Name: Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj metody ekstrakcji i znakowania komórek z ludzkich pęcherzyków antralnych przy użyciu przeciwciał sprzężonych z fluoroforami oraz FACS. Technika umożliwia izolację komórek ziarnistych, śródmiąższowych i komórek theca z czystością powyżej 95%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) oraz Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M.). N.L.G jest wspierany przez NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine postdoctoral grant na szkolenie.

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Weill Cornell Medicine. Wszystkie eksperymenty ksenotransplantacyjne z wykorzystaniem tkanki jajnikowej przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Oba jajniki wyizolowano od 14-letniego dawcy narządów w stanie śmierci mózgowej, u którego nie stosowano radiochemioterapii ani nie stwierdzono chorób endokrynologicznych lub rozrodczych. Komitet Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Weill Cornell Medicine zatwierdził pobranie tkanki, a zgodę rodziny dawcy narządu uzyskano po uzyskaniu świadomej zgody na wykorzystanie tkanki.
1. Pobieranie i postępowanie z tkanką jajnika
<ol>
	<li>Zebrać całe jajniki i związane z nimi tkanki, a następnie spłukać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety umieść jajniki w sterylnym pojemniku. Wlać sterylny, zbuforowany, zimny roztwór (np. pożywkę L-15 firmy Leibovitz) do pojemnika. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie pokryta płynem.</li>
	<li>Zamknij pojemnik i zapakuj go podwójnie za pomocą sterylnych plastikowych torebek. Pojemnik należy transportować na lodzie w izolowanym pudełku (np. styropian). Przenieś próbki do laboratorium, które przetworzy jajniki tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w czasie nieprzekraczającym 5 h3,4.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanki jajnika
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i narzędzia są przygotowane przed dostarczeniem tkanki do laboratorium, aby maksymalnie skrócić okres niedokrwienny. można przygotować do 1 tygodnia przed zamrożeniem i przechowywać w lodówce do czasu użycia.
<ol>
	<li>Preparaty do przetwarzania i zamrażania jajników
	<ol>
		<li>Zestaw wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu przygotowania do przetwarzania tkanek: jeden skalpel numer 21; jeden skalpel numer 11; ostre, drobno zakrzywione nożyczki; jeden długi kleszcz (~150 mm długości) i dwa średnie kleszcze (~110 mm długości).</li>
		<li>Przygotować 100 ml pożywki do przetwarzania tkanek (patrz tabela materiałów): pożywki L-15 firmy Leibovitz zawierającej roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy i przefiltrowanej za pomocą filtra 0,2 μm. Utrzymuj podłoże schłodzone.</li>
		<li>Oznaczyć kriowialisty, dodać 1,5 ml roztworu do zamrażania (patrz Tabela Materiałów) do każdej fiolki i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Miej pod ręką płytkę 6-dołkową do użytku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przybyciu tkanki
	<ol>
		<li>Spryskaj pojemnik 70% roztworem etanolu, dokładnie wytrzyj i umieść go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Zakładając sterylne rękawiczki, otwórz pojemnik. Umieścić jajnik na sterylnej szalce Petriego i zalać schłodzonym podłożem (z kroku 2.1.2) w celu nawodnienia tkanki. Upewnij się, że jajnik jest do połowy zanurzony w pożywce.</li>
		<li>Usuń wszelkie szwy lub inny materiał i wypreparuj pozostałą otaczającą tkankę z dala od jajnika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja pęcherzyków antralnych
<ol>
	<li>Zidentyfikuj poszczególne mieszki włosowe do izolacji. Wybierając zdrowe mieszki włosowe, wyklucz wszelkie pęcherzyki wypełnione krwią, ciemne lub niesymetryczne, ponieważ mogą one być akretyczne.</li>
	<li>Odizoluj wybrane pęcherzyki antralne od całego jajnika za pomocą skalpeli, utrzymując antrum w stanie nienaruszonym poprzez wycięcie tkanki korowej otaczającej pęcherzyk.</li>
	<li>Umieść każdy wycięty nienaruszony pęcherzyk antralny w jednym dołku 6-dołkowej płytki. Jeśli jest to potrzebne do celów opisowych, użyj linijki umieszczonej pod naczyniem, aby określić średnicę mieszków włosowych.</li>
	<li>Za pomocą skalpela przeciąć nienaruszony pęcherzyk antralny, aby uzyskać dostęp do jamy antralnej i dodać 4 ml enzymatycznego podłoża do oddzielania komórek. Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz ekstrakcję dodatkowych pęcherzyków antralnych.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek rezydujących w pęcherzykach
<ol>
	<li>Po inkubacji dodać 4 ml dostępnej pożywki zawierającej 20% FBS i przepłukać przez wielokrotne, energiczne pipetowanie pożywki na półdzielone pęcherzyki za pomocą mikropipety P1,000.</li>
	<li>Zebrać pożywkę i przepuścić ją przez filtr 100 μm.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowany supernatant w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odessać supernatant i odłożyć osad komórkowy (wzbogacony o GC) na lodzie w celu znakowania i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).</li>
	<li>Umieścić pozostałą tkankę w mieszaninie kolagenazy (100 U/ml) i dyspazy (1 U/ml) rozcieńczonej w zrównoważonym roztworze soli fizjologicznej (np. Hanks) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C, mechanicznie niszcząc tkankę przez rozcieranie i energiczne pipetowanie (tj. 10-15 przejść przez końcówkę pipety) dwa razy po 10 minutach i 20 minutach.</li>
	<li>Odzyskaj pożywkę zawierającą tkankę, przepłucz przez pipetowanie przez końcówkę mikropipety P1 000 i przecedź przez filtr 100 μm.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 min. Odessać supernatant i odłożyć na bok osad komórkowy (wzbogacony o TC i komórki zrębu) na lodzie w celu znakowania i FACS.</li>
</ol>
5. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją
<ol>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w roztworze blokującym (PBS + 0,1% FBS) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 minuty i odessać sklarowany nad osadem.</li>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w roztworze blokującym zawierającym bezpośrednio sprzężone przeciwciała (patrz Tabela 1 w celu uzyskania odpowiednich kombinacji przeciwciał w celu identyfikacji GC i TC) i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Umyć i odwirować komórki w temperaturze 300 × g i temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS zawierającym 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) i przepuścić zawiesinę komórkową przez przyrząd FACS w celu wychwycenia małej populacji komórek (500-1000) przy użyciu intensywności fluorescencji przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do bramkowania.</li>
	<li>W celu identyfikacji unikalnych subpopulacji wykorzystaj następujące strategie bramkowania:
	<ol>
		<li>W celu oczyszczenia GC narysuj bramkę wokół komórek CD45+ (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) i wyklucz tę populację z populacji CD99+ (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C); następnie dalej podziel pozostałą frakcję CD99+ na frakcje PVRL+/- (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C).</li>
		<li>W celu oczyszczenia TC i zrębu należy przeszukać całkowitą populację ENG+ (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) lub CD55+ (<silna klasa = "xfig" >Figura 1D), aby wykluczyć frakcję śródbłonka CD34 + (<silna klasa = "xfig" >Figura 1E) i rozróżnić komórki steroidogenne (ANPEP+) i niesteroidogenne (ANPEP-). Należy uważać, aby skompensować przenikanie między fluoroforami, które znajdują się blisko widm emisyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zweryfikować czystość posortowanej frakcji komórek, przepuść 5% całkowitej przechwyconej objętości przez instrument FACS i upewnij się, że komórki wypełniają oczekiwane bramki i mają czystość >95%.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie tkanki korowej jajnika
<ol>
	<li>Przeciąć pozostałą część jajnika na pół i wyciąć rdzeń za pomocą zakrzywionych cienkich nożyczek i skalpeli, uważając, aby uniknąć uszkodzenia kory jajnika.</li>
	<li>Kontynuuj przetwarzanie i rozrzedzanie kory jajnika poprzez delikatne skrobanie, aż pozostanie minimalny rdzeń. Upewnij się, że używasz minimalnej wymaganej siły. 
	UWAGA: Grubość tkanki korowej powinna wynosić od 1 mm do 1,5 mm.</li>
	<li>Podziel tkankę korową na paski o szerokości 2-3 mm wzdłuż jajnika.</li>
</ol>
7. Powolne zamrażanie tkanki jajnikowej
<ol>
	<li>Przygotowanie do zamrażania
	<ol>
		<li>Umieścić jeden pasek korowy w każdej schłodzonej fiolce kriogenicznej zawierającej roztwór do zamrażania.</li>
		<li>Potrząsać fiolkami kriogenicznymi zawierającymi paski korowe na obracającej się płytce przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powolne zamrażanie tkanki jajnikowej5
	<ol>
		<li>Umieścić kriowiale zawierające tkankę jajnika w programowalnej zamrażarce ustawionej na start w temperaturze 0 °C.</li>
		<li>Schłodzić z prędkością 2 °C/min do -7 °C.</li>
		<li>Utrzymuj kriowiale w tej temperaturze przez 10 minut.</li>
		<li>Zanukleatyzować tworzenie się kryształków lodu, dotykając każdego kriowialu bawełnianą końcówką, która została na krótko zanurzona w ciekłym azocie (LN2).</li>
		<li>Schłodzić z szybkością 0,3 °C/min, aż temperatura próbki osiągnie -40°C.</li>
		<li>Zwiększać szybkość chłodzenia do 10 °C/min, aż temperatura próbki osiągnie −140 °C.</li>
		<li>Przenieść kriowiale do przechowywania w LN2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Aghadavod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+granulosa+cells+from+follicular+fluid%3B+Applications+in+biomedical+and+molecular+biology+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments.</a> Advanced Biomedical Research. 4, 250(2015).</li>
<li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+antral+follicles+of+xenograft+versus+ovarian+origin+reveals+disparate+molecular+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures.</a> Cell Reports. 32 (6), 108027(2020).</li>
<li>Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+primordial+follicles+following+prolonged+transportation+of+ovarian+tissue+prior+to+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation.</a> Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).</li>
<li>Jensen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+transplantations+of+cryopreserved+ovarian+tissue+to+41+women+in+Denmark%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark.</a> Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).</li>
<li>Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+storage+and+grafting+of+human+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.</a> Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).</li>
<li>Man, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+superphysiologic+AMH+promotes+premature+luteinization+of+antral+follicles+in+human+ovarian+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts.</a> Science Advances. 8 (9), 7315(2022).</li>
<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human%3A+A+model+from+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li>
<li>Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicular+theca+cell+recruitment%2C+differentiation%2C+and+impact+on+fertility%3A+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update.</a> Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).</li>
<li>Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+theca+cells+from+ovarian+cells+isolated+from+postmenopausal+women%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women.</a> Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).</li>
<li>Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+human+theca+stem+cells+and+their+differentiation+into+theca+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Lepsza rozdzielczość różnorodności komórkowej w pęcherzykach jajnikowych jest klinicznie ważna z kilku powodów. Stosując powyższy protokół do izolacji unikalnych podtypów fenotypowych, które znajdują się w pęcherzykach w stadium antralnym, należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Po pierwsze, zdrowie i żywotność tkanki jajnika, z której pochodzi pęcherzyk antralny, ma kluczowe znaczenie dla określenia jakości komórek i powodzenia dalszych zastosowań. Można to zoptymalizować, minimalizując interwał niedokrwienny, pracując ...

Podstawowymi funkcjonalnymi elementami ludzkiego jajnika są pęcherzyki, które regulują wzrost i rozwój oocytów. Protokoły izolacji komórek pęcherzykowych zostały dobrze ugruntowane w kontekście zapłodnienia in vitro, ale są one odpowiednie tylko dla pobierania komórek z pęcherzyków luteinizowanych w momencie pobierania oocytów1. Opracowaliśmy protokół, który umożliwia izolację dyskretnych populacji komórek z pęcherzyków antralnych na różnych etapach rozwoju, które powstają z natywnych jajników lub ksenoprzeszczepionej tkanki jajnikowej2. Chociaż panuje zgoda co do tego, że wkład komórek rezydujących w pęcherzykach jajnikowych w hodowlę oocytu jest bardzo ważny, niewiele badań prospektywnie zidentyfikowało i wyodrębniło unikalne podtypy fenotypowe obecne w pęcherzykach w stadium antralnym. Głębsze zrozumienie hierarchii różnicowania i transdukcji sygnału między wyspecjalizowanymi komórkami na różnych etapach rozwoju może poszerzyć naszą wiedzę na temat fizjologii jajników w warunkach homeostatycznych i patologicznych. Co więcej, rozróżnienie dyskretnych podtypów komórkowych i ich molekularnego wkładu we wzrost/dojrzewanie pęcherzyków może zapewnić sposób na generowanie substytutów ex vivo, które rekonstruują funkcję jajników w celu przyspieszenia dojrzewania oocytów i/lub leczenia dysfunkcji endokrynologicznych. 
Każdy unikalny typ komórki w jajniku przyczynia się do złożonej funkcji pęcherzyka, który skutecznie funkcjonuje jako odrębny mini-organ wspomagający wzrost i dojrzewanie komórki jajowej, którą zawiera. Oocyt, centralna część pęcherzyka, jest bezpośrednio otoczony ciągłą warstwą komórek ziarnistych (GC), przy czym komórki osłonki (TC) tworzą wtórną warstwę komórek, które łączą się z oocytem i GC, tworząc jednostkę pęcherzykową. Chociaż dzielą się na dwie grupy, GC i TC zawierają liczne podtypy. GC są klasyfikowane zgodnie z ich położeniem w mieszku włosowym; GC otaczające oocyt w porównaniu z tymi, które przylegają do błony podstawnej, są oznaczone odpowiednio jako ooforyczne i ścienne GC, a te podtypy wykazują unikalne sygnatury transkryptomiczne. TC mają wiele podtypów, które działają w celu zapewnienia wsparcia steroidogennego, metabolicznego i strukturalnego. Komórki śródbłonka, okołonaczyniowe i odpornościowe odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowej fizjologii jajników. Zrąb jajnika służy nie tylko jako substrat do wzrostu pęcherzyków, ale prawdopodobnie stanowi również źródło komórek progenitorowych, które powodują powstawanie TC. Ten wielowarstwowy kompleks podtypów komórkowych w obrębie jajnika umożliwia jego funkcjonowanie zarówno jako narządu hormonalnego, jak i rozrodczego.
Ten artykuł przedstawia protokół identyfikacji i oczyszczania komórek ziarnistych, osłonowych, zrębowych, śródbłonkowych i krwiotwórczych z pęcherzyków antralnych. Wykorzystaliśmy ten protokół do wyizolowania tych komórek jajnika i przeanalizowania ich za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek, a następnie specyficznego barwienia pęcherzyków na różnych etapach rozwoju. Protokół zapewnia prostą metodologię, która jest powtarzalna i umożliwi analizę w wysokiej rozdzielczości zarówno fizjologii, jak i patologii jajnika.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia, odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Anti-Anti</td></tr><tr><td>Anti Anti Mountant roztwór</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; P36930</td><td>ProLong Gold</td></tr><tr><td>Collagenaza od&nbsp; Clostridium histolyticum</td><td>Millipore Sigma</td><td>C 2674</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, proszek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D 2650</td><td>Dimetylosulfotlenek</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Medium do odrywania komórek enzymatycznych&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4555-56</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&prime; Zbilansowany roztwór soli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175079</td><td>bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 średni&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Normalna jakość soli</td><td>fizjologicznej Biologiczna</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Milipore sacharozy</td><td>Sigma</td><td>S 1888</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Medium (100 ml, przefiltrowane przez filtr 0,2 mikrona)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 69,64 ml L-15-17,66</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ml bydła płodowego </td><td></td><td></td><td></td>surowica</tr><tr><td>- 3,42 g sacharozy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 10,65 ml DMSO-</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1 ml antybiotykowo-przeciwgrzybiczo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoryjne wyroby i materiały do tworzyw sztucznych</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe przezroczyste płaskie dno nieleczone&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Sitko 100 & mikro; m</td><td>Fisher scientific</td><td>352360</td><td>Corning, Falcon</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>CryoTube 1,8 ml</td></tr><tr><td>szalka Petriego, gł. x wys. 150 mm x 25 mm&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430599</td><td>60EA</td></tr><tr><td>Probówki z polistyrenu z okrągłym dnem i zatrzaskiem z sitkiem komórkowym, 5 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>352235</td><td>Corning,</td></tr><tr><td>System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania Falcon, 0,22 i mikro; m</td><td>Corning</td><td>431154</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANPEP</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>R& D Systems</td><td>FAB7227A</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>304019</td><td></td></tr><tr><td>CD55</td><td>BioLegend</td><td>311306</td><td></td></tr><tr><td>CD 99</td><td>BioLegend</td><td>371308</td><td></td></tr><tr><td>PVRL</td><td>BioLegend</td><td>340404</td><td></td></tr><tr><td><mocne>narzędzia chirurgiczne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>długie kleszcze (~150 mm długości)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-128</td><td>Kleszcze średnie Fisher Scientific</td></tr><tr><td>(długość ~110 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel Fisher Scientific numer 21</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td>EF7281H</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>skalpel numer 11</td><td>Andwin Scientific</td><td>&nbsp; FH/CX7281A</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ostre, drobno zakrzywione nożyczki</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5881</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz Aktywowany fluorescencją sortownik komórek</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 META Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Aktywacja, wzrost, rozwój i dojrzewanie oocytów to złożony proces, który jest koordynowany nie tylko między wieloma typami komórek jajnika, ale także między wieloma punktami kontroli w obwodzie podwzgórza/przysadki/jajnika. W jajniku rośnie wiele wyspecjalizowanych typów komórek w ścisłym związku z oocytem w pęcherzykach jajnikowych. Biologia tych komórek została dobrze opisana na późniejszych etapach, kiedy można je łatwo odzyskać jako produkty uboczne leczenia wspomaganego rozrodu. Jednak dogłębna analiza małych pęcherzyków antralnych izolowanych bezpośrednio z jajnika nie jest często przeprowadzana ze względu na niedobór ludzkiej tkanki jajnikowej i ograniczony dostęp do jajnika u pacjentek poddawanych zabiegom wspomaganego rozrodu. 
Te metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych z jednoczesną identyfikacją/izolacją komórek rezydujących w jajnikach umożliwiają analizę w wysokiej rozdzielczości wczesnych etapów rozwoju pęcherzyków antralnych. Pokazujemy protokoły izolacji dyskretnych typów komórek poprzez enzymatyczne traktowanie pęcherzyków antralnych i oddzielanie komórek ziarnistych, osłonkowych, śródbłonkowych, krwiotwórczych i zrębowych. Izolacja komórek z pęcherzyków antralnych o różnych rozmiarach i stadiach rozwojowych umożliwia kompleksową analizę mechanizmów komórkowych i molekularnych, które napędzają wzrost pęcherzyków i fizjologię jajników, a także stanowi źródło żywotnych komórek, które można hodować in vitro w celu odtworzenia mikrośrodowiska pęcherzyków.

Izolowaliśmy pęcherzyki z powierzchni jajnika i potraktowaliśmy je enzymatycznie, aby wyizolować GCs, jak również komórki osłonki i zrębu otaczające jamę antralną. Komórki zostały zebrane, a frakcje komórek zostały posortowane z pęcherzyków antralnych (średnice w zakresie od 0,5 mm do 4 mm) za pomocą FACS do czystości &gt;95% (<klasa silna="xfig">Rysunek 1).</klasa>
Aby oznaczyć i oczyścić unikalne frakcje komórkowe w ludzkich pęcherzykach antralnych, połączyliśmy trawienie enzymatyczne z sort...

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji i oczyszczania komórek jajnika z pęcherzyków antralnych. Omawiamy metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych, a także zbierania nienaruszonych pęcherzyków antralnych, które są traktowane enzymatycznie w celu uwolnienia wielu typów komórek rezydujących w pęcherzykach, w tym ziarnistości, osłonki, śródbłonka, komórek krwiotwórczych i zrębowych.

Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

Zademonstrowany tutaj protokół umożliwia znakowanie i izolację określonych linii komórkowych, które są obecne w pęcherzykach jajnikowych, począwszy od wczesnych stadiów antralnych, umożliwiając w ten sposób analizę i hodowlę w wysokiej rozdzielczości. To wysoce precyzyjne podejście wykorzystuje kombinacje przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do docelowych markerów powierzchniowych komórek, które są silnie i specyficznie wyrażane wśród dyskretnych linii ziarnistych, zrębowych i osłonkowych. Zacznij od umieszczenia jajnika na sterylnej szalce Petriego i zalej nim schłodzoną pożywkę, aby nawodnić tkankę, upewniając się, że jajnik jest do połowy zanurzony w pożywce.Usuń wszelkie szwy lub inny materiał i wypreparuj pozostałą otaczającą tkankę z dala od jajnika. Aby wyizolować pęcherzyki antralne, zidentyfikuj poszczególne pęcherzyki i wybierz zdrowe mieszki włosowe. Wyklucz wszelkie wypełnione krwią, ciemne lub niesymetryczne mieszki włosowe.Odizoluj wybrane pęcherzyki antralne od jajnika za pomocą skalpeli, utrzymując antrum w stanie nienaruszonym i wycinając tkankę korową otaczającą pęcherzyk. Umieść każdy wycięty nienaruszony pęcherzyk antralny w jednym dołku z sześciodołkowej płytki. Za pomocą linijki umieszczonej pod naczyniem określ średnicę mieszków włosowych w celach opisowych.Za pomocą skalpela przeciąć nienaruszony pęcherzyk antralny, aby ocenić jamę antralną i dodać sześć mililitrów enzymatycznego podłoża do oddzielania komórek przed inkubacją płytki w nawilżanym inkubatorze przez 10 minut. Po inkubacji dodać sześć mililitrów dostępnej pożywki zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i przepłukać pożywką przez wielokrotne energiczne pipetowanie przez przecięte pęcherzyki za pomocą mikropipety P-1000. Następnie zbierz pożywkę i przepuść ją przez 100-milimetrowy filtr.Po odwirowaniu przefiltrowanego supernatantu w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty, należy odessać supernatant. Umieść pozostałą tkankę w mieszaninie 100 jednostek na mililitr kolagenazy i jednej jednostki na mililitr dypazy rozcieńczonej w zrównoważonym roztworze soli przed 30 minutami inkubacji. Mechanicznie rozbić tkankę poprzez dwukrotne pipetowanie i rozcieranie po 10 i 20 minutach.Po zakończeniu odzyskaj tkankę i przepłucz ją pipetowaniem przez końcówkę mikropipety P-1000 i przecedź przez 100-mililitrowy filtr. Odwirować odcedzoną tkankę w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty przed umieszczeniem osadu komórkowego wzbogaconego komórkami osłonki i komórkami zrębu na lodzie w celu etykietowania i FACS. Aby zidentyfikować komórki ziarniste i komórki osłonki, należy ponownie zawiesić granulki komórkowe w roztworze blokującym zawierającym bezpośrednio sprzężone przeciwciała i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Po umyciu i odwirowaniu komórek, ponownie zawieś komórki w buforze FACS zawierającym 4-6 diamidyno-2-fenyloindol lub DAPI i przepuść zawiesinę komórek przez instrument FACS w celu uchwycenia niewielkiej populacji komórek, wykorzystując natężenie fluorescencji przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do bramkowania. Przeciąć pozostałą część jajnika na pół. Wytnij rdzeń za pomocą zakrzywionych cienkich nożyczek i skalpeli, unikając uszkodzenia kory jajnika.Kontynuuj przetwarzanie i ścieńczenie kory jajnika poprzez delikatne skrobanie, aż pozostanie minimalny rdzeń. Podziel tkankę korową na paski o szerokości od dwóch do trzech milimetrów wzdłuż długości jajnika. W celu zamrożenia tkanki jajnikowej umieść jeden pasek korowy w każdej schłodzonej fiolce kriogenicznej zawierającej roztwór do zamrażania.Potrząsać kriogenicznymi fiolkami zawierającymi paski korowe na obracającej się płytce przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zanukleizować tworzenie się kryształków lodu, dotykając każdej fiolki kriogenicznej bawełnianą końcówką na krótko zanurzoną w ciekłym azocie. Pobrano komórki jajnika, a frakcje komórkowe posortowano z pęcherzyków antralnych FACS do ponad 95% czystości.CD99 specyficznie znakowane komórki ziarniste w PVRL1 lub nektyna były coraz bardziej zlokalizowane w przedziale komórkowym oophorus granulosa w miarę zwiększania się pęcherzyków antralnych. Zaobserwowano, że przeciwciała przeciwko endoglinowi lub CD55 specyficznie wyznaczały wszystkie komórki zrębu i osłonki oraz że aminopeptydaza alaninowa była specyficznie eksprymowana przez androgenowe komórki osłonki. Komórki znakowano przeciwciałem skierowanym przeciwko CD99 w celu identyfikacji komórek ziarnistych, a przeciwciała przeciwko CD45 zastosowano w celu wykluczenia komórek krwiotwórczych.Przeciwciała przeciwko PVRL1 rozdzieliły populację komórek ziarnistych na przedziały ooforowe i ścienne. Po trawieniu enzymatycznym z dypazą kolagenazy, preparaty komórkowe znakowane przeciwciałami przeciwko CD55, CD34 i aminopeptydazie alaninowej umożliwiły wychwycenie wszystkich komórek zrębu lub osłonki lub androgenowych komórek osłonki z wyłączeniem komórek śródbłonka z populacji komórek osłonki. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zakłócić antrum mieszków włosowych podczas początkowej izolacji mieszków włosowych poprzez przecięcie w bezpiecznym marginesie wokół granic mieszków włosowych.Po tej procedurze komórki mogą być wykorzystane do analizy molekularnej lub diagnostycznej lub alternatywnie hodowane in vitro do badań toksykologicznych, analizy eksperymentalnej lub rekapitulacji mikrośrodowiska mieszków włosowych. Do tej pory metody te wykorzystywano do modelowania zaburzeń endokrynologicznych obejmujących jajnik oraz do identyfikacji nowych subpopulacji komórek związanych z pęcherzykami.

extraction-labeling-purification-lineage-specific-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Postęp w badaniach nad folikulogenezą preantralną wymaga skutecznych metod izolacji pęcherzyków z pojedynczych jajników. Przedstawiono uproszczony, mechaniczny protokół izolacji pęcherzyków z jajników bydlęcych za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizatora. Metoda ta pozwala na pobranie dużej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych z jednego jajnika.

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Tutaj opisujemy protokół separacji żółtka, komórek ziarnistych i komórek osłonki w ptasich pęcherzykach przedowulacyjnych. Ta precyzyjna obsługa umożliwia krytyczne badania nad rolą tych warstw w funkcjach rozrodczych, pomagając w zrozumieniu rozwoju pęcherzyków włosowych, regulacji hormonalnej i badań nad chorobami w celu zwiększenia plonów rolnych i wglądu biomedycznego.

Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Ten protokół opisuje jednodniową metodę izolacji komórek nabłonka ludzkiego jajowodu. Izolowane komórki nabłonkowe można siać w hodowli dwuwymiarowej (2D) lub dysocjować do zawiesin jednokomórkowych i wykorzystywać w dalszych eksperymentach, w tym cytometrii przepływowej i sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki.

Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

Protokół ten określa ustandaryzowane metody izolacji i przetwarzania płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych oraz niedojrzałych oocytów z procedur IVF, umożliwiając wysokiej jakości analizy molekularne i komórkowe. Te podejścia wspierają badania translacyjne dotyczące płodności, starzenia się reprodukcyjnego i dysfunkcji jajników, wykorzystując materiały zwykle odrzucane w opiece klinicznej.

Pobieranie ludzkiego płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych mieszków mieszkowych oraz niedojrzałych oocytów od osób poddawanych zapłodnieniu in vitro

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium rozpoczyna odcienie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych kultury linii mrożonych ręki.

Człowieka komórek ES: Kultura Od mrożone komórki

W tym filmie pokazujemy, jak znakować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) za pomocą chlorku manganu (MnCl2), który może wnikać do komórek poprzez napięciowo zależne kanały wapniowe, gdy komórki są biologicznie aktywne. Dodatkowo prezentujemy zastosowanie MnCl2 jako komórkowego środka kontrastowego w MRI w celu określenia żywotności hESC in vitro.

Znakowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Poznaj metody ekstrakcji i znakowania komórek z ludzkich pęcherzyków antralnych przy użyciu przeciwciał sprzężonych z fluoroforami oraz FACS. Technika umożliwia izolację komórek ziarnistych, śródmiąższowych i komórek theca z czystością powyżej 95%.

Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Przeglądaj więcej filmów