Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Zademonstrowany tutaj protokół umożliwia znakowanie i izolację określonych linii komórkowych, które są obecne w pęcherzykach jajnikowych, począwszy od wczesnych stadiów antralnych, umożliwiając w ten sposób analizę i hodowlę w wysokiej rozdzielczości. To wysoce precyzyjne podejście wykorzystuje kombinacje przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do docelowych markerów powierzchniowych komórek, które są silnie i specyficznie wyrażane wśród dyskretnych linii ziarnistych, zrębowych i osłonkowych. Zacznij od umieszczenia jajnika na sterylnej szalce Petriego i zalej nim schłodzoną pożywkę, aby nawodnić tkankę, upewniając się, że jajnik jest do połowy zanurzony w pożywce.

Usuń wszelkie szwy lub inny materiał i wypreparuj pozostałą otaczającą tkankę z dala od jajnika. Aby wyizolować pęcherzyki antralne, zidentyfikuj poszczególne pęcherzyki i wybierz zdrowe mieszki włosowe. Wyklucz wszelkie wypełnione krwią, ciemne lub niesymetryczne mieszki włosowe.

Odizoluj wybrane pęcherzyki antralne od jajnika za pomocą skalpeli, utrzymując antrum w stanie nienaruszonym i wycinając tkankę korową otaczającą pęcherzyk. Umieść każdy wycięty nienaruszony pęcherzyk antralny w jednym dołku z sześciodołkowej płytki. Za pomocą linijki umieszczonej pod naczyniem określ średnicę mieszków włosowych w celach opisowych.

Za pomocą skalpela przeciąć nienaruszony pęcherzyk antralny, aby ocenić jamę antralną i dodać sześć mililitrów enzymatycznego podłoża do oddzielania komórek przed inkubacją płytki w nawilżanym inkubatorze przez 10 minut. Po inkubacji dodać sześć mililitrów dostępnej pożywki zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i przepłukać pożywką przez wielokrotne energiczne pipetowanie przez przecięte pęcherzyki za pomocą mikropipety P-1000. Następnie zbierz pożywkę i przepuść ją przez 100-milimetrowy filtr.

Po odwirowaniu przefiltrowanego supernatantu w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty, należy odessać supernatant. Umieść pozostałą tkankę w mieszaninie 100 jednostek na mililitr kolagenazy i jednej jednostki na mililitr dypazy rozcieńczonej w zrównoważonym roztworze soli przed 30 minutami inkubacji. Mechanicznie rozbić tkankę poprzez dwukrotne pipetowanie i rozcieranie po 10 i 20 minutach.

Po zakończeniu odzyskaj tkankę i przepłucz ją pipetowaniem przez końcówkę mikropipety P-1000 i przecedź przez 100-mililitrowy filtr. Odwirować odcedzoną tkankę w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty przed umieszczeniem osadu komórkowego wzbogaconego komórkami osłonki i komórkami zrębu na lodzie w celu etykietowania i FACS. Aby zidentyfikować komórki ziarniste i komórki osłonki, należy ponownie zawiesić granulki komórkowe w roztworze blokującym zawierającym bezpośrednio sprzężone przeciwciała i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po umyciu i odwirowaniu komórek, ponownie zawieś komórki w buforze FACS zawierającym 4-6 diamidyno-2-fenyloindol lub DAPI i przepuść zawiesinę komórek przez instrument FACS w celu uchwycenia niewielkiej populacji komórek, wykorzystując natężenie fluorescencji przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do bramkowania. Przeciąć pozostałą część jajnika na pół. Wytnij rdzeń za pomocą zakrzywionych cienkich nożyczek i skalpeli, unikając uszkodzenia kory jajnika.

Kontynuuj przetwarzanie i ścieńczenie kory jajnika poprzez delikatne skrobanie, aż pozostanie minimalny rdzeń. Podziel tkankę korową na paski o szerokości od dwóch do trzech milimetrów wzdłuż długości jajnika. W celu zamrożenia tkanki jajnikowej umieść jeden pasek korowy w każdej schłodzonej fiolce kriogenicznej zawierającej roztwór do zamrażania.

Potrząsać kriogenicznymi fiolkami zawierającymi paski korowe na obracającej się płytce przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zanukleizować tworzenie się kryształków lodu, dotykając każdej fiolki kriogenicznej bawełnianą końcówką na krótko zanurzoną w ciekłym azocie. Pobrano komórki jajnika, a frakcje komórkowe posortowano z pęcherzyków antralnych FACS do ponad 95% czystości.

CD99 specyficznie znakowane komórki ziarniste w PVRL1 lub nektyna były coraz bardziej zlokalizowane w przedziale komórkowym oophorus granulosa w miarę zwiększania się pęcherzyków antralnych. Zaobserwowano, że przeciwciała przeciwko endoglinowi lub CD55 specyficznie wyznaczały wszystkie komórki zrębu i osłonki oraz że aminopeptydaza alaninowa była specyficznie eksprymowana przez androgenowe komórki osłonki. Komórki znakowano przeciwciałem skierowanym przeciwko CD99 w celu identyfikacji komórek ziarnistych, a przeciwciała przeciwko CD45 zastosowano w celu wykluczenia komórek krwiotwórczych.

Przeciwciała przeciwko PVRL1 rozdzieliły populację komórek ziarnistych na przedziały ooforowe i ścienne. Po trawieniu enzymatycznym z dypazą kolagenazy, preparaty komórkowe znakowane przeciwciałami przeciwko CD55, CD34 i aminopeptydazie alaninowej umożliwiły wychwycenie wszystkich komórek zrębu lub osłonki lub androgenowych komórek osłonki z wyłączeniem komórek śródbłonka z populacji komórek osłonki. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zakłócić antrum mieszków włosowych podczas początkowej izolacji mieszków włosowych poprzez przecięcie w bezpiecznym marginesie wokół granic mieszków włosowych.

Po tej procedurze komórki mogą być wykorzystane do analizy molekularnej lub diagnostycznej lub alternatywnie hodowane in vitro do badań toksykologicznych, analizy eksperymentalnej lub rekapitulacji mikrośrodowiska mieszków włosowych. Do tej pory metody te wykorzystywano do modelowania zaburzeń endokrynologicznych obejmujących jajnik oraz do identyfikacji nowych subpopulacji komórek związanych z pęcherzykami.