed dodaniem nicieni.</li>
</ol>
3. Hodowla nicieni w mikrokosmosach kompostowych
<ol>
	<li>Do każdego mikrokosmosu oraz na płytkę zastępczą (krok 2.7) dodaj 500-1000 jaj lub larw L13, aby rozpocząć eksperyment (Rysunek 1D). 
	UWAGA: W opisanych tutaj eksperymentach wykorzystano nicienie N2 typu dzikiego. Można jednak użyć innych szczepów C. elegans (a potencjalnie innych nicieni).</li>
	<li>Hoduj nicienie do osiągnięcia wieku dorosłego w temperaturze 20 °C (zazwyczaj przez 3 dni).</li>
</ol>
<img alt="Proces kompostowania i metoda hodowli dżdżownic; obejmuje mikrokosmos oraz etapy zbioru lejkami Baermanna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64393/64393fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie mikrokosmosów kompostowych, hodowla i zbiór dżdżownic. (A) Wzbogacenie lokalnej gleby lub kompostu produktami roślinnymi i inkubacja przez 2 tygodnie. Połączenie (B) autoklawowanej wzbogaconej gleby z (C) ekstraktem mikrobiologicznym i (D) inkubacja przez co najmniej 24 h przed dodaniem zsynchronizowanych dżdżownic w stadium L1 do mikrokosmosów w celu rozpoczęcia eksperymentu. (E, F) W momencie zbioru, dodanie kompostu z mikrokosmosu do cylindra wspierającego w lejku Baermanna i zalanie medium M9. (G) Po 15 min, zlanie filtratu do probówki 50 mL. Skróty: sup. = supernatant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/64393fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Przygotowanie lejka Baermanna do pozyskiwania nicieni
<ol>
	<li>Zmontuj lejek Baermanna, mocując 5-8 cm sztywnej gumowej rurki do końcówki plastikowego lejka.</li>
	<li>Nasuń zacisk na rurkę i szczelnie ją zamknij.</li>
	<li>Umieść w lejku cylindryczną rurkę z PVC o długości 7 cm i średnicy 5 cm, z przyklejoną u dołu nylonową siatką o oczkach 1 mm (Rycina 1E). Wyłóż wnętrze cylindra dwoma arkuszami papieru chłonnego.</li>
	<li>Umieść lejek Baermanna w kolbie (Rycina 1F).</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie dżdżownic z mikrokosmosów i pobieranie odpowiednich próbek gleby
<ol>
	<li>Do mikrokosmosu, w którym hodowano nicienie, dodaj 20 mL M9, wymieszaj zawiesinę, a następnie przelej ją z zlewki do wyłożonego ręcznikiem papierowym cylindra w układzie lejka Baermanna. Dodaj więcej M9, aby całkowicie zanurzyć kompost w lejku. 
	UWAGA: Populacje C. elegans (N2) osiągają stadium dorosłe w mikrokosmosach z kompostu w tempie zbliżonym do tego na standardowych płytkach agarowych z zasiań Escherichia coli. Aby zwiększyć dokładność zbierania nicieni na konkretnym etapie rozwojowym, należy odnieść się do płytki kontrolnej z kroku 3.3.</li>
	<li>Po 30 min odkręć zacisk, aby zebrać filtrat zawierający odizolowane nicienie do probówki 50 mL (Rysunek 1G).</li>
	<li>Do cylindra dodaj więcej M9 i powtórz procedurę w drugiej rundzie, aby zebrać więcej nicieni, a następnie jeszcze raz, jeśli wymagana jest większa liczba osobników. 
	UWAGA: Podczas powtarzania rund zbierania należy uważać, aby nie uszkodzić ręcznika papierowego, co mogłoby doprowadzić do przedostania się cząsteczek gleby. Maksymalnie cztery rundy zbioru powinny pozwolić na wyizolowanie co najmniej 50% nicieni pierwotnie wprowadzonych do mikrokosmosu bez naruszania integralności ręcznika papierowego.</li>
	<li>Skoncentruj nicienie poprzez wirowanie przy 560 × g przez 2 min (RT). Za pomocą pipety serologicznej usuń 35 mL supernatantu.</li>
	<li>Przenieś pozostałe 15 mL do probówki 15 mL i ponownie wiruj przy 560 × g przez 1 min, aby dodatkowo skoncentrować nicienie. Za pomocą pipety serologicznej usuń 14 mL supernatantu.</li>
	<li>Równolegle pobierz 1 g pozostałej gleby z mikrokosmosu do probówki 1.5 mL. Próbki gleby zawierające środowiskową społeczność bakterii należy przetworzyć natychmiast lub przechowywać w −20 °C do późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych, zgodnie z opisem poniżej dla próbek nicieni.</li>
</ol>
6. Płukanie i sterylizacja powierzchni zebranych nicieni
<ol>
	<li>Przenieś 1 mL skoncentrowanych, zebranych nicieni z kroku 5.5 do probówki 1,5 mL za pomocą szklanej pipety. Inkubuj przez 2 min, aby nicienie osiadły na dnie probówki. Usuń nadsącz, pozostawiając nienaruszone dolne 100 µL.</li>
	<li>Przemyj 6x za pomocą 1,5 mL buforu M9+T (0,025% Triton-X w M9), pozwalając nicieniom osiadać na dnie po każdym razie.</li>
	<li>Przenieś przemyte nicienie w objętości 100 µL do nowej probówki 1,5 mL za pomocą szklanej pipety. 
	UWAGA: Na tym etapie protokołu od pierwszego przemycia (krok 6.2) powinno upłynąć około 30 min. Zaleca się, aby nicienie pozostały bez pożywienia przez co najmniej 1 h przed dodaniem lewamisolu, co umożliwi wydalenie przejściowych bakterii i pełne strawienie bakterii pokarmowych.</li>
	<li>Dodaj 100 µL 25 mM chlorowodorku lewamisolu, aby sparaliżować nicienie. Inkubuj przez 5 min w RT.</li>
	<li>Dodaj 200 µL 4% roztworu wybielacza. Inkubuj przez 2 min.</li>
	<li>Usuń nadsącz, pozostawiając nienaruszone najniższe 150 µL, a następnie przemyj 3x buforem M9+T, jak opisano powyżej. 
	UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek, zaleca się stosowanie filtrowanego buforu M9+T (przez filtr 0,2 µm) oraz noszenie rękawiczek od tego momentu.</li>
	<li>Po przemyciach pobierz 50 µL z pozostałych 150 µL z ostatniego płukania i wysiej na płytkę LB, inkubując w 25 °C przez 48 h, aby potwierdzić skuteczne usunięcie zewnętrznych bakterii. 
	UWAGA: Obserwacja do 30 kolonii w ostatnim płukaniu (co odpowiada łącznie 60 zewnętrznych komórek bakteryjnych pozostałych w próbce) jest dopuszczalna i spodziewa się, że będzie miała jedynie marginalny wpływ na analizowany skład mikrobiomu, biorąc pod uwagę tysiące bakterii, które zazwyczaj kolonizują każdego dorosłego nicienia15. W przypadku zaobserwowania większej liczby, integralność próbki może być naruszona.</li>
	<li>Użyj sterylizowanych powierzchniowo nicieni niezwłocznie (np. do ekstrakcji żywych bakterii w celu hodowli [liczenie CFU]) lub przechowuj w −20 °C do późniejszej ekstrakcji kwasów nukleinowych.</li>
</ol>
7. Izolacja DNA
UWAGA: Poniższe kroki opisują ekstrakcję DNA z zebranych nicieni przy użyciu komercyjnego zestawu przeznaczonego do ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z gleby (patrz Tabela materiałów), z modyfikacjami opisanymi poniżej, mającymi na celu ułatwienie ekstrakcji mikrobiologicznego DNA z nicieni.
<ol>
	<li>Przenieś próbkę zawierającą wysterylizowane powierzchniowo nicienie (w razie potrzeby rozmroź w temperaturze pokojowej) do probówek dołączonych do zestawu, zastępując dostarczone szklane kuleczki około 30-50 kuleczkami z cyrkonu o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Obserwowane wydajności DNA są wyższe przy użyciu kuleczek z cyrkonu niż przy szklanych kuleczkach dołączonych do zestawu. Choć przyczyna tego zjawiska pozostaje nieustalona, kuleczki z cyrkonu mogą skuteczniej rozrywać kutykulę nicieni, uwalniając więcej bakterii.</li>
	<li>W przypadku próbek kompostu dodaj około 250 mg zebranej gleby do probówek z zestawu, nie zastępując szklanych kuleczek.</li>
	<li>Po dodaniu do wszystkich próbek roztworu buforu dołączonego do zestawu, homogenizuj je za pomocą homogenizatora elektrycznego w temperaturze pokojowej (patrz Tabela materiałów) w dwóch cyklach przy 2 000 rpm przez 30 s każdy, z 30-sekundową przerwą pomiędzy nimi.</li>
	<li>Wykonaj pozostałe etapy oczyszczania DNA zgodnie z protokołem zestawu. Eluuj próbki z nicieni w ilości nie przekraczającej 50 µL buforu do eluowania, aby zapewnić stężenia DNA wystarczająco wysokie do sekwencjonowania.</li>
</ol>

<ol><li>Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbiota+interactions+in+Caenorhabditis+elegans+and+their+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance.</a> Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 285(2017).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 7-8 (2006).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li>
<li>Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2%2FBMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10, 604(2019).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li>
<li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Gateway+to+a+new+host-microbiome+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38(2016).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-specific+functional+significance+of+Caenorhabditis+gut+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1622(2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li>
<li>Slowinski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+a+complex+microbiota+mediate+a+trade-off+between+the+host+development+rate+and+heat+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance.</a> Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).</li>
<li>Pérez-Carrascal, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+preference+of+beneficial+commensals+in+a+microbially-diverse+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343(2022).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project%3A+Improved+data+processing+and+web-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).</li>
<li>McMurdie, P. J., Holmes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((phyloseq%3A+An+R+package+for+reproducible+interactive+analysis+and+graphics+of+microbiome+census+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data.</a> PLoS One. 8 (4), 61217(2013).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do dyspozycji oświadczeń o konflikcie interesów, które miałyby związek z treścią niniejszego artykułu.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę badania mikrobiomu jelitowego nicieni hodowanych w naturalnym środowisku, oferując alternatywne podejście do izolacji robaków od natury lub do hodowania ich w syntetycznych społecznościach.
Tysiące potencjalnych gatunków bakterii schwytanych w reprezentatywnym eksperymencie mikrokosmicznym odzwierciedlają różnorodność mikrobiologiczną, z którą wyewoluowały robaki, i pokazują zdolność rurociągu mikrokosmicznego do łączenia zalet pracy z modelowym organizmem gospodarza i zalet pracy z naturalnymi, zróżnicowanymi społecznościami mikroorganizmów.
Reprezentatywne wyniki pokazują, że wzbogacenie wspólnej gleby w różne rodzaje produktów moduluje różnorodność mikrobiologiczną środowiska, podkreślając zakres różnorodności mikrobiologicznej dostępnej do eksploracji przy użyciu tego rurociągu. Wybór produktów nie jest szczególnie ważny. W poprzednich pracach wykorzystano banany, jabłka, pomarańcze, truskawki, liście zielonej herbaty i ziemniaki do wzbogacenia gleby, co dało podobną wydajność hodowli robaków. Skutecznie wykorzystano również produkty mieszane. Kluczową cechą jest to, że różne produkty będą różnicować daną glebę na różne sposoby.
Pomimo dużej różnorodności mikrobiologicznej w środowisku, mikrobiomy jelitowe robaków różnią się znacznie mniej, co potwierdza znaczenie niszy jelitowej robaków i filtrowania gospodarza dla tworzenia rdzenia mikrobiomu jelitowego, który różni się od środowiska glebowego13. Wzorzec ten najlepiej obserwuje się za pomocą ważonej analizy UniFrac PCoA, która pokazuje, że różnice między mikrobiomami środowiskowymi glebowymi a mikrobiomami jelitowymi robaków wynikają głównie z różnic we względnej liczebności kluczowych taksonów.
Chociaż opisany tutaj protokół koncentruje się na zbieraniu robaków do sekwencjonowania 16S, mikrokosmosy można wykorzystać do zbadania dodatkowych interesujących pytań. Na przykład robaki zebrane z mikrokosmosów mogą być następnie badane pod kątem wpływu zróżnicowanego mikrobiomu jelitowego na odporność gospodarza na różne niekorzystne warunki, w tym patogeny lub toksyny. Alternatywnie, nowe gatunki i szczepy bakterii mogą być izolowane i hodowane z robaków zebranych w ziemi, rozszerzając taksonomiczną i funkcjonalną różnorodność bakterii dostępnych do przeprowadzania eksperymentów.
Podczas gdy metody badawcze w warunkach laboratoryjnych dążą do spójności i odtwarzalności, praca z mikrokosmosami wykorzystuje naturalną zmienność do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm w naturalnym kontekście. Niemniej jednak ta odmiana wiąże się również z pewnymi wyzwaniami. Niektóre gleby, które zawierają wysoki poziom endogennych bezkręgowców, mogą wymagać dodatkowego wirowania, filtracji i etapów badania, aby skutecznie wyeliminować niepożądane organizmy z preparatu mikrokosmosu. Ponadto niska liczebność mikroorganizmów w glebie może powodować niepożądane powstawanie dauerów w populacjach robaków, co wymaga zwiększenia ekstraktu mikrobiologicznego lub wzbogacenia gleby w większą ilość plonów. Z każdym przeprowadzonym eksperymentem mikrokosmicznym naukowcy kontynuują badanie pełnej różnorodności taksonomicznej i funkcjonalnej zapewnianej przez naturę, umożliwiając odkrycie nowych taksonów drobnoustrojów i zdolności funkcjonalnych, od odporności na infekcje po ochronę przed ksenobiotykami środowiskowymi.

Nicień Caenorhabditis elegans staje się użytecznym modelem do badania interakcji między gospodarzami a ich mikrobiomami jelitowymi1,2. Jako model ma kilka zalet. Po pierwsze, zwierzęta wolne od zarazków lub gnotobiotyczne są łatwe do zdobycia i utrzymania; Wybielacz może być używany do zabijania robaków gravid i związanych z nimi drobnoustrojów, pozostawiając ich odporne na wybielanie jaja nienaruszone, aby mogły rosnąć jako populacje zsynchronizowane z wiekiem, które mogą zostać skolonizowane przez bakterie będące przedmiotem zainteresowania3,4. Ponadto, gdy rośnie w obecności bakterii, C. elegans, bakteriożerca, połyka napotkane bakterie, z gatunkami podatnymi trawionymi lub wydalanymi, podczas gdy gatunki odporne i trwałe stabilnie kolonizują jelito robaka. Co więcej, C. elegans są w większości hermafrodytami, wytwarzając populacje genetycznie identycznego potomstwa, co zmniejsza mylącą zmienność genetyczną. W połączeniu z dostępnością zmutowanych i transgenicznych szczepów robaków, praca z C. elegans oferuje naukowcom gnotobiotyczny i genetycznie podatny model do zbadania molekularnych podstaw interakcji gospodarz-mikroorganizm5,6,7,8.
Podczas gdy eksperymenty z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami mogą ułatwić analizę mechanizmów molekularnych, identyfikacja i badanie bakterii, z którymi robaki wchodzą w interakcje w naturze, są niezbędne do zbadania różnorodności takich mechanizmów, odkrycia naturalnego kontekstu ich funkcji i zrozumienia selektywnych sił, które ukształtowały ich ewolucję. Poza laboratorium, C. elegans występuje na całym świecie w wilgotnym klimacie umiarkowanym, gdzie uważa się, że populacje przechodzą cykl życiowy "boom i upadek", charakteryzujący się szybkim wzrostem populacji, gdy zasoby są obfite, a następnie przesunięciem rozwojowym w kierunku pionierskich, odpornych na stres dauers, gdy zasoby są wyczerpane9. Chociaż uważa się je za nicienie glebowe, dziko rozmnażające się populacje C. elegans najczęściej żywią się rozkładającym się materiałem organicznym, takim jak gnijące kwiaty lub owoce, gdzie populacje bakterii są obfite i zróżnicowane.
Badania mikrobiomu jelitowego u nicieni wyizolowanych z dzikiej przyrody zidentyfikowały różnorodne, ale charakterystyczne społeczności bakteryjne10,11, których skład został dodatkowo poparty badaniami przeprowadzonymi na robakach hodowanych w naturalnym środowisku mikrokosmosu12,13. Łącznie takie badania umożliwiły wyznaczenie mikrobiomu jelitowego robaka rdzeniowego2. Podczas gdy pobieranie próbek populacji C. elegans w naturze stanowi najbardziej bezpośrednie badanie naturalnych interakcji robak-mikroorganizm, nie jest to możliwe wszędzie i kiedykolwiek, ponieważ jest ograniczone do regionów i pór roku z obfitymi opadami10,11. Alternatywnie, zamiast izolować robaki od ich naturalnego środowiska, eksperymenty z wykorzystaniem mikrokosmosów wprowadzają naturalne środowisko do laboratorium6,8,12,13,14,15. Środowiska mikrokosmiczne przygotowywane są z gleby kompostowanej z różnymi owocami lub warzywami, co umożliwia dalsze zróżnicowanie wyjściowego zbiorowiska glebowego. Oferują one praktyczne metody eksperymentalne, które łączą różnorodność mikrobiologiczną i trójwymiarowe środowisko dzikiej gleby z eksperymentalnymi zaletami kontrolowanego obiektu laboratoryjnego i genetycznie zdefiniowanych szczepów robaków. Poniższy protokół szczegółowo opisuje etapy związane z pracą z mikrokosmosami kompostu, demonstrując ich zastosowanie w zrozumieniu tworzenia charakterystycznego mikrobiomu jelitowego robaka z różnych środowisk.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik AMPure XP, 60 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Plik uzupełniający Krok 1.3</td></tr><tr><td>Wybielacz (podchloryn sodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7681-52-9</td><td>Krok 6.5</td></tr><tr><td>Zestaw DNeasy PowerSoil Pro</td><td>Qiagen</td><td>47016</td><td>Krok 7 Ekstrakcje DNA</td></tr><tr><td>Zestaw dNTP 10</td><td>mM Invitrogen</td><td>18427013</td><td>Dodatkowy krok 1.2</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna Easypet 3 Kontroler</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td>Służy do usuwania supernatantu w razie określenia</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 25 ml Sterylne pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-368</td><td>Służy do usuwania supernatantu, gdy jest określony</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>Używany do produkcji</td></tr><tr><td>chlorowodorku lewamizolu</td> M9 <td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>Krok 6.4</td></tr><tr><td>M9 Minimalny roztwór podłoża</td><td>Przygotowany we własnym</td><td>zakresie Receptura nie dotyczy w wormbook.org</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>Służy do produkcji</td></tr><tr><td>zestawu odczynników M9 MiniSeq o wysokiej wydajności (150 cykli)</td><td>Illumina</td><td>FC-420-1002</td><td>Dodatkowy krok 1.7</td></tr><tr><td>System MiniSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-420-1001</td><td>Używany komercyjny sekwencer; Krok uzupełniający 1.7</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Używany do produkcji M9</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Używany do produkcji</td></tr><tr><td>pożywki hodowlanej nicieni M9 (NGM)</td><td>Przygotowany we własnym</td><td>zakresie przepis na</td><td>brak w</td> wormbook.org</tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (96 próbek)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>Używany zestaw do przygotowania biblioteki; Krok uzupełniający 1.4</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>Krok uzupełniający 1.7</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Krok uzupełniający 1.2</td></tr><tr><td>Homogenizator PowerLyzer 24 (110/220 V)</td> <td>Qiagen</td><td>13155</td><td>Krok 7.3</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Kroki uzupełniające 1.1 i 1.6</td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Kroki dodatkowe 1.1 i 1.6</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-151</td><td>Służy do przygotowania</td></tr><tr><td>Koralików cyrkonowych/krzemionkowych M9+T o średnicy 1,0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9847287</td><td>Krok 7.1</td></tr></tbody></table>

mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u caenorhabditis elegans

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

Nicień Caenorhabditis elegans staje się użytecznym modelem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji między gospodarzami a ich mikrobiomami jelitowymi. Podczas gdy eksperymenty z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami lub zdefiniowanymi społecznościami bakteryjnymi mogą ułatwić analizę mechanizmów molekularnych, badanie nicieni w ich naturalnym kontekście mikrobiologicznym jest niezbędne do zbadania różnorodności takich mechanizmów. Jednocześnie odizolowanie robaków od dzikich zwierząt nie zawsze jest wykonalne, a nawet jeśli jest to możliwe, pobieranie próbek ze środowiska naturalnego ogranicza wykorzystanie zestawu narzędzi genetycznych, które w przeciwnym razie byłyby dostępne do badań nad C. elegans. Poniższy protokół opisuje metodę badań mikrobiomu z wykorzystaniem mikrokosmosów kompostu do wzrostu w laboratorium w zróżnicowanym mikrobiologicznie i naturalnym środowisku.
Lokalnie pozyskiwana gleba może być wzbogacona o produkty w celu urozmaicenia społeczności mikroorganizmów, w których hodowane są robaki i z których są zbierane, myte i sterylizowane powierzchniowo do późniejszych analiz. Reprezentatywne eksperymenty wykazały zdolność do modulowania społeczności drobnoustrojów we wspólnej glebie poprzez wzbogacanie jej różnymi produktami, a ponadto wykazują, że robaki hodowane w tych odrębnych środowiskach gromadzą podobne mikrobiomy jelitowe, różniące się od ich odpowiednich środowisk, co potwierdza koncepcję specyficznego dla gatunku mikrobiomu jelitowego. Ogólnie rzecz biorąc, mikrokosmosy kompostowe zapewniają naturalne środowisko laboratoryjne do badań nad mikrobiomem jako alternatywa dla syntetycznych społeczności mikrobiologicznych lub izolacji dzikich nicieni.

Aby zbadać możliwość zróżnicowania społeczności w mikrokosmosach glebowych, porównaliśmy społeczności mikrobowe w mikrokosmosach kompostowych przygotowanych poprzez wzbogacenie tej samej gleby początkowej — kompostu przemysłowego dostępnego w mieście Berkeley w Kalifornii — różnymi produktami roślinnymi: jabłkami, papryką, pomarańczami lub ziemniakami (każdy zestaw w trzech powtórzeniach). Następnie porównaliśmy społeczności mikrobowe każdego środowiska kompostowego z mikrobiomem jelitowym dzikiego typu C. elegans hodowanego w odpowiednim mikrokosmosie. Analizę przeprowadzono z próbkami DNA wyekstrahowanego z około 500 wysterylizowanych powierzchniowo osobników dorosłych na mikrokosmos oraz z próbek 250 mg kompostu z odpowiednich mikrokosmosów.
Charakterystyka mikrobiomów gleby środowiskowej oraz jelit dżdżownic opierała się na sekwencjonowaniu nowej generacji regionu V4 genu 16S rRNA bakterii. Przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania przeprowadzono przy użyciu standardowych zestawów zgodnie z instrukcjami producentów, a samo sekwencjonowanie wykonano na komercyjnym sekwenatorze (patrz Tabela materiałów). Zdemultipleksowane sekwencje przetworzono za pomocą programu DADA2, przypisano im taksonomię na podstawie bazy referencyjnej SILVA v132 i przeanalizowano za pomocą pakietu phyloseq16,17,18 (szczegółowy opis sekwencjonowania i analizy znajduje się w Pliku uzupełniającym 1, Rysunku uzupełniającym S1, Rysunku uzupełniającym S2, Rysunku uzupełniającym S3, Tabeli uzupełniającej S1 oraz Tabeli uzupełniającej S2; pełny schemat obliczeniowy jest dostępny w serwisie GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Surowe dane są dostępne w bazie NCBI Sequence Read Archive (Bioproject ID PRJNA856419).
Średnio uzyskano 73 220 sekwencji na próbkę. Sekwencje te reprezentują 15 027 wariantów sekwencji amplikonów (ASV), obejmujących 27 typów i 216 rodzin, w tym rodziny uznawane za część rdzennego mikrobiomu jelitowego C. elegans13, takie jak Rhizobiaceae, Burkholderiaceae oraz Bacillaceae. Enterobacteriaceae i Pseudomonadaceae, które wcześniej uznano za dominujące elementy, tym razem stanowiły mniejszość, lecz nadal były wzbogacone (2–10-krotnie) w porównaniu do ich odpowiednich środowisk glebowych. Porównania oparte na nieważonych i ważonych dystansach UniFrac19,20 wykazały dobrą powtarzalność między triplikatami mikrokosmosów wzbogaconych tym samym produktem roślinnym, co wskazuje bliskie grupowanie się próbek. Z kolei mikrobiomy glebowe z różnych środowisk, wzbogacone różnymi produktami, grupowały się oddzielnie, co demonstruje możliwość zróżnicowania początkowej społeczności mikrobowej poprzez dodanie różnych produktów roślinnych (Rycina 2).
W porównaniach mikrobiomów jelit dżdżownic i społeczności środowiskowych, analiza głównych współrzędnych (PCoA) z zastosowaniem nieważonych lub ważonych odległości UniFrac wykazała wyraźne grupowanie się mikrobiomów jelit dżdżownic oddzielnie od ich odpowiednich środowisk dla każdego typu mikrokosmosu (Rysunek 2). Podczas gdy PCoA oparta na nieważonych odległościach UniFrac nie odróżniła mikrobiomów glebowych od mikrobiomów dżdżownic (Rysunek 2A), grupowanie oparte na odległościach ważonych ujawniło wyraźną separację mikrobiomów jelit dżdżownic i kompostu (Rysunek 2B). Wyniki te wspierają proces, w którym filtracja przez gospodarza oddziałuje na dostępność środowiskową, kształtując mikrobiom jelitowy, który nie jest całkowicie odrębny od swojego źródła środowiskowego pod względem obecności taksonów, lecz moduluje ich obfitość poprzez wzbogacanie o podzbiór dostępnych taksonów, co ostatecznie skutkuje powstaniem rdzennego mikrobiomu jelit dżdżownic, wspólnego dla osobników hodowanych w różnych środowiskach.
<img alt="Wykres analizy głównych składowych (PCA) typów kompostu z markerami gleby i dżdżownic do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64393/64393fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mikrobiomy jelit dżdżownic grupujące się oddzielnie od odpowiadających im środowisk mikrobiologicznych zdywersyfikowanych produktami roślinnymi. Skład mikrobiomu określono za pomocą sekwencjonowania 16S, a społeczności z mikrokosmosów wzbogaconych wyznaczonymi produktami roślinnymi lub z dżdżownic w nich hodowanych zgrupowano za pomocą PCoA w oparciu o (A) nieważone lub (B) ważone odległości UniFrac. Przedstawione osie to te, które wyjaśniają największą zmienność w składzie społeczności między próbkami (N = 3 dla każdego typu mikrokosmosu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/64393fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Sekwencjonowanie nowej generacji i analiza danych. Przedstawiono tutaj etapy przygotowania bibliotek, sekwencjonowania w laboratorium oraz analizy danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/Supplementary%20File%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający S1: Przykład wykresu kontroli jakości dla odczytów odwrotnych z jednej próbki. Oś X (cykl) przedstawia pozycję nukleotydu wzdłuż odczytu sekwencji. Lewa oś Y przedstawia wynik jakości. Skala szarości mapy ciepła reprezentuje częstotliwość występowania wyniku jakości w każdej pozycji nukleotydu; zielona linia obrazuje medianę wyniku jakości w każdej pozycji nukleotydu; górna pomarańczowa linia obrazuje kwartyle rozkładu wyniku jakości; dolna czerwona linia obrazuje procent odczytów sekwencji, które sięgnęły danej pozycji nukleotydu (prawa oś Y, tutaj 100%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający S2: Wskaźniki błędów dla różnych próbek. Częstotliwość błędów w różnych próbkach (czarne kropki) powinna maleć wraz ze wzrostem wyniku jakości (quality score) dla każdej przedstawionej możliwej substytucji par zasad, co odzwierciedla oczekiwaną tendencję. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/Supplementary%20Figure%20S2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający S3: Przykład PCoA opartego na ważonych dystansach UniFrac. Nazwy grup przedstawione w legendzie reprezentują produkty użyte do wzbogacenia kompostu w różnych mikrokosmosach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/Supplementary%20Figure%20S3.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Sekwencyjne filtrowanie sekwencji. aLiczba odczytów sekwencji przed filtrowaniem. b-dKażda kolumna przedstawia liczbę odczytów sekwencji pozostałych po etapie filtracji: odfiltrowaniu odczytów o niskiej jakości (krok 2.5), algorytmie odszumiającym wykonanym przez dada() (krok 2.8), łączeniu odczytów forward i reverse (krok 2.9) oraz usuwaniu chimer (krok 2.11). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/64393_S1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S2: Tabela metadanych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64393/64393_S2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their ...

Protokół ten opisuje, jak hodować robaki i kompostować mikrokosmosy, umożliwiając eksplorację interakcji gospodarz-mikrobiom w naturalnym kontekście. Metoda ta stanowi alternatywę dla izolowania dzikich robaków od natury lub wykorzystywania syntetycznych zbiorowisk drobnoustrojów o ograniczonej różnorodności mikrobiologicznej. Ten protokół jest prosty i może być wykonany w dowolnym laboratorium, a nawet jest odpowiedni dla początkujących.Na początek zdobądź kompost lub ziemię ogrodową z dowolnego dogodnego źródła i przechowuj ją w laboratorium w standardowym plastikowym pojemniku kuchennym z otworami wyciętymi w pokrywie w celu napowietrzenia. Zatkaj otwory watą, aby nie dopuścić do przedostania się muszek owocowych i innych bezkręgowców. Wzbogać kompost lub glebę posiekanymi produktami lub mieszanką różnych produktów w glebie, aby uzyskać stosunek dwa do jednego masy.Mieszaj kompost raz dziennie i dodawaj podłoże M9 w razie potrzeby, aby utrzymać wilgoć bez powodowania błota. Dla każdego mikrokosmosu dodaj 10 gramów wzbogaconego kompostu do 30-mililitrowej szklanej zlewki pokrytej folią aluminiową. Dodaj 30 gramów wzbogaconego kompostu do każdej 50-mililitrowej tubki.Napełnij rurkę M9 i wiruj. Odwirować probówki o sile 560 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety serologicznej usunąć supernatanty bez naruszania osadu i połączyć je w nowej probówce o pojemności 50 mililitrów.Zagęścić ekstrakt bakteryjny, odwirowując probówkę z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zawieś granulki w wystarczającej ilości M9, aby mieć 200 mikrolitrów na każdy mikrokosmos i 200 mikrolitrów na płytkę, która posłuży jako widoczny wskaźnik zastępczy dla mikrokosmosów. Dodaj 200 mikrolitrów skoncentrowanego ekstraktu mikrobiologicznego do autoklawizowanej zlewki kompostowej i widocznej płytki proxy NGM.Dodaj od 500 do 1000 larw L1 do każdego mikrokosmosu i płytki zastępczej. Wyłóż cylindryczną rurę PVC bibułą. Ten cylinder powinien mieć jednomilimetrową nylonową siatkę przyklejoną na dole w lejku.Umieścić cylinder w lejku Baermanna, umieszczając go w kolbie. Dodaj 20 mililitrów M9 do mikrokosmosu robaków. Wymieszać mieszaninę, a następnie przelać mieszaninę ze zlewki do cylindra wyłożonego bibułką w układzie lejkowym Baermann.Całkowicie zanurz kompost w lejku, dodając więcej M9. Odpiąć zacisk, aby uwolnić filtrat zawierający zebrane robaki do 50-mililitrowej probówki. Następnie należy zagęścić robaki, odwirowując probówkę o sile 560 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz te kroki i wyciągnij filtraty z różnych rund, jeśli chcesz uzyskać więcej robaków.Usunąć supernatant pipetą serologiczną, pozostawiając 15 mililitrów w probówce. Przenieś pozostały płyn do 15-mililitrowej probówki i ponownie wiruj przez jedną minutę, aby jeszcze bardziej zagęścić robaki. Usunąć 14 mililitrów supernatantu za pomocą pipety serologicznej.Jednocześnie zbierz jeden gram pozostałej mikrokosmicznej gleby do 1,5-mililitrowej probówki, przetwarzając próbki gleby zawierające środowiskową społeczność bakteryjną, jak opisano w manuskrypcie. Przenieś jeden mililitr skoncentrowanych zebranych robaków do 1,5 mililitrowej probówki za pomocą szklanej pipety. Inkubować przez dwie minuty, aby robaki osiadły na dnie probówki.Usunąć supernatant, pozostawiając 100 mikrolitrów osadu w spokoju na dnie probówki. Umyj granulat 1,5 mililitra M9 plus Triton X, pozwalając robakom za każdym razem osiąść na dnie. Przenieś umyte robaki w objętości 100 mikrolitrów do nowej 1,5 mililitrowej probówki za pomocą szklanej pipety.Aby sparaliżować robaki, dodaj 100 mikrolitrów 25-milimolowego chlorowodorku lewamizolu i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 200 mikrolitrów 4% roztworu wybielacza i inkubuj przez dwie minuty. Usuń supernatant, pozostawiając nienaruszone 150 mikrolitrów na dole, a następnie trzykrotnie umyj granulkę robaka M9 plus Triton X. Te wysterylizowane powierzchniowo robaki mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia i mogą być używane później do dalszych zastosowań.Porównanie mikrobiomów jelitowych robaków i społeczności środowiskowych przy użyciu podstawowej analizy współrzędnych opartej na nieważonej lub ważonej odległości UniFrac wykazało wyraźne grupowanie mikrobiomów jelitowych robaków z dala od tych w ich odpowiednich środowiskach. Podczas gdy podstawowa analiza współrzędnych oparta na nieważonych odległościach UniFrac nie rozróżniała mikrobiomów glebowych i robaków, grupowanie oparte na odległościach ważonych ujawniło wyraźne oddzielenie mikrobiomów jelitowych i kompostowych. W tym badaniu robaki hodowane w mikrokosmosach kompostu zostały wykorzystane do sekwencjonowania 16S, ale mogą być również wykorzystane do przetestowania wpływu różnych mikrobiomów środowiskowych na odporność gospodarza na niekorzystne warunki.Alternatywnie, nowe taksony bakteryjne można wyizolować z robaków zebranych z mikrokosmosów kompostu w celu rozszerzenia znanej różnorodności taksonomicznej i funkcjonalnej komensali jelitowych robaków. Po jego opracowaniu, projekt Microcosms Pipeline ułatwił ocenę wpływu czynników genetycznych środowiska i gospodarza w kształtowanie mikrobiomu jelitowego.

compost-microcosms-as-microbially-diverse-natural-like-environments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Morgan, E. i in. Selektywne oczyszczanie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia bakterii mikrobiomu jelitowego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje protokół izolowania interesujących bakterii jelitowych od dzikich robaków Caenorhabditis . Robaki są najpierw głodzone i myte, aby wyeliminować pozostałości bakterii żerujących z ich powierzchni i światła jelit, jednocześnie zachowując docelowe mikroorganizmy. Po oczyszczeniu powierzchni i kilku etapach pełzania robaki są...

Selektywne oczyszczanie robaków wywołanych chorobą piersiową w celu wzbogacenia mikrobioty jelitowej

Źródło: Petersen, C. i in., Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje izolację i hodowlę gatunków bakterii związanych z Caenorhabditis elegans. Liza C. elegans oparta na koralikach, a następnie selektywna hodowla, umożliwia izolację różnorodnych szczepów mikroorganizmów do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla bakterii związanych z Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Aby wykorzystać Caenorhabditis elegans (C. elegans) w badaniach omiki, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji robaków, gdzie pojedyncza próbka może być mierzona na różnych platformach do analiz porównawczych. Przedstawiono tutaj metodę hodowli populacji C. elegans na płytkach hodowlowych na dużą skalę (LSCP) oraz dokumentowania wzrostu populacji.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę mikrokosmów kompostowych do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala na badanie interakcji gospodarz-mikrobiom w warunkach zbliżonych do naturalnych, oferując alternatywę dla izolacji dzikich robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów