In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Opracowana przez nas technologia wyciszania epigenetycznego należy do większej areny technologii, którymi są technologie wyciszania genów. Zanim zaczęliśmy opracowywać wyciszanie epigenetyczne, w tej dziedzinie istniały dwie główne alternatywy. Jednym z nich było wyciszenie genu przez interferencję RNA, a drugim zakłócenie genów przez sztuczne nukleazy.

Zakłócenie genów przez sztuczne nukleazy działa na poziomie DNA. Mamy więc gen docelowy, który chcemy dezaktywować, i dostarczamy do komórki sztuczne nukleazy, które wywołują pęknięcie dwuniciowego DNA. Ten rodzaj pęknięć dwuniciowych może indukować mutacje z przesunięciem ramki odczytu, które ostatecznie wymuszają albo generowanie niefunkcjonalnego białka, albo jednocześnie degradację transkryptu.

Z drugiej strony, wyciszanie epigenetyczne działa poprzez dostarczanie do komórki tak zwanych inżynieryjnych represorów transkrypcyjnych. Są to małe białka, które są w stanie związać się z docelowym DNA, a następnie nałożyć na gen docelowy tak zwane znaki epigenetyczne. Są to pewne modyfikacje chemiczne, które po osadzeniu się na DNA mogą prowadzić do zagęszczenia chromatyny.

Zagęszczenie chromatyny co ważne, prowadzi do zahamowania transkrypcji, więc nie masz już ekspresji genu docelowego. I co bardzo ważne, ten rodzaj stanu represyjnego transkrypcji może być długotrwale dziedziczony przez komórki. Aby zidentyfikować linie komórkowe, które wyrażają gen docelowy, który ma zostać wyciszony, przejrzyj gen docelowy w Atlasie białek ludzkich i przejdź przez sekcję Linie komórkowe, aby zidentyfikować linie komórkowe reprezentatywne dla tkanki somatycznej będącej przedmiotem zainteresowania.

Spośród zidentyfikowanych linii komórkowych nadaj priorytet tym, dla których dostępne są skuteczne protokoły dostarczania genów przejściowych. Następnie otwórz przeglądarkę genów i zidentyfikuj region docelowego genu, aby zintegrować kasetę ekspresji fluoroforu. Następnie użyj CHOPCHOP, aby zidentyfikować i wybrać gRNA, które będą ciąć w regionie docelowym. W tym przypadku pierwszy intron genu B2M.

Następnie zaprojektuj szablon dawcy dla miejsca przecięcia gRNA, składający się z lewego ramienia homologicznego, kasety ekspresji transgenu bez promotora i prawego ramienia homologii. Dostarczyć system nukleazy CRISPR Cas9 i matrycę dawcy do linii komórkowej K-562 przez nukleofekcję, zgodnie z instrukcjami producenta. Hodować komórki K-562 przez co najmniej 14 dni.

Monitoruj poziomy ekspresji reportera fluorescencyjnego w czasie za pomocą cytometru przepływowego. Aktywuj kanał fikoerytryny, aby zmierzyć intensywność fluorescencji reportera tdTomato. Przeglądaj gen docelowy w przeglądarce genomu UCSC i wyodrębnij sekwencję nukleotydową regionów, które potencjalnie regulują jego aktywność transkrypcyjną, takich jak wyspy CpG i miejsca wzbogacone o acetylację H3K27.

Wklej wybrane sekwencje w narzędziu online CHOPCHOP i wybierz represję jako cel odzyskania gRNA. CHOPCHOP dostarczy listę gRNA zmapowanych na interesującej nas sekwencji genetycznej i wymienionych zgodnie z wynikiem, biorąc pod uwagę liczbę dopasowań poza celem i przewidywaną skuteczność w realizacji celu. Wybierz co najmniej 10 gRNA na sekwencję docelową.

Spróbuj wybrać gRNA obejmujące cały region, które mają być celem ataku, bez pełnych dopasowań z innymi sekwencjami międzygenowymi w całym genomie. Po przekształceniu plazmidów kodujących ETRS w chemicznie kompetentnych komórkach E. coli, należy przebadać kolonie pod kątem obecności plazmidów kodujących ETR poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowanie Sangera. Aby sklonować gRNA wewnątrz szkieletu gRNA phU6, najpierw wygeneruj oligonukleotydy za pomocą oprogramowania do projektowania biologii molekularnej.

Dołącz sekwencję pięciu nukleotydów przed protospacerem i oznacz ten oligonus o długości 25 nukleotydów. Podobnie, dołącz sekwencję pięciu nukleotydów do odwrotnego dopełniacza protospaceru i cytozyny za nim, aby wygenerować oligo o długości 25 nukleotydów i oznaczyć go. Zsyntetyzuj te oligonukleotydy jako jednoniciowe oligonukleotydy DNA bez soli zawieszone w wodzie o stężeniu 100 mikromolowym.

Dodaj jeden mikrolitr każdego oligo do dwóch mikrolitrów buforu do wyżarzania i 16 mikrolitrów wody. Wykonaj wyżarzanie oligo, umieszczając roztwór w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie stopniowo schładzaj do 25 stopni Celsjusza przez 45 minut.

Rozcieńczyć jeden mikrolitr wyżarzonych oligonukleotydów w 99 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Następnie podwiązać jeden mikrolitr tego rozcieńczenia z 50 nanogramami plazmidu phU6 gRNAs, uprzednio strawionego enzymem restrykcyjnym Bsa1. Przekształć 20 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek E. coli za pomocą dwóch mikrolitrów produktu ligacji.

Wybierz wiele kolonii do produkcji plazmidowego DNA i potwierdź udane klonowanie protospacera za pomocą sekwencjonowania Sangera. Aby dostarczyć gRNA i ETR oparte na CRISPR/dCas9 w linii komórek reporterowych w macierzy, najpierw przygotuj oddzielne probówki zawierające 500 nanogramów każdego z plazmidów i dodaj 125 nanogramów różnych gRNA kodujących plazmidy do testowania. Uwzględnij warunek nukleofekcji wolny od gRNA i ETR jako próbkę poddaną próbce.

Należy przygotować co najmniej trzy kontrpróby techniczne na próbkę. Osad 5 x 10⁵ komórek B2M tdTomato K-562 w probówce i nukleofekt ich mieszanką plazmidów. Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach wcześniej podgrzanej pożywki do hodowli komórek ssaków RPMI 1640 i umieścić je w inkubatorze.

Użyj cytometrii przepływowej, aby zmierzyć procent wyciszonych komórek w różnych punktach czasowych po dostarczeniu ETR. Użyj komórek typu dzikiego bez sekwencji kodowania tdTomato, aby ustawić próg komórek reporter-ujemnych.

Użyj próbnej próbki, aby ustawić bramkę dla komórek reporterowo-dodatnich. Zidentyfikuj trzy najważniejsze gRNA pod względem długoterminowej skuteczności wyciszania. Użyj FACS, aby wybrać subpopulację reportero-ujemną, stabilnie utrzymywaną w tych próbkach.

Należy również wykonać FACS próbnych próbek poddanych tej samej obróbce, aby umożliwić właściwe porównanie w kolejnych analizach. Fluorescencyjny reporter tdTomato został zintegrowany z pierwszym intronem ludzkiego genu B2M poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię indukowaną przez CRISPR/Cas9. Reporterowo-dodatnie komórki K-562 pojawiają się w badanej próbce po integracji.

Po przejściowym dostarczeniu kombinacji potrójnych ETR, wraz z gRNA, przeprowadzono analizę podłużnej cytometrii przepływowej w celu oceny ekspresji fluorescencyjnego reportera. Szczyt zaobserwowano w represji reporterowej podczas ostrych analiz, który został częściowo ponownie wchłonięty z powodu mitotycznego rozcieńczenia plazmidów kodujących ETR w czasie. Skuteczne osadzanie metylacji CpG w locus docelowym przez kombinację ETR i gRNA było widoczne poprzez trwałą represję reportera w znacznej części leczonych komórek. Różne gRNA wykazywały różną długoterminową skuteczność wyciszania.

Jednym z kluczowych kroków do osiągnięcia trwałego i skutecznego wyciszenia epigenetycznego jest identyfikacja skutecznych gRNA. Aby to zrobić, dla każdego rodzaju aplikacji, musisz zacząć od identyfikacji najbardziej responsywnych sekwencji, w tym promotorów i wzmacniaczy w innych miejscach regulacji transkrypcji.

Po zidentyfikowaniu najbardziej responsywnego i efektywnego regionu należy zaprojektować różne gRNA i przetestować je pojedynczo lub w połączeniu. Jednym z najbardziej oczywistych zastosowań edycji epigenomu są choroby spowodowane mutacjami typu gain-of-function. Alternatywnie, powinniśmy w każdym razie pamiętać, że zdolność do specyficznej zmiany regulacji epigenetycznej danego promotora może stanowić super użyteczne narzędzie zarówno dla nauk translacyjnych, jak i podstawowych.