Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D
7 kwietnia 2023
Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.
Nasza platforma wykorzystuje zmodyfikowane w 3D tkanki mięśniowe i czujniki magnetyczne do jednoczesnego pomiaru kurczliwości w 24 dołkach. Zapewnia to bardziej przepustową metodę oceny nowych terapii in vitro z wykorzystaniem ludzkich tkanek mięśniowych. Nasza metoda odlewania poprawia spójność i powtarzalność w wytwarzaniu tkanek mięśniowych modyfikowanych w 3D.
Na naszej platformie zaprojektowaliśmy 24-dołkową płytę odlewniczą z materiałami eksploatacyjnymi, wyposażoną w czujniki magnetyczne do pomiarów i analizy kurczliwości. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat modelowania chorób in vitro, odkrywania leków i terapii genowej dla każdej choroby mięśni, która wpływa na kurczliwość. Obecnie włączamy neurony ruchowe do naszych konstruktów 3D, aby stworzyć również model połączenia nerwowo-mięśniowego.
Na początek umieść wstępnie schłodzony zestaw do odlewania tkanek na zimnym bloku lub lodzie wewnątrz kaptura do hodowli komórkowej. Połóż płytę odlewniczą płasko na lodzie. Dodaj trombinę do podłoża bazowego, aby uzyskać roztwór trombiny i przenieś kratownicę z płytki odlewniczej na nową sterylną płytkę 24-dołkową.
Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu trombiny do każdego wstępnie schłodzonego dołka płytki odlewniczej i umieścić kratkę z powrotem na zestawie. Odłóż zestaw odlewniczy na lód. Następnie dodaj 500 mililitrów pożywki RPMI, 10 mililitrów witaminy B27 i 2,5 grama kwasu aminokapronowego lub ACA, aby przygotować pożywkę EMT dla serca.
Wyjmij pożywkę EMT, która zostanie użyta do odlewania tkanek i dodaj do niej 10 mikromolowy inhibitor ROCK. Przygotuj szkieletową pożywkę EMT, dodając 50 mililitrów pożywki F10 i 0,25 grama kwasu aminokapronowego lub ACA dla pierwotnych mioblastów. Użyj 0,1 grama ACA dla mioblastów pochodzących z IPSC.
Następnie sterylnie przefiltrować podłoże odlewnicze zawierające ACA. Ogrzej odczynnik dysocjacyjny klasy hodowli komórkowej i równą objętość pożywki EMT do 37 stopni Celsjusza. To podgrzane podłoże EMT zostanie użyte do rozcieńczenia odczynnika dysocjacyjnego.
Umyj komórki PBS i dodaj podgrzany odczynnik dysocjacyjny, aby podnieść komórki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut lub do momentu, gdy komórki się podniosą i sprawdzać kultury co dwie do trzech minut, stukając w bok płytki. Gdy komórki się podniosą, przenieś je do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.
Rozcierać pipetą P-1000, aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki. Umyć płytkę i kolbę dodatkowym podłożem EMT, aby zebrać pozostałe komórki i dodać je do stożkowej probówki. Ponownie rozdziel komórki, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki.
Dodaj pożywkę EMT, aby zakończyć proces dysocjacji, a następnie pobierz próbki zawiesin komórek do zliczania komórek. Zliczanie komórek należy wykonywać za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru w kolorze błękitu trypanowego. Wirować komórki pod ciśnieniem 200 G przez cztery minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach pożywki bazowej EMT, aby usunąć resztki odczynnika dysocjacyjnego.
Po ponownym odwirowaniu przez cztery minuty odessać supernatant i przygotować zawiesiny komórek o odpowiedniej gęstości. Oblicz objętość każdego roztworu komórkowego potrzebną do uzupełnienia żądanej liczby tkanek i pipetuj obliczone objętości komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj 10 mikrolitrów fibrynogenu na EMT do zawiesiny komórkowej i umieść ją na lodzie.
Upewnij się, że każdy EMT ma 90 mikrolitrów zawiesiny komórek, 10 mikrolitrów fibrynogenu i 50 mikrolitrów roztworu trombiny w końcowym konstrukcie tkanki. W kapturze do hodowli komórkowej zdejmij pokrywę zestawu do odlewania tkanek i umieść płytkę odlewniczą z kratką słupkową leżącą płasko na lodzie. Wymieszaj mieszaninę fibrynogenu komórkowego i nabierz 100 mikrolitrów za pomocą pipety P-200.
Dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny do studzienek przygotowanych z 50 mikrolitrów roztworu trombiny i rozcieraj pięć razy, aby dobrze wymieszać. Nie należy wypychać pipety poza pierwszy ogranicznik i wyjmować końcówkę po roztarciu, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Wymieszaj zawiesinę komórkową w stożkowej probówce przed odlaniem każdej tkanki.
Przytrzymaj jednocześnie kratę i płytkę studzienki odlewniczej za pomocą palca wskazującego i kciuka jednej ręki, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu kraty lub pozostaw płytkę płasko na lodzie i kołysz wiadrem z lodem, aby zajrzeć do płyty odlewniczej. Powtórz z nową końcówką P-200 dla każdej tkanki, aż wszystkie tkanki zostaną odlewane. Ostrożnie przenieś zestaw z nasionami do inkubatora i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 80 minut.
Następnie przygotuj świeżą 24-dołkową płytkę z dwoma mililitrami pożywki EMT na dołek dla tkanek serca i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ogrzać pożywkę. Po 80-minutowej inkubacji delikatnie dodać jeden mililitr pożywki EMT do krawędzi studzienek odlewniczych i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10 minutach inkubacji ostrożnie podnieść kratownicę słupka i przenieść tkanki z płytki odlewniczej na przygotowaną płytkę 24-dołkową z podgrzanym podłożem.
Na koniec włóż płytki z tkankami do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Nieudana produkcja EMT może obejmować zarówno katastrofalne awarie, takie jak oderwanie się tkanki od słupków, jak i bardziej subtelne wady strukturalne, takie jak pęcherzyki powietrza i nierównomierne osadzanie się tkanek wokół obu wkładów. Konstrukcja EMT dzień po rzuceniu jest pokazana tutaj.
Tkanki mięśni szkieletowych przeniesiono do pożywki różnicującej, rozpoczynając zero dzień fuzji komórek i zagęszczenia hydrożelu. Od siódmego dnia do dnia 28 ten sam EMT wykazywał nieco krótszą całkowitą długość między dwoma słupkami i mniejszą szerokość, gdy mierzono przez środkową część EMT. Cztery płytki tkanek śledzono przez 21 dni, porównując średnicę EMT podczas zagęszczania.
Punkty czasowe pokazują stały rozmiar EMT między płytami. Maksymalne zagęszczenie osiąga się w 21 dniu, gdy przebudowa matrycy jest ustabilizowana. Przedstawiono tutaj immunohistochemię EMT.
EMT zostały utrwalone w 10 dniu hodowli i zatopione w parafinie. Cienkie przekroje poprzeczne przed obrazowaniem wybarwiono przeciwciałami przeciwko łańcuchowi ciężkiemu miozyny i dystrofinie. Te obrazy graficzne reprezentują średnią bezwzględną siłę drgającą mierzoną przez EMT serca i EMT szkieletowych w czasie.
Ostre i przewlekłe leczenie doksorubicyną w zmodyfikowanych tkankach serca przedstawiono tutaj. Trzy różne stężenia dawki Dox podawano w bolusie lub w sposób ciągły do zmodyfikowanych tkanek serca w ciągu 27 dni. Odpowiedź na dawkę BDM w zmodyfikowanych tkankach mięśni szkieletowych przedstawiono na tym rysunku.
Częstość uderzeń serca lub częstotliwość drgawek ustaje w sposób zależny od dawki w połączeniu z ustaniem siły skurczu wskazującej na kardiotoksyczność, gdy EMT są narażeni na ten związek. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas odlewania tkanek, jest utrzymywanie wszystkiego w niskiej temperaturze przez cały czas, w tym zawiesiny komórek i odczynników, oraz utrzymanie siatki słupkowej całkowicie nieruchomej po rozpoczęciu odlewania.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje proces generowania trójwymiarowych (3D) inżynieryjnych tkanek mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych z wykorzystaniem systemu detekcji magnetycznej do przesiewania leków. Zastosowane metody umożliwiają jednoczesną ocenę 24 tkanek, co zwiększa wydajność badań przedklinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria mięśnia sercowego i szkieletowego
- Przedkliniczne badanie przesiewowe leków
- Modelowanie tkanek
Wprowadzenie
- Trójwymiarowe (3D) inżynierowane tkanki mięśniowe stanowią odpowiedni model in vitro do badania chorób mięśni.
- Technologia czujników magnetycznych umożliwia wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości.
- Poprawa powtarzalności wytwarzania tkanek jest kluczowa dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych.
- Włączenie neuronów ruchowych ma na celu stworzenie modelu złącza nerwowo-mięśniowego.
Cel badania
- Opracowanie metody generowania spójnych trójwymiarowych (3D) tkanek mięśniowych.
- Ułatwienie odkrywania leków i modelowania chorób z wykorzystaniem ludzkich tkanek mięśniowych.
- Zwiększenie przepustowości ocen kurczliwości in vitro.
Zastosowane metody
- Przygotowanie płytek odlewniczych i roztworów trombiny do formowania tkanki.
- Dysocjacja i liczenie komórek w celu zapewnienia odpowiedniej gęstości komórkowej.
- Odlewanie tkanek mięśniowych z wykorzystaniem roztworów fibrynogenu i trombiny.
- Inkubacja i przeniesienie tkanek do mediów różnicujących.
Główne wyniki
- Pomyślne wytworzenie trójwymiarowych inżynieryjnych tkanek mięśniowych o spójnej kurczliwości.
- Maksymalne zagęszczenie tkanek zaobserwowano do 21. dnia.
- Analiza immunohistochemiczna potwierdziła obecność białek specyficznych dla mięśni.
- Osiągnięto wysokoprzepustową ocenę kurczliwości w wielu tkankach.
Wnioski
- Opracowany protokół umożliwia wydajne generowanie i ocenę tkanek mięśniowych.
- Metoda ta może znacząco wspomóc proces odkrywania leków oraz modelowanie chorób mięśni.
- Dalsze prace skupią się na integracji neuronów ruchowych w konstruktach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Skalowalne platformy inżynieryjnych trójwymiarowych tkanek mięśniowych wypełniają krytyczną lukę w przedklinicznych badaniach leków, umożliwiając powtarzalną i ilościową ocenę funkcji skurczowej zarówno w modelach zdrowych, jak i chorobowych. Technologia ta zwiększa pewność prognostyczną w zakresie kardiotoksyczności i miotoksyczności, wspierając wcześniejszą redukcję ryzyka oraz bardziej świadome decyzje dotyczące portfolio produktów. Integracja wysokoprzepustowych, bezetykietowych testów kurczliwości sprawia, że modele te stają się kluczowymi narzędziami zapewniającymi ciągłość translacyjną od etapu odkrywania leku po walidację przedkliniczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w układach mięśniowych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację odpowiedzi skurczowych na związki kandydujące.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar siły i kinetyki mięśni.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne konstrukcje mięśniowe 3D dla przepływów pracy w badaniach przesiewowych związków.
- Umożliwia ilościowy, wysokoprzepustowy odczyt kurczliwości w 24 tkankach jednocześnie.
- Zmniejsza zmienność testu i wspiera skalowalne badania przesiewowe w celu wykrywania toksyczności serca i mięśni.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wskaźniki kurczliwości in vitro z biomarkerami translacyjnymi w badaniach bezpieczeństwa mięśnia sercowego i szkieletowego.
- Umożliwia podłużną analizę ostrych i przewlekłych efektów działania leków w tkankach inżynierowanych.
- Wspiera optymalizację rozwoju leków w oparciu o analizę ryzyka poprzez modelowanie toksyczności istotnych klinicznie, takich jak zaobserwowane w przypadku BMS-986094.
Integracja potoków i przepływów pracy
Platforma ta łączy wczesne etapy odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa, zapewniając jednolity i skalowalny system funkcjonalnej oceny mięśni.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w inżynieryjnych modelach mięśniowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych dotyczących kurczliwości do wstępnej selekcji związków.
- Analityka: Umożliwia pomiary zależności dawka-odpowiedź oraz długofalowe pomiary siły i kinetyki.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do klinicznych punktów końcowych bezpieczeństwa w zakresie funkcji mięśni.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, przyjazną automatyzacji platformę, którą można dostosować do różnych źródeł komórek i modeli chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie bezpieczeństwa i skuteczności leków oddziałujących na mięśnie.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wytwarzanie i pomiar tkanek, zmniejszając wskaźnik niepowodzeń oraz konieczność manualnej interwencji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dzięki dostarczeniu wczesnych, ilościowych danych dotyczących bezpieczeństwa.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko i redukuje liczbę niepowodzeń na późnych etapach badań wynikających z nieprzewidzianej toksyczności mięśniowej.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymagana jest wiedza z zakresu trójwymiarowych hodowli tkankowych oraz obsługi testów kurczliwości.
- Wymagany jest dostęp do sprzętu do detekcji magnetycznej oraz kompatybilnych płytek odlewniczych z 24 dołkami.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie analizy danych oraz protokołów wytwarzania tkanek.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych źródeł komórek, w tym do mioblastów pierwotnych oraz pochodzących z iPSC.
- Ograniczenia obejmują możliwość odklejenia się tkanki, powstawanie pęcherzyków powietrza oraz niespójności strukturalne w przypadku nierygorystycznego przestrzegania protokołów.
