Name: In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego z minimalnymi efektami off-target. Protokół wykorzystuje CRISPR/Cas9 i cytometrię przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica i Deborah Cipria za wspólny wysiłek nad rozwojem technologii wyciszania epigenetycznego przez te wszystkie lata; Dejan Lazarevic i Francesca Giannese za krytyczny przegląd analiz RNA-seq i MeDIP-seq opisanych w protokole. Prace te zostały wsparte grantami dla A.L. z Fundacji Telethon (grant TIGET nr F1) oraz unijnym programem Horyzont 2020 (UPGRADE). Ilustracje zostały stworzone za pomocą BioRender.com.
AUTHORS CONTRIBUTION 
A.M, M.A.C., F.G. i A.C. przyczynili się do zaprojektowania protokołu i napisania manuskryptu; S.V., I.M. i D.C. zaprojektowali sekcje bioinformatyczne protokołu i poprawili manuskrypt; A.M. i A.L. zaprojektowali protokół, opracowali i napisali rękopis przy udziale wszystkich autorów.

AL jest współzałożycielem, posiadaczem limitu i konsultantem firmy Chroma Medicine, Inc.

Ukierunkowane wyciszanie epigenetyczne może stanowić obiecujące rozwiązanie w leczeniu zaburzeń, które mogą skorzystać z trwałej inaktywacji genów, w tym chorób spowodowanych mutacjami wynikającymi ze wzmocnieniafunkcji1, chorób zakaźnych2 oraz patologii, w których wyciszenie jednego genu może albo zrekompensować dziedziczną wadę winnym3, albo uwolnić pełny potencjał adoptywnych terapii komórkowych4. Rozdział 5. Działając na poziomie chromatyny i będąc automatycznie propagowanym przez komórkę 7,30,32, wyciszanie epigenetyczne może uniknąć toksycznych zmian (np. rearanżacji chromosomów) sekwencji DNA genu docelowego i częściowego, przejściowego wyciszenia celu, które są ograniczeniami odpowiednio rozerwania genu opartego na sztucznej nukleazie 8,34,35 i knockdownu opartego na RNAi33.
Jednym z kluczowych wstępnych kroków w każdym epigenetycznym protokole wyciszania jest zidentyfikowanie właściwej pozycji na genie docelowym, aby skierować ETR, które zdeponują represyjne znaki epigenetyczne niezbędne do wyłączenia aktywności transkrypcyjnej celu. Różne elementy regulatorowe miejsca rozpoczęcia transkrypcji - proksymalne i dystalne mogą się zgadzać, aby wspierać wyjście transkrypcyjne danego ludzkiego genu54. Co więcej, dzięki rosnącej liczbie programowalnych technologii wiązania DNA można obecnie zidentyfikować różne miejsca docelowe dla każdego określonego elementu regulacyjnego6. W związku z tym protokoły, takie jak ten opisany tutaj w zmodyfikowanych liniach komórkowych, mogą być wykorzystywane do wyznaczania poszczególnych miejsc docelowych i / lub regionów genomu podatnych na wyciszanie epigenetyczne za pośrednictwem ETR, przed rozpoczęciem uciążliwych i czasochłonnych wysiłków ewaluacyjnych najlepszych kandydatów w ostatecznym środowisku terapeutycznym. Niektóre krytyczne aspekty protokołu opisano bardziej szczegółowo poniżej.
Inżynieria reporterowej linii komórkowej predykcyjnej ostatecznego celu terapeutycznego Pomimo ciągłej optymalizacji protokołów inżynierii komórkowej – wymaganych do wprowadzenia kodowania kasety dla reportera fluorescencyjnego do genu docelowego i dostarczenia ETR – nie można przyjąć za pewnik, że mogą one być już dostępne dla linii komórkowej, która najbardziej przypomina ostateczny cel terapeutyczny. W takim przypadku można zastosować różne strategie łagodzące: a) korzystając z zestawów optymalizacyjnych dostarczonych przez dostawców w celu optymalizacji protokołu transfekcji dla docelowej linii komórkowej; b) przejście na inne linie komórkowe nadal wykazujące ekspresję tego genu docelowego, ale należące do tkanek innych niż ostateczny cel terapeutyczny - dla których protokoły inżynieryjne zostały znacznie zoptymalizowane. W przypadku, gdy te opcje nie są dostępne, można rozważyć przejście na pierwotne typy komórek lub organoidy reprezentujące ostateczny cel. Jako ogólne rozważania zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i zastosowaniach terapeutycznych wyciszania epigenetycznego opartego na ETR, należy odrzucić scenariusze, w których gen docelowy jest niezbędny dla docelowego typu komórki. Pełne, długotrwałe wyciszenie niezbędnego genu narzucone przez ETR doprowadzi z czasem do kontrselekcji komórek docelowych (i potencjalnie do toksyczności leczenia). W takich przypadkach preferowane są alternatywne technologie zapewniające częściowe zniesienie celu, takie jak RNAi33.
Ocena celowej skuteczności wyciszania ETR ETR oparte na kombinacji domen efektorowych KRAB, DNMT3A i DNMT3L okazały się skuteczne przeciwko zdecydowanej większości genów kodujących białka, z szerokim oknem docelowym o długości około 1 kilozasady, wyśrodkowanym w miejscu rozpoczęcia transkrypcji32. Aby zorientować się, jak wygląda dobrze przeprowadzony eksperyment wyciszania epigenetycznego, poniżej przedstawiono szczegóły techniczne i wyniki wyciszania genu B2M w komórkach K-562. Można to uznać za ważną kontrolę pozytywną, która powinna zostać uwzględniona nie tylko przez badaczy pracujących z komórkami K-562, ale także przez tych, którzy po raz pierwszy zbliżają się do technologii opartej na ETR. Jak stwierdzono w protokole, przerwanie genu oparte na sztucznej nukleazie (np. CRISPR/Cas9) jest zalecane jako dodatkowa kontrola zarówno skuteczności dostarczania genów w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania, jak i fenotypu komórek pozbawionych genu docelowego. Po wstępnym badaniu przesiewowym gRNA, które mają być sprzężone z ETR opartymi na CRISPR/dCas9, jeśli żadne z badanych gRNA nie jest w stanie trwale wyciszyć docelowego genu, należy rozważyć, w następującej kolejności: 1) zwiększenie ilości dostarczanych gRNA i ETR; 2) testowanie pul najlepszych gRNA w poszukiwaniu efektów synergicznych między nimi. Jeśli nadal nie zostanie osiągnięte długoterminowe wyciszenie, należy rozważyć: 3) przetestowanie dodatkowych gRNA, które mogą być ukierunkowane na miejsca bardziej odpowiednie do instruowania wyciszania epigenetycznego; 4) przejście na platformy DBD oparte na ZFP8 lub TALE9, które mogą mieć lepszą zdolność wiązania z chromatyną docelową; 5) przejście z stanu przejściowego na stabilny - na przykład integracja ekspresji ETR opartej na wektorach wirusowych (konstrukty fuzyjne gRNA lub dCas9, lub oba te konstrukty przy zastosowaniu technologii CRISPR/dCas9). Ponieważ nasza grupa opracowała i ma solidne doświadczenie w tym zakresie we wspólnym dostarczaniu trzech oddzielnych ETR30, protokół i przedstawione tutaj wyniki opierają się na tym podejściu. Jednak podobny koncepcyjny przepływ pracy można prawdopodobnie zastosować do systemu opartego na CRISPR typu "wszystko w jednym"32.
Ocena niezgodnej z celem działalności ETR Liczne badania wykazały wstępne wskazania in vitro dotyczące swoistości ETR w oparciu o kombinację domen efektorowych KRAB, DNMT3A i DNMT3L 30,31,32. Jeśli jednak spośród badanych gRNA żadne z nich nie wykazuje zadowalającego profilu swoistości w zakresie regulacji transkrypcji i/lub metylacji DNA de novo, można zastosować dwie niewykluczające się wzajemnie strategie: a) skrócenie czasu przebywania ETR wewnątrz komórki (a w konsekwencji ich potencjalnej aktywności poza celem) poprzez zmniejszenie dawek ETR lub przetestowanie alternatywnych systemów dostarczania. Na przykład, w porównaniu z plazmidami, oczekuje się, że zarówno dostarczanie mRNA, jak i białka skróci czas ekspozycji komórek na ETR, a co za tym idzie, prawdopodobieństwo aktywności poza celem55; b) przejście na nowsze warianty Cas9, zoptymalizowane w celu zmniejszenia wiązania platformy56 poza celem, lub na alternatywne technologie wiązania DNA oparte na ZFP8 lub TALE9. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że w porównaniu z próbkami poddanymi próbie, na aktywność wyciszania genów w miejscu docelowym i poza nim ma wpływ nie tylko wiązanie DBD z sekwencją docelową, ale także potencjalna zdolność epigenetycznych domen efektorowych do rekrutacji do innych loci przez ich naturalne, endogenne kofaktory. W związku z tym skrócenie czasu przebywania ETR w komórce docelowej może zmniejszyć nie tylko prawdopodobieństwo wiązania DBD z miejscami poza celem, ale także prawdopodobieństwo, że ETR będą wchodzić w interakcje z endogennymi kofaktorami, co może przynieść korzyści pod względem swoistości i wady pod względem aktywności docelowej. Wreszcie, w porównaniu z próbkami poddanymi próbie, niektóre z transkrypcyjnych i mniej prawdopodobnych zmian metylacji CpG mierzonych w wyciszonych komórkach można po prostu uzyskać przez pozbawienie docelowego genu. Nie są one uważane za niezgodne z technologią wyciszania. Aby je zidentyfikować, należy również uwzględnić w panelu eksperymentalnymzaburzenia genów przez sztuczną nukleazę 8,9,10. Zmiany biologiczne spowodowane funkcjonalną utratą genu docelowego będą wspólne dla wyciszania epigenetycznego i tej alternatywnej technologii.

Inaktywacja genów tradycyjnie odgrywała kluczową rolę w badaniu funkcji genów zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych. Co więcej, w ciągu ostatnich dwóch dekad, wraz z rozwojem terapii genowej, została ona zaproponowana jako potencjalnie przełomowe podejście do leczenia chorób spowodowanych mutacjami powodującymi wzmocnienie funkcji1, infectious diseases2, czyli patologie, w których wyciszenie jednego genu może zrekompensować dziedziczną wadę u innego3. Wreszcie, zaproponowano genetyczną inaktywację kluczowych regulatorów sprawności komórek i kontroli funkcjonalnej w celu zwiększenia skuteczności produktów komórkowych w immunoterapii nowotworów4 i medycyna regeneracyjna5.
Wśród różnych technologii do inaktywacji genów, jedną z najbardziej obiecujących jest ukierunkowane epigenetyczne wyciszanie6,7. U podstaw tej technologii leżą tak zwane inżynieryjne represory transkrypcyjne (ETR), chimeryczne białka składające się z programowalnej domeny wiążącej DNA (DBD) i domeny efektorowej (ED) o epigenetycznej funkcji represyjnej. Białka palca cynkowego (ZFPs)8, efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEs)9, lub DBD oparte na CRISPR/dCas9<sup="xref">10 mogą być zaprojektowane tak, aby selektywnie wiązać ED z sekwencją promotora/wzmacniacza docelowego genu, który ma zostać wyciszony. Po dotarciu na miejsce, ED ETR wykonuje swoją aktywność wyciszającą, nakładając represyjne znaczniki epigenetyczne indukujące heterochromatynę, takie jak modyfikacje histonów (H3K911,12 lub H3K2713 metylacja, deacetylacja H3 lub H414) i metylacja DNA CpG15, zgodnie z użytą domeną represyjną.
W szczególności, zainspirowany molekularnymi procesami permanentnej represji transkrypcyjnej endogennych retrowirusów występujących w preimplantacyjnym embryo16, wygenerowano kombinację trzech ETR w celu wykorzystania następujących ED: i) domena pola związanego z Krüppelem (KRAB) ludzkiego ZNF10; (ii) domena katalityczna metylotransferazy 3A de novo DNA człowieka (DNMT3A); oraz iii) metylotransferaza 3-podobna do ludzkiego DNA na pełnej długości (DNMT3L). KRAB jest konserwatywną domeną represyjną współdzieloną przez kilka ZFP u wyższych kręgowców17,18, którego działanie wyciszające opiera się głównie na zdolności do rekrutacji KAP119-białko rusztowania, które następnie oddziałuje z kilkoma innymi induktorami heterochromatyny20-zawierający kompleks przebudowy i deacetylacji nukleosomów (NuRD)21, metylotransferaza histonów H3K9 SETDB122, oraz czytnik metylacji H3K9 HP123,24, między innymi.
DNMT3A aktywnie przenosi grupy metylowe na DNA w sekwencjach CpG25. Aktywność katalityczna DNMT3A jest wzmocniona przez jego fizyczne powiązanie z DNMT3L, paralogiem DNMT3A ograniczonym do zarodka i komórek rozrodczych, pozbawionym domeny katalitycznej odpowiedzialnej za transfer grup metylowych26,27. Metylacja DNA w regionach bogatych w CpG - określanych jako wyspy CpG (CGI) - osadzonych w elementach promotora/wzmacniacza genów ssaków jest zwykle związana z wyciszaniem transkrypcji28. Co ważne, po zdeponowaniu, metylacja CpG może być stabilnie dziedziczona podczas mitozy przez kompleks molekularny oparty na UHRF1-DNMT129.
Stabilna nadekspresja ETR-ów w komórce docelowej może być problematyczna, prawdopodobnie z powodu rosnącego ryzyka aktywności niezamierzonej i wypierania endogennych interaktorów z ich fizjologicznych miejsc docelowych w miarę upływu czasu. Jednak przejściowa ekspresja pojedynczych ugrupowań ETR może nie wywołać długotrwałego wyciszenia z wysoką skutecznością30, utrudniając ich zastosowanie terapeutyczne. W związku z tym przełomem w tej dziedzinie był dowód na to, że połączenie trzech ETR opartych na KRAB, DNMT3A i DNMT3L może synergizować i, nawet jeśli są tylko przejściowo współdostarczane, narzucać sekwencję promotorową docelowego genu H3K9 i metylację CpG. Są one następnie odczytywane i rozmnażane przez komórkę podczas mitozy, co prowadzi do dziedzicznego wyciszenia w wielu ludzkich i mysich liniach komórkowych, a także w komórkach pierwotnych hodowanych ex vivo30.
Warto zauważyć, że epigenetyczne wyciszenie narzucone przez ETR może zostać cofnięte na żądanie przez celowe (np. rekrutacja demetylazy DNA TET1 opartej na CRISPR/dCas9 na wyciszone locus) lub farmakologiczne (podanie inhibitora metylotransferazy DNA 5-Aza) demetylacji DNA30, potencjalne antidotum w przypadku zdarzeń niepożądanych związanych z ETR. Opisano również uniwersalne ETR-y zawierające trzy ED-y oparte na KRAB, DNMT3A i DNMT3L, wykazujące znaczną skuteczność wyciszania w liniach komórkowych31,32 w stosunku do zdecydowanej większości genów kodujących białka. Co więcej, w kilku badaniach z zastosowaniem ETR stwierdzono wysoki profil bezpieczeństwa, bez istotnej aktywności niezgodnej z celem w zakresie metylacji de novo CpG lub zmiany dostępności chromatyny30,31,32. Przed zastosowaniem klinicznym zaleca się jednak przeprowadzenie dedykowanej analizy profilu swoistości ETR wyposażonych w nowo zaprojektowany DBD.
Z klinicznego punktu widzenia, ukierunkowane wyciszanie epigenetyczne może przynieść kluczowe korzyści zarówno dla knockdownu opartego na interferencji RNA (RNAi)33, jak i sztucznego zakłócenia genów opartego na nukleazie8. W przeciwieństwie do RNAi, ukierunkowane wyciszanie epigenetyczne może powodować pełne zniesienie celu na komórkę i nie wymaga okresowego leczenia w celu zapewnienia długotrwałego wyciszenia; w przeciwieństwie do rozerwania genu, pozostawia sekwencję DNA niezmienioną, unikając generowania pęknięć dwuniciowych DNA (DSB). DSB mogą następnie indukować apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego, potencjalnie prowadząc do selekcji przeciwko komórkom z funkcjonalnym szlakiem p5334,35 i, szczególnie w ustawieniach edycji genów multipleksowych, rearanżacje chromosomów35. Ponadto, przekazując nieodwracalny wynik mozaiki naprawy DSB za pośrednictwem niehomologicznego łączenia końców DNA36, zakłócenie genu nie może uniknąć naprawy celu w ramce do funkcjonalnych sekwencji kodujących jako jednego z końcowych wyników i, w przeciwieństwie do wyciszania epigenetycznego, nie może zostać usunięte na żądanie.
Wreszcie, wyciszanie epigenetyczne ma potencjał, aby poszerzyć zakres docelowych elementów genetycznych do klas całkowicie lub przynajmniej częściowo opornych na RNAi i zakłócenia genów, takich jak nietranskrybowane elementy regulatorowe i niekodujące RNA30,32. Pierwszym krytycznym krokiem dla każdego ukierunkowanego zastosowania wyciszania epigenetycznego jest zaprojektowanie panelu ETR obejmującego różne sekwencje regulatorowe genu docelowego i zidentyfikowanie tych najbardziej wydajnych. Liczba ETR-ów do przetestowania może być kluczowa, biorąc pod uwagę rosnącą część genomu, która może być celem programowalnych technologii wiązania DNA, które są stale rozwijane37. Przeprowadzenie badań przesiewowych ETR bezpośrednio na typie komórki, w którym można by terapeutycznie wyciszyć gen docelowy, stanowiłoby najodpowiedniejszą opcję. Jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe mogą być technicznie kłopotliwe w komórkach pierwotnych ze względu na ich ograniczoną przeżywalność w hodowli i często nieoptymalną zdolność inżynieryjną. Ekrany na dużą skalę mogą być jeszcze bardziej niewykonalne in vivo.
Bardziej praktyczna alternatywa polega na przeprowadzeniu wstępnego badania przesiewowego dużego panelu ETR-ów w łatwych do inżynierii liniach komórkowych, a następnie walidacji tylko tych najbardziej obiecujących w terapeutycznie istotnym typie komórki. Równoległą kwestią jest dobór odpowiedniego odczytu do pomiaru skuteczności wyciszania ETR-ów. Bezpośrednia ocena poziomów transkryptu lub białka docelowego genu za pomocą RT-qPCR, western blot lub ELISA może być kosztowna i czasochłonna oraz może nie mieć wystarczającej czułości, co ogranicza ich zastosowanie w skalach wysokoprzepustowych. Generowanie ad hoc zmodyfikowanych linii komórek reporterowych, w których fluorofor jest umieszczany pod kontrolą transkrypcyjną sekwencji regulatorowych genu docelowego, pozwala na wykorzystanie podejścia opartego na cytometrii przepływowej do odczytu wyciszenia epigenetycznego na poziomie pojedynczej komórki i w tempie wysokiej przepustowości.
Zgodnie z tymi ogólnymi rozważaniami, ten artykuł opisuje protokół składający się z in vitro uporządkowanego ekranu ETR dla skuteczności wyciszania na celu, a następnie oceny aktywności poza celem w całym genomie najlepszych trafień. Taki przebieg pracy pozwala na zredukowanie początkowego repertuaru potencjalnych ETR-ów do krótkiej listy obiecujących, których złożoność jest odpowiednia do ich ostatecznej oceny w terapeutycznie istotnym typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania.
Wśród różnych programowalnych DBD, które mogą być wykorzystane do generowania ETR, ten protokół skupi się na technologii opartej na CRISPR/dCas9, ze względu na łatwość projektowania gRNA obejmujących promotor docelowego genu w skali wysokoprzepustowej. Jednak ten sam koncepcyjny przepływ pracy opisany poniżej można zastosować do oceny wydajności i specyfiki ETR wyposażonych w inne DBD.

<table><tbody><tr><td>4200 System TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X Unit</td><td>Lonza Bioscience&nbsp;</td><td>AAF-1003X</td><td>Nukleofekcja</td></tr><tr><td>B2M wyciszanie gRNA #1&nbsp;</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>GCAATCAGGACAAGGCCCGC</td><td>Wyciszanie genów</td></tr><tr><td>B2M wyciszanie gRNA #2</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>GGGGTAGGAGAGACTCACGC</td><td>Wyciszanie genów</td></tr><tr><td>B2M wyciszanie gRNA #3</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>GAGTCCAGGGCTGGATCTCG</td><td>Wyciszanie genów</td></tr><tr><td>BD FACSAria Cytometr przepływowy fuzyjny</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion</td><td>Narzędzia do sortowania komórek aktywowane fluorescencją</td></tr><tr><td></td><td>Narzędzia do spania</td><td>http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td> <td>Przetwarzanie interwałów genomowych</td></tr><tr><td>bwa</td><td>Ih3</td><td>https://github.com/lh3/bwa</td><td>Wyrównanie MeDIP-seq brzmi</td></tr><tr><td>Chopchop&nbsp;</td><td>Laboratorium Valena</td><td>http://chopchop.cbu.uib.no/</td> <td>oprogramowanie do selekcji gRNA</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x z L-glutaminą</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>cqn</td><td>Bioconductor</td><td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html</td><td>Normalizacja regionalna za pomocą</td></tr><tr><td>pakietu projektowego CRISPR</td> z <td>zawartością GC Laboratorium Zhanga</td><td>https://zlab.bio/resources-2</td><td>przewidywanie wiązania gRNA poza celem&nbsp;</td></tr><tr><td>Addgene plazmidu CRISPRoff-v2.1</td><td>&nbsp;</td><td>167981</td> Cytometr przepływowy <td>wyciszający geny</td></tr><tr><td>CytoFLEX S V4-B4-R3-I2&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>C01161</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Sekwencja matrycy dawcy do integracji tdTomato w pierwszym intronie genu B2M</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td> ctcctcctgacctgtttttt actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc agtaactggttgagcaaattcaaattcaaacccagc ctgtctgatacttgtcctctc ttcttagaaaagattac agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct caaacagagagttccaggcaggatgaatgaatctgt gctctgatccctgaggcatttaatattttcttatta ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagctctct tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttctct cttcctcccacagggataactagatgactcgag ggatccgaattcctgcaggccccgacgagggc cggcgccgggcgggctacgtattccgc cccccccccccccctctcctaac gttactggccgaagccgcttggaataaaggccg gtgtgcttttgtctattattattttccaccatattgc cgtcttttggcaatgtgagggggaaacct ggcccttcttgacgagcattcctagggg tctttcccctcgccaaaggaatgcaaggtc tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc gaccctttgcaggcagcagcggaaccccccacctg gcgacaggtgcctctgcggaagccacacg gcgacaggtgcctctgccaagccacgbr/ cccagtgccacgttgttgtggagatagttgggga aagagtcaaatggctctcctcaagcgtcaac aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc attgtatgggatgatgcccagaaggtaccccbr/ attgtatgggatctggggtgcaca tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaaacg tctaggccccccgaaccacggacggtttt cctttgaaaaacgatgatgataatatggccacaa ccatggtgagcaagggcgaggagcatcaa agagttcatgcgcttcaaggtggcatggaggg < ctccatgaacggggccacgagttcgagatcgagggbr/> cgagggcgaggggcctacgagggcac ccagaccgccaagctgaagggtgaccaaggg cggcccccttctgggacatcctgtc cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag aagctgtccttccccgagcttcaagtgggg cgcgtgatgaacttcgaggacggggtgtggtg accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg agcgcctgtaccacccccgccgcgtgctgaa gggcgagatccaccaggctgaagctgaa<br/br/> ggacggcggactacctggtggagttcaag Accatctacatggccaagaagcccgtgcaac tgcccggctactacgtggacacaagctg gacatcacctcccacacaacgaggactacacca tcgtggaacagtacgagcgctccgagggggg ccaccaccttcctggggcatggcaccggca gcaccggcagcggcaggg ctccggcaccgcctc ctccgaggacacaacaacatggccgtcatcaaa gagttcatgcgcttcaaggtgccatggaggg ctccatgaacggccacgagttcgagatcga gggcgaggggcccccctacgag ggcacccagaccgccaagctgaagggac caagggcggccccctgcccttcgcctggg atcctgtccccccagcatgtacggctccaaa ggcgtacgtgaagcaccgccgacatcccc gattacaagaagctgtccttccccccgagggcttc aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggagac<br/ aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacbr/ > ggcggtctggtgaccgaccgacccaggactcct ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga cggccccgtaatgcagaagaagaagaccatggg ctgggaggtcctccaccgagcgcctgtaccacc cgcgacgtgctgaagggatccac caggccctgaagctgaaggacggcggc ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc caagaagcccgtgcaactgcccggctact acgtggacaccaagctggacatcacctccca caacgagaggaaccaagctggcaccccabr/ caacgaga" ggactacaccatcgtggaacagtac gagcgctccgagggccccccaccttcctct gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg ccgcgtcgacctgccttgccccatc tgttgtttgcccctcccctc ggaaggtgccactccccactgtcctttcctaataa aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg tgtcattctattctgggggg gacagcaagggattgggaagacaat agcaggcatgctggatggggctctat ggcttaagtgatggggctagcctttccttaa tgatagggtttctagagagatatatctggtca aggtggcctggtcccccacagc ctcccagagaaggagtagctgccttttag tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaatttaa><a aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat ttagtagcactaacacttctctccattttcaatga aaaatatagagtttataatttcttcccacttc cccatggatggttctcattttgg aaagtactttctgaaacattaggcaatatatt cccaacctggctagtttacagcaactgca </td><td>Inżynieria genetyczna</td></tr><tr><td>E220 Ultradźwiękowy</td><td>Covaris</td><td>500239</td><td>Sonikacja DNA</td></tr><tr><td>edgeR</td><td>Bioconductor</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td><td>Różnicowe badanie liczebności</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania mutacji EnGen</td><td>NEB</td><td>E3321</td><td>Kwantyfikacja zaburzeń genów</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td>Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, fioletowy (6x)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td>Ładowanie żelu DNA</td></tr><tr><td>Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7401</td><td>Amplifikacja</td></tr><tr><td>PCR Sekwencja gRNA do integracji dTomato w pierwszym intronie genu B2M</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>AGGCTACTAGCCCCATCAAG</td><td>Inżynieria genetyczna</td></tr><tr><td>plazmid hCas9</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>41815</td><td>Inżynieria genetyczna</td></tr><tr><td>Odczynniki D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Taśma ekranowa o wysokiej czułości D1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Taśma ekranowa RNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>Kwantyfikacja RNA</td></tr> Drabinka taśmowa o <tr><td>wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-5581</td><td>Kwantyfikacja RNA</td></tr><tr><td>Bufor do próbek RNA ScreenTape o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-5580</td><td>Kwantyfikacja RNA</td></tr><tr><td>Zestaw IPure</td><td>Diagenode</td><td>C03010011&nbsp;</td><td>Oczyszczanie produktu immunoprecypitacji 5-metylocytozyny</td></tr><tr><td>Ogniwa K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>Inżynieria komórkowa</td></tr><tr><td>Zestaw kwantyfikacyjny biblioteki KAPA</td><td>Roche</td><td>KK4824</td><td>Przygotowanie bibliotek MeDIP-Seq</td></tr><tr><td>MACS2</td><td>Taoliu</td><td>https://github.com/macs3-project/MACS</td><td>Identyfikacja regionów wzbogaconych metylem</td></tr><tr><td>Zestaw MagMeDIP</td><td>Diagenode</td><td>C02010020&nbsp;</td><td>Immunoprecypitacja 5-metylocytozyny</td></tr><tr><td>NastępnyZestaw Methylseq 1&nbsp;</td><td>Bioo Scientific</td><td>5118-01</td><td>Przygotowanie bibliotek MeDIP-Seq</td></tr><tr><td>NextSeq 500 / NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002 / 20012850</td> Zestaw do <td>sekwencjonowania nowej generacji</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi do transfekcji plazmidu DNA</td><td>Macherey-nagel</td><td>740410.50</td><td>Preparat plazmidu Midiprep</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny&nbsp; komórki&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C404010</td><td>Transformacja plazmidu</td></tr><tr><td>pAC154-dual-dCas9VP160-sgAddgen plazmidu ekspresji</td><td>&nbsp;</td><td>48240</td><td>Aktywacja genu</td></tr><tr><td>pcDNA.CMV.dCas9:plazmid KRAB</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>dostępne na zamówienie (lombardo.angelo@hsr.it)</td><td>Wyciszanie genów</td></tr><tr><td>pcDNA.CMV.dCas9:Plazmid KRAB</td><td>Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>dostępne na zamówienie (lombardo.angelo@hsr.it)</td><td>Wyciszanie genów</td></tr><tr><td>pcDNA.CMV.dCas9:plazmid KRAB</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>dostępne na zamówienie (lombardo.angelo@hsr.it)</td><td>Wyciszanie genów</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>plazmid phU6.sgRNA</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>53188</td><td>Inżynieria genetyczna</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Sekwencja przednia startera w celu sprawdzenia integracji tdTomato w pierwszym intronie genu B2M</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>GTATTTGCTGGTTATGTTAG</td><td>Odwrotna</td></tr><tr><td>sekwencja elementarza inżynierii genetycznej w celu sprawdzenia integracji tdTomato w pierwszym intronie genu B2M</td><td>&nbsp; Laboratorium Lombardo&nbsp;</td><td>AATGGTTGAGTTGGAC</td><td>Inżynieria genetyczna</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33238</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS (wysoka czułość) Zestaw testowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS (wysoka czułość) Zestaw testowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32852</td><td>Kwantyfikacja RNA</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>Trawienie DNA</td> <td>NEB</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Mini&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Rsubread</td><td>Bioconductor</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html</td><td>Kwantyfikacja ekspresji genów</td></tr><tr><td>Linia komórkowa SF 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza Bioscience&nbsp;</td><td>V4XC-2032</td><td>Nucleofection</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com/</td> <td>Oprogramowanie do projektowania biologii molekularnej</td></tr><tr><td>STAR</td><td>Alexander Dobin</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td>Wyrównanie sekwencji RNA odczytuje</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td>amplifikację PCR</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td>Ligacja DNA</td></tr><tr><td>TAE Buffer</td><td>Fisher BP1332500 naukowy</td><td></td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA kit&nbsp;</td><td></td><td>Przygotowanie biblioteki Illumina 20020597 RNA-Seq</td><td></td></tr> <tr><td>UltraPure</td><td>Agaroza ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Żel agarozowy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Inaktywacja genów jest kluczowa dla badania funkcji genów i stanowi obiecującą strategię leczenia szerokiego zakresu chorób. Wśród tradycyjnych technologii, interferencja RNA cierpi z powodu częściowego zniesienia celu i konieczności leczenia przez całe życie. W przeciwieństwie do tego, sztuczne nukleazy mogą narzucać stabilną inaktywację genów poprzez indukcję pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB), ale ostatnie badania kwestionują bezpieczeństwo tego podejścia. Ukierunkowana edycja epigenetyczna za pomocą zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) może stanowić rozwiązanie, ponieważ pojedyncze podanie określonych kombinacji ETR może prowadzić do trwałego wyciszenia bez wywoływania pęknięć DNA.
ETR to białka zawierające programowalną domenę wiążącą DNA (DBD) i efektory z naturalnie występujących represorów transkrypcji. W szczególności wykazano, że połączenie trzech ETR wyposażonych w domenę KRAB ludzkiego ZNF10, domenę katalityczną ludzkiego DNMT3A i ludzkiego DNMT3L, indukuje dziedziczne represyjne stany epigenetyczne w genie docelowym ETR. Charakter tej platformy typu "uderz i uciekaj", brak wpływu na sekwencję DNA celu oraz możliwość powrotu do stanu represyjnego poprzez demetylację DNA na żądanie, sprawiają, że wyciszanie epigenetyczne jest narzędziem zmieniającym zasady gry. Kluczowym krokiem jest identyfikacja właściwej pozycji eTR w genie docelowym, aby zmaksymalizować wyciszenie na celu i zminimalizować wyciszenie poza celem. Wykonanie tego etapu w końcowych warunkach przedklinicznych ex vivo lub in vivo może być uciążliwe.
Biorąc pod uwagę system CRISPR/katalitycznie martwy Cas9 jako paradygmatyczny DBD dla ETR, ten artykuł opisuje protokół składający się z badania in vitro przewodnikowych RNA (gRNA) sprzężonych z kombinacją potrójnego ETR w celu skutecznego wyciszania na celu, a następnie oceny profilu specyficzności dla całego genomu najlepszych trafień. Pozwala to na zredukowanie początkowego repertuaru potencjalnych gRNA do krótkiej listy obiecujących, których złożoność jest odpowiednia do ich ostatecznej oceny w terapeutycznie istotnym otoczeniu będącym przedmiotem zainteresowania.

Po dostarczeniu matrycy donora dla integracji reportera fluorescencyjnego w locus docelowym za pomocą rekombinacji homologicznej sprzężonej z systemem CRISPR/Cas9 (np. poprzez nukleofekcję plazmidową w przypadku komórek K-562), w badanej próbce pojawiają się komórki wykazujące ekspresję reportera (Rysunek 1, dół). Jeśli tak się nie stanie, należy ponownie sprawdzić poprawność projektu i klonowania zarówno matrycy donora, jak i odczynników CRISPR/Cas9. Po potwierdzeniu ich poprawności należy podjąć próbę optymalizacji dawek odczynników oraz samego protokołu dostarczania.
Po uzyskaniu linii komórkowej reporterowej należy wybrać sekwencje promotora/enhancera genu docelowego i zaprojektować panel dopasowanych gRNA. Należy użyć in silico narzędzia predykcyjne, takie jak Chopchop, służące zarówno do identyfikacji sekwencji gRNA, jak i do ich szeregowania pod względem przewidywanej wydajności oraz specyficzności (Rysunek 2). Jeśli nie uda się uzyskać żadnych gRNA, należy sprawdzić obecność kanonicznego motywu PAM (protospacer adjacent motif) dla białka Cas9 (5'-NGG-3') w sekwencji docelowej. W przypadku braku sekwencji PAM należy rozważyć przejście na ETR opracowane na podstawie alternatywnych wariantów Cas9 niezależnych od PAM (do tej pory nie opublikowano ETR opartych na tych wariantach) lub zmianę platformy domeny wiążącej DNA na alternatywną, taką jak ZFPs.53 lub TALEs30Jednakże, jeśli zostaną pobrane wyłącznie gRNA o niskiej przewidywanej skuteczności/specyficzności, należy rozważyć albo 1) przetestowanie tych niskiej jakości gRNA, albo 2) rozszerzenie docelowej sekwencji DNA w celu poszukiwania lepszych gRNA. Po przejściowej dostawie potrójnej kombinacji ETR (lub CRISPRoff; v2.1) wraz z gRNA, należy przeprowadzić podłużne analizy cytometryczne w celu oceny ekspresji reportera fluorescencyjnego, obserwując często szczyt represji reportera w analizach doraźnych, który następnie zostaje przynajmniej częściowo zniesiony ze względu na rozcieńczenie mitotyczne plazmidów kodujących ETR w czasie (Rysunek 4C). Jeśli kombinacja ETRs/gRNA skutecznie wprowadzi metylację CpG w obrębie locus docelowego, dojdzie do trwałej represji raportera w znacznej frakcji leczonych komórek (Rycina 4C). Różne gRNA mogą wykazywać zmienną efektywność długoterminowego wyciszania (Rysunek 4B,C).
W celu przeprowadzenia oceny specyficzności w całym genomie należy zastosować metodę MeDIP-seq, aby zidentyfikować obszary o różnym stopniu metylacji pomiędzy komórkami, w których cel został poddany długoterminowemu wyciszeniu, a komórkami niepoddanymi traktowaniu. W idealnym przypadku wysoce specyficzne gRNA indukuje jedynie pik metylacji CpG de novo w miejscu docelowym (Rysunek 5). W przeciwnym razie można rozważyć charakterystykę aktywności poza-celowej (off-target) gRNA, które zajmują niższe pozycje na liście efektywności celowania.
<img alt="Schemat edycji genów za pomocą CRISPR z HDR; zawiera wyniki cytometrii przepływowej dla ekspresji tdTomato." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Integracja reporteru tdTomato pod elementy regulacyjne ludzkiego genu B2M poprzez naprawę kierowaną homologią. Góra: Schemat strategii integracji fluorescencyjnego reporteru tdTomato w pierwszym intronie ludzkiego genu B2M za pomocą naprawy kierowanej homologią indukowanej przez CRISPR/Cas9. Dół: reprezentatywne wykresy kropkowe komórek K-562 przed i po integracji reporteru tdTomato w pierwszym intronie genu B2M. Skróty: HA = ramię homologii; HDR = naprawa kierowana homologią; IRES = wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu; pa = BGH poly(A); SA = miejsce akceptora splicingowego; WT = typ dziki; 3XSTOP = trzy tandemowe kodony stop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozkład sekwencji CRISPR sgRNA; wykres dopasowania; analiza danych dotyczących lokalizacji genomowej i zawartości GC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: In silico identyfikacja gRNA celujących w wyspę CpG genu B2M, uszeregowana pod kątem przewidywanej wydajności i swoistości.Interfejs wyjściowy programu Chopchop przedstawiający gRNA celujące w wyspę CpG osadzoną w sekwencji promotora genu B2M, uszeregowane zarówno pod kątem liczby sekwencji off-target z 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) lub 3 (MM3) niedopasowaniami, jak i przewidywanej wydajności on-target. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat edycji genów z nukleofekcją plazmidu CRISPR/dCas9 i procesem przesiewania w układzie macierzowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Klonowanie i nukleofekcja w układzie macierzowym gRNA dla wyciszania epigenetycznego za pośrednictwem dCas9 ETR. Góra: klonowanie protospacerów za pomocą oligonukleotydów do plazmidu wykazującego ekspresję ludzkiego U6-gRNA. Dół: przesiewanie w układzie macierzowym gRNA celujących w B2M w celu wyciszenia epigenetycznego opartego na CRISPR/dCas9 poprzez nukleofekcję plazmidową w komórkach K-562B2M/tdTomato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu edycji genów; knockout B2M w komórkach K-562; cytometria przepływowa, wyniki CRISPR-dCas9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Przesiewanie gRNA skutecznie indukujących długotrwałe wyciszenie B2M gen (A) Góra: schematy B2MtdTomato gen przedstawiony w powiększonym obszarze, względna kolejność i orientacja wiązania kompleksów ETR opartych na dCas9 z gRNA. Na dole: reprezentatywne wykresy kropkowe dla B2MtdTomato Komórki K-562 przed (lewo) lub po (prawo) wyciszeniu ETR. Analizy wykonano 30 dni po transfekcji plazmidami kodującymi gRNA oraz kombinacją trzech białek dCas9:KRAB + dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Aktywność wyciszająca wskazanych gRNA (zarówno w pulach, jak i jako pojedyncze gRNA) nakierowanych na wyspę CpGของ B2M (czerwone strzałki na górnym schemacie wskazują orientację gRNA) w komórkach K-562 B2MtdTomato komórki w 30. dniu po transfekcji. Dane przedstawiają odsetek komórek tdTomato-ujemnych (średnia ± SEM; n = cztery niezależne transfekcje dla każdego warunku traktowania). (C) Analiza przebiegu czasowego B2MtdTomato komórki K-562 po transfekcji plazmidami wykazującymi potrójną kombinację ETR oraz wskazanymi B2M gRNA celujące w wyspy CpG lub mock (transfekcja bez gRNA i ETR). Dane przedstawiają odsetek komórek negatywnych pod względem tdTomato (średnia ± SEM; n = trzy niezależne transfekcje dla każdego warunku traktowania). Dane nieopublikowane. Panele A i B opracowano na podstawie Amabile i wsp.30Skróty: CGI = wyspa CpG; IRES = wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu; pa = poli(A) BGH; SA = miejsce akceptorowe splicingu; SD = miejsce donorowe splicingu; TSS = miejsce startu transkrypcji; UT = nieprzetransfekowane; 3XSTOP = 3 tandemowe kodony stop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wyciszania genów; diagram z wykresem punktowym, wykresem kołowym, TSS; badanie B2M-IRES-tdTomato." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza specyficzności ETR w całym genomie za pomocą RNA-seq i MeDIP-seq. Po lewej: porównanie poziomów ekspresji w komórkach B2MtdTomato K-562 traktowanych kontrolnie (mock) oraz w komórkach traktowanych potrójną kombinacją ETR dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L wraz z gRNA celującym w wyspę CpG genu B2M. Wartości wyrażono jako log2 liczby odczytów na kilobazę na milion (RPKM) zmapowanych odczytów. Czarne kropki reprezentują geny wykazujące porównywalne poziomy ekspresji we wszystkich warunkach; żółte okręgi reprezentują geny regulowane różnicowo przy FDR &lt;0,01; czerwony okrąg reprezentuje transkrypt B2M-IRES-tdTomato. Prawa góra: wykres circos przedstawiający profile MeDIP-seq całego genomu dla komórek B2MtdTomato K-562 traktowanych kontrolnie (niebieski) lub traktowanych potrójną kombinacją ETR dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L wraz z gRNA celującym w wyspę CpG (CGI) genu B2M (zielony). Prawa dół: przedstawiono status metylacji locus B2MtdTomato we wskazanych próbkach. W każdym zestawieniu (pileup) reprezentowane są trzy powtórzenia; zestawienie wyrównanych odczytów zostało wygładzone za pomocą okna Gaussa. Rysunek został zaadaptowany z Amabile et al.30. Skrót: TSS = miejsce startu transkrypcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Opracowana przez nas technologia wyciszania epigenetycznego należy do większej areny technologii, którymi są technologie wyciszania genów. Zanim zaczęliśmy opracowywać wyciszanie epigenetyczne, w tej dziedzinie istniały dwie główne alternatywy. Jednym z nich było wyciszenie genu przez interferencję RNA, a drugim zakłócenie genów przez sztuczne nukleazy.Zakłócenie genów przez sztuczne nukleazy działa na poziomie DNA. Mamy więc gen docelowy, który chcemy dezaktywować, i dostarczamy do komórki sztuczne nukleazy, które wywołują pęknięcie dwuniciowego DNA. Ten rodzaj pęknięć dwuniciowych może indukować mutacje z przesunięciem ramki odczytu, które ostatecznie wymuszają albo generowanie niefunkcjonalnego białka, albo jednocześnie degradację transkryptu.Z drugiej strony, wyciszanie epigenetyczne działa poprzez dostarczanie do komórki tak zwanych inżynieryjnych represorów transkrypcyjnych. Są to małe białka, które są w stanie związać się z docelowym DNA, a następnie nałożyć na gen docelowy tak zwane znaki epigenetyczne. Są to pewne modyfikacje chemiczne, które po osadzeniu się na DNA mogą prowadzić do zagęszczenia chromatyny.Zagęszczenie chromatyny co ważne, prowadzi do zahamowania transkrypcji, więc nie masz już ekspresji genu docelowego. I co bardzo ważne, ten rodzaj stanu represyjnego transkrypcji może być długotrwale dziedziczony przez komórki. Aby zidentyfikować linie komórkowe, które wyrażają gen docelowy, który ma zostać wyciszony, przejrzyj gen docelowy w Atlasie białek ludzkich i przejdź przez sekcję Linie komórkowe, aby zidentyfikować linie komórkowe reprezentatywne dla tkanki somatycznej będącej przedmiotem zainteresowania.Spośród zidentyfikowanych linii komórkowych nadaj priorytet tym, dla których dostępne są skuteczne protokoły dostarczania genów przejściowych. Następnie otwórz przeglądarkę genów i zidentyfikuj region docelowego genu, aby zintegrować kasetę ekspresji fluoroforu. Następnie użyj CHOPCHOP, aby zidentyfikować i wybrać gRNA, które będą ciąć w regionie docelowym. W tym przypadku pierwszy intron genu B2M.Następnie zaprojektuj szablon dawcy dla miejsca przecięcia gRNA, składający się z lewego ramienia homologicznego, kasety ekspresji transgenu bez promotora i prawego ramienia homologii. Dostarczyć system nukleazy CRISPR Cas9 i matrycę dawcy do linii komórkowej K-562 przez nukleofekcję, zgodnie z instrukcjami producenta. Hodować komórki K-562 przez co najmniej 14 dni.Monitoruj poziomy ekspresji reportera fluorescencyjnego w czasie za pomocą cytometru przepływowego. Aktywuj kanał fikoerytryny, aby zmierzyć intensywność fluorescencji reportera tdTomato. Przeglądaj gen docelowy w przeglądarce genomu UCSC i wyodrębnij sekwencję nukleotydową regionów, które potencjalnie regulują jego aktywność transkrypcyjną, takich jak wyspy CpG i miejsca wzbogacone o acetylację H3K27.Wklej wybrane sekwencje w narzędziu online CHOPCHOP i wybierz represję jako cel odzyskania gRNA. CHOPCHOP dostarczy listę gRNA zmapowanych na interesującej nas sekwencji genetycznej i wymienionych zgodnie z wynikiem, biorąc pod uwagę liczbę dopasowań poza celem i przewidywaną skuteczność w realizacji celu. Wybierz co najmniej 10 gRNA na sekwencję docelową. Spróbuj wybrać gRNA obejmujące cały region, które mają być celem ataku, bez pełnych dopasowań z innymi sekwencjami międzygenowymi w całym genomie. Po przekształceniu plazmidów kodujących ETRS w chemicznie kompetentnych komórkach E. coli, należy przebadać kolonie pod kątem obecności plazmidów kodujących ETR poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowanie Sangera. Aby sklonować gRNA wewnątrz szkieletu gRNA phU6, najpierw wygeneruj oligonukleotydy za pomocą oprogramowania do projektowania biologii molekularnej.Dołącz sekwencję pięciu nukleotydów przed protospacerem i oznacz ten oligonus o długości 25 nukleotydów. Podobnie, dołącz sekwencję pięciu nukleotydów do odwrotnego dopełniacza protospaceru i cytozyny za nim, aby wygenerować oligo o długości 25 nukleotydów i oznaczyć go. Zsyntetyzuj te oligonukleotydy jako jednoniciowe oligonukleotydy DNA bez soli zawieszone w wodzie o stężeniu 100 mikromolowym.Dodaj jeden mikrolitr każdego oligo do dwóch mikrolitrów buforu do wyżarzania i 16 mikrolitrów wody. Wykonaj wyżarzanie oligo, umieszczając roztwór w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie stopniowo schładzaj do 25 stopni Celsjusza przez 45 minut.Rozcieńczyć jeden mikrolitr wyżarzonych oligonukleotydów w 99 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Następnie podwiązać jeden mikrolitr tego rozcieńczenia z 50 nanogramami plazmidu phU6 gRNAs, uprzednio strawionego enzymem restrykcyjnym Bsa1. Przekształć 20 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek E. coli za pomocą dwóch mikrolitrów produktu ligacji.Wybierz wiele kolonii do produkcji plazmidowego DNA i potwierdź udane klonowanie protospacera za pomocą sekwencjonowania Sangera. Aby dostarczyć gRNA i ETR oparte na CRISPR/dCas9 w linii komórek reporterowych w macierzy, najpierw przygotuj oddzielne probówki zawierające 500 nanogramów każdego z plazmidów i dodaj 125 nanogramów różnych gRNA kodujących plazmidy do testowania. Uwzględnij warunek nukleofekcji wolny od gRNA i ETR jako próbkę poddaną próbce.Należy przygotować co najmniej trzy kontrpróby techniczne na próbkę. Osad 5 x 105 komórek B2M tdTomato K-562 w probówce i nukleofekt ich mieszanką plazmidów. Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach wcześniej podgrzanej pożywki do hodowli komórek ssaków RPMI 1640 i umieścić je w inkubatorze.Użyj cytometrii przepływowej, aby zmierzyć procent wyciszonych komórek w różnych punktach czasowych po dostarczeniu ETR. Użyj komórek typu dzikiego bez sekwencji kodowania tdTomato, aby ustawić próg komórek reporter-ujemnych.Użyj próbnej próbki, aby ustawić bramkę dla komórek reporterowo-dodatnich. Zidentyfikuj trzy najważniejsze gRNA pod względem długoterminowej skuteczności wyciszania. Użyj FACS, aby wybrać subpopulację reportero-ujemną, stabilnie utrzymywaną w tych próbkach.Należy również wykonać FACS próbnych próbek poddanych tej samej obróbce, aby umożliwić właściwe porównanie w kolejnych analizach. Fluorescencyjny reporter tdTomato został zintegrowany z pierwszym intronem ludzkiego genu B2M poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię indukowaną przez CRISPR/Cas9. Reporterowo-dodatnie komórki K-562 pojawiają się w badanej próbce po integracji.Po przejściowym dostarczeniu kombinacji potrójnych ETR, wraz z gRNA, przeprowadzono analizę podłużnej cytometrii przepływowej w celu oceny ekspresji fluorescencyjnego reportera. Szczyt zaobserwowano w represji reporterowej podczas ostrych analiz, który został częściowo ponownie wchłonięty z powodu mitotycznego rozcieńczenia plazmidów kodujących ETR w czasie. Skuteczne osadzanie metylacji CpG w locus docelowym przez kombinację ETR i gRNA było widoczne poprzez trwałą represję reportera w znacznej części leczonych komórek. Różne gRNA wykazywały różną długoterminową skuteczność wyciszania.Jednym z kluczowych kroków do osiągnięcia trwałego i skutecznego wyciszenia epigenetycznego jest identyfikacja skutecznych gRNA. Aby to zrobić, dla każdego rodzaju aplikacji, musisz zacząć od identyfikacji najbardziej responsywnych sekwencji, w tym promotorów i wzmacniaczy w innych miejscach regulacji transkrypcji.Po zidentyfikowaniu najbardziej responsywnego i efektywnego regionu należy zaprojektować różne gRNA i przetestować je pojedynczo lub w połączeniu. Jednym z najbardziej oczywistych zastosowań edycji epigenomu są choroby spowodowane mutacjami typu gain-of-function. Alternatywnie, powinniśmy w każdym razie pamiętać, że zdolność do specyficznej zmiany regulacji epigenetycznej danego promotora może stanowić super użyteczne narzędzie zarówno dla nauk translacyjnych, jak i podstawowych.

in-vitro-selection-engineered-transcriptional-repressors-for-targeted

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Przedstawiono szczegółowe protokoły wprowadzania zmodyfikowanego enzymu rozszczepionego TET2 (CiDER) do komórek ssaków w celu indukowania chemicznie indukowanego DNA hydroksymetylacji i epigenetycznej przebudowy.

Zmodyfikowany enzym split-TET2 do chemicznie indukowanej hydroksymetylacji DNA i przebudowy epigenetycznej

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Protokół ten opisuje nieintegracyjny, episomalny system oparty na CRISPR/dCas9 do celowanej edycji epigenetycznej w komórkach K562, łączący efektory dCas9-DNMT3A i dCas9-HDAC1 ze specyficznymi sgRNA, aby precyzyjnie indukować metylację DNA specyficzną dla locus, z ograniczoną efektem pozacelową.

Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Poznaj metodę selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego z minimalnymi efektami off-target. Protokół wykorzystuje CRISPR/Cas9 i cytometrię przepływową.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Przeglądaj więcej filmów