Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez badanie genomu i identyfikację mechanizmów molekularnych leżących u podstaw fenotypu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Sekwencjonowanie genomu na świecie usprawnia eksplorację DNA, bakteryjnego DNA na dużą skalę, ułatwiając dogłębną charakterystykę drobnoustrojów w jednym przebiegu, w tym blisko spokrewnionych wariantów patogennych. Sekwencjonowanie nowej generacji umożliwia szybką identyfikację i charakterystykę mikroorganizmów oraz ich profilu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, stanowiąc narzędzie do diagnozowania, leczenia, nadzoru i śledzenia źródeł patogenów w kontekście klinicznym.

Metodologie sekwencjonowania nowej generacji mogą odgrywać decydującą rolę w nadzorze i śledzeniu źródeł patogenów nie tylko w kontekście klinicznym, ale także w środowisku i, co ważne, w bezpieczeństwie żywności. Obecnie nie jest to rutynowa technika. Rzeczywiście, odrobina procedury ułatwi zrozumienie, jak skutecznie przeprowadzają eksperyment.

Procedurę zademonstruje Julissa Enciso-Ibarra, technik genomiki z naszej grupy roboczej. Po ekstrakcji i ilościowym określeniu DNA bakterii dodać 2,5 mikrolitra buforu do znakowania. Dwa mikrolitry wejściowego G D N A w probówce o pojemności 0,2 mililitra i wymieszać przez pipetowanie.

Dodaj jeden mikrolitr buforu amplifikacyjnego i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie wirować probówkę o masie 280 G przez jedną minutę. Umieść próbki w termocyklerze w temperaturze 55 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie przytrzymaj w temperaturze 10 stopni Celsjusza.

Dodać jeden mikrolitr buforu neutralizującego do probówek z próbkami i delikatnie wymieszać pipetując. Odwirować probówkę i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 1,7 mikrolitra każdego adaptera indeksującego i trzy mikrolitry indeksującej mieszanki głównej PCR.

Po wymieszaniu składników odwirowywać w temperaturze 280 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Umieść próbki w termocyklerze i przeprowadź drugą reakcję PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie. Teraz wymieszaj komercyjne rozwiązanie kulek magnetycznych przez wirowanie.

Zgodnie z wytycznymi producenta. Przenieś oznakowaną lub zindeksowaną próbkę G D N A do nowej pięciomililitrowej probówki i dodaj 0,6 mikrolitra kulek magnetycznych na każdy mikrolitr końcowej objętości próbki GDNA. Delikatnie wymieszać składniki pipetując i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Umieścić probówki z próbkami na stojaku magnetycznym na dwie minuty, aż supernatant się oczyści. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając kulek. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu bez mieszania.

Inkubować przez 30 sekund, aż eluit się oczyści i ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając kulek. Powtórz tę procedurę i susz koraliki na powietrzu przez 10 minut. Teraz dodaj 15 mikrolitrów 10-milimolowego buforu tris do kulek delikatnie wymieszanych przez pipetowanie i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Umieścić probówki z próbkami na stojaku magnetycznym na dwie minuty, pozwalając supernatantowi się oczyścić. Następnie ostrożnie przenieś 14 mikrolitrów supernatantu z probówki z próbką do nowej probówki o pojemności 0,2 mililitra i pobierz oczyszczoną bibliotekę. Rozmrozić wkład z odczynnikiem zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyciągnij pięć mikrolitrów znormalizowanej biblioteki do 1,5-mililitrowej probówki o niskim stopniu wiązania i rozcieńcz pulę w czterech nanomolach odpowiednią objętością RSB. Następnie dodaj po pięć mikrolitrów z puli i 0,2 normalnego wodorotlenku sodu do nowej probówki o niskim stopniu wiązania 1,5 mililitra. Aby zdenaturować zebraną bibliotekę na pojedyncze pasma, wymieszaj rurkę przez wirowanie.

Wirować przez minutę i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Teraz dodaj 10 mikrolitrów zdenaturowanej biblioteki zbiorczej 990 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego i delikatnie wymieszaj pipetując. Umieść probówkę na lodzie do momentu wykonania ostatecznego rozcieńczenia w celu załadowania sekwencera.

Wlać i przygotować bibliotekę kontrolną o stężeniu czterech nanomolowców, mieszając dwa mikrolitry biblioteki kontrolnej i trzy mikrolitry wody wolnej od nukleaz. Następnie dodaj po pięć mikrolitrów z biblioteki kontrolnej i świeżo przygotowany 0,2 normalnego wodorotlenku sodu. Dedenaturacja biblioteki kontrolnej na pojedyncze nici, jak pokazano wcześniej.

Delikatnie wymieszać 10 mikrolitrów zdenaturowanej biblioteki kontrolnej i 990 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego przez pipetowanie i umieścić na lodzie, aż do końcowego rozcieńczenia do ładowania sekwenatora. W nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra o niskim wiązaniu połącz 594 mikrolitry zdenaturowanej biblioteki zbiorczej i sześć mikrolitrów zdenaturowanej biblioteki kontrolnej. Odpowiednio wymieszać i rozcieńczyć końcową mieszankę biblioteczną do końcowego stężenia ładowania 1,2 peco molowego w objętości 600 mikrolitrów przy użyciu wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego.

Przed załadowaniem końcowej mieszanki bibliotecznej na wkład z odczynnikiem należy przeprowadzić dodatkową wstępną obróbkę termiczną, aby uzyskać efektywne ładowanie do komory przepływowej. Inkubuj końcową mieszankę biblioteczną przez dwie minuty w temperaturze 96 stopni Celsjusza. Odwróć probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę na lodzie na pięć minut.

Załaduj 500 mikrolitrów końcowej mieszanki bibliotecznej do zbiornika projektowego na kartridżu z odczynnikiem. Po zainicjowaniu sekwencera załaduj wkład z odczynnikiem, komórkę przepływową i ustaw przebieg sekwencjonowania. W celu analizy danych połącz się z serwerem danych sekwencjonowania i pobierz pliki FASTQ.

Oceń początkową jakość surowych danych sekwencji za pomocą oprogramowania innych firm. Usuń resztki sekwencji adapterów, bazy niskiej jakości i krótkie odczyty z surowych danych sekwencjonowania. Zbierz dane sekwencjonowania kontroli jakości na poziomie kontigu lub rusztowania za pomocą oprogramowania innych firm.

Wykonaj adnotację genomu, przesyłając plik Phaster zawierający złożony genom na serwer RAST. Prześlij plik Phaster do platform internetowych Center for Genome Epidemiology i Claremont w celu zidentyfikowania cech epidemiologicznych. ARGS, VAGS i plazmidy.

Prześlij plik Phaster na serwer Phaster, aby zidentyfikować sekwencje profagów. Adnotacja genomu ujawniła 5 633 zakodowane cechy, z których 5 524 to geny powlekające białka, a 109 to sekwencje związane z RNA. Przewidywany szczep Escherichia coli należy do grupy filo B i typu sekwencji 40.

Zidentyfikowano determinant oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, gen M, DF, A kodujący wielolekową pompę wypływową o szerokim spektrum działania. Zidentyfikowano również geny kodujące enterotoksynę stabilną termicznie, białko oporności surowicy oraz system wydzielania typu trzeciego wraz z wydzielanymi przez niego białkami efektorowymi. Sekwencje kodujące są pogrupowane w zbiory funkcjonalnie powiązanych białek zwanych podsystemami, zwłaszcza tymi, które odgrywają funkcjonalne role w węglowodanach, białkach, aminokwasach i pochodnych metabolizmie oraz transporcie błonowym.

Dobra praktyka laboratoryjna ma fundamentalne znaczenie we wszystkich protokołach. Należy jednak zachować szczególną ostrożność podczas przetwarzania wielu próbek podczas przygotowywania sekcyjnej biblioteki DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.