Powinowactwo komórkowe emulsji stabilizowanej cząstkami w celu zwiększenia internalizacji antygenu

Opracowaliśmy emulsję Pickeringa stabilizowaną nanocząstkami PLGA. Emulsja Pickeringa poprawiła powinowactwo komórkowe do komórek białka antygenowego, indukując efektywną internalizację antygenów. Stabilizowane nanocząsteczkami emulsje Pickeringa były łatwe w przygotowaniu i skutecznie dostarczały antygen.

Dodatkowo zastosowano metodę monitorowania powinowactwa emulsji do komórki i opracowania szczegółów internalizacji. Protokół ten dostarcza informacji na temat projektowania nowatorskich preparatów o wysokiej wydajności komórek i efektywnej internalizacji antygenów, które stanowią platformę do opracowywania skutecznych szczepionek. Na początek dodaj 100 miligramów kwasu polimlekowo-koglikolowego do 10 mililitrów mieszaniny acetonu i etanolu w stosunku cztery do jednego, aby służyły jako faza olejowa.

Umieść 20 mililitrów wodnego roztworu PVA pod wyciągiem i mieszaj magnetycznie z prędkością 400 obrotów na minutę. Dodaj pięć mililitrów fazy olejowej do roztworu PVA kropla po kropli za pomocą pompy strzykawkowej. Następnie mieszaj mieszaninę w dygestorium, aż rozpuszczalniki organiczne całkowicie odparują.

Po ulatnianiu się rozpuszczalników organicznych odwirować mieszaninę przy 15 000 G. Umyć trzy lub więcej razy, aż końcowa woda myjąca będzie czysta i przezroczysta. Ponownie zawiesić umyte nanocząstki PLGA w dwóch mililitrach wody dejonizowanej i zamrozić mieszaninę w temperaturze 80 stopni Celsjusza na 24 godziny. Aby scharakteryzować wielkość i potencjał zeta nanocząstek PLGA, dodaj 10 mikrolitrów nanocząstek PLGA do jednego mililitra wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór rozcieńczalnika i przenieś roztwór rozcieńczalnika do DTS1070 komórki.

Włącz komputer i analizator dynamicznego rozpraszania światła. Następnie umieść ogniwo DTS1070 w systemie DLS. Kliknij oprogramowanie Zetasizer i utwórz nowy plik pomiarowy, aby skonfigurować procedurę oznaczania.

Następnie rozpocznij procedurę oznaczania, aby uzyskać wielkość cząstek i rozkład potencjału zeta. Aby przygotować stabilizowaną emulsję Pickeringa lub PNPE stabilizowane nanocząstki PLGA, dodaj liofilizowane nanocząstki PLGA do wody dejonizowanej w stężeniu czterech miligramów na mililitr, a następnie dodaj skwalan jako fazę olejową. Przygotuj PNPE za pomocą jednoetapowej sonikacji przez pięć minut przy 100 watach w sonikatorze w kąpieli wodnej.

Rozcieńczyć 20 mikrolitrów PNPE i jeden mililitr wody dejonizowanej. Upuść 20 mikrolitrów emulsji na szkiełko. Obserwuj morfologię i jednorodność emulsji za pomocą mikroskopii optycznej przy 40-krotnym powiększeniu i uzyskaj fotografie.

Włącz powlekarkę, naciskając przycisk zasilania. Naciśnij przycisk sterujący i ustaw czas i prędkość powlekania. Podłącz rurkę azotową do powlekarki wirowej i dostosuj frakcjonowanie butli gazowej do 0,4 kilopaskali

Umieść czysty wiór na przyssawce wirówki. Dodaj kroplami 100 mikrolitrów poli-l-lizyny do środka czujnika dwutlenku krzemu i zamknij górną pokrywę powlekarki wirowej. Naciśnij przycisk start, aby rozpocząć powlekanie próbki i zatrzymać maszynę po zakończeniu.

Wyłącz pompę próżniową, wyłącz przyciski zasilania i sterowania, a następnie wyjmij czujnik dwutlenku krzemu modyfikowany poli-l-lizyną. Aby określić adhezję biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do PNPE, włącz komputer, jednostkę elektroniczną i pompę perystaltyczną, a następnie aktywuj kontrolę temperatury w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby upewnić się, że ustawiona temperatura jest o około jeden stopień Celsjusza niższa od temperatury pokojowej. Umieść czujniki dwutlenku krzemu modyfikowanego poli-l-lizyną w komorze przepływowej zgodnie z instrukcją obsługi i podłącz linię pomiarową między celą przepływową a pompą przepływową.

Umieść komorę przepływową wewnątrz systemu modułu przepływowego. Kliknij na pasek narzędzi Akwizycja i wybierz Setup Measurement, aby wyszukać 1, 3, 5, 7, 9 i 11 oktawy chipa w używanym kanale. Aby skorygować linię bazową, kliknij przycisk Rozpocznij pomiar, aby umożliwić dopływ powietrza do modułu przepływu, aż linia bazowa powietrza będzie gładka.

Po przepływie wody dejonizowanej przez 10 do 15 minut, aby ponownie umożliwić równowagę podstawową roztworu, pompuj przygotowany roztwór PNPE do modułu przepływowego z natężeniem przepływu 50 mikrolitrów na minutę, aby uzyskać adsorpcję równowagową na czujniku dwutlenku krzemu. Przygotowany biomimetyczny roztwór pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pompować do modułu przepływowego z prędkością przepływu 50 mikrolitrów na minutę, aby śledzić proces adhezji bEV do powierzchni PNPE. Inkubuj komórki dendrytyczne szpiku kostnego z 1640 kompletnymi pożywkami przez siedem dni, a następnie umieść je w małych konfokalnych szalkach laserowych w ilości 1 razy 10 do 6 na studzienkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Wymieszaj 0,5 mililitra albuminy jaja kurzego znakowanej cyjaniną 5 z 0,5 mililitra PNPE przez jedną godzinę i usuń płynny antygen przez odwirowanie w 5 000 G przez 20 minut, aby opracować preparat szczepionki. Po ponownym zawieszeniu 200 mikrolitrów wody dejonizowanej, dodaj 10 mikrolitrów preparatu do małych konfokalnych czaszy laserowych pod super czystą ławką i współhoduj z komórkami dendrytycznymi szpiku kostnego przez sześć godzin. Po usunięciu płynu hodowlanego z komórek przemyj je dwukrotnie wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Utrwal komórki 4% roztworem formaldehydu i PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki PBS dwa lub trzy razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut każda. Przepuszczalność komórek za pomocą 100 mikrolitrów 0,5% roztworu Triton X-100 przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po ponownym umyciu komórek PBS, przykryj komórki na szklanym dnie małych konfokalnych czaszy laserowych 200 mikrolitrami sprzężonego roztworu roboczego falloidyny z izotiocyjanianem fluoresceiny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po trzykrotnym przemyciu komórek PBS przez pięć minut każde, należy zalać jądra 200 mikrolitrami roztworu DAPI przez około 30 sekund. W celu analizy obrazu należy włączać sprzęt mikroskopu konfokalnego w kolejności, w tym laser, konfokalny, mikroskop i komputer.

Kliknij oprogramowanie i wybierz Nikon Confokal, aby wejść do systemu testowego. W systemie mikroskopu konfokalnego włącz różne jednostki w zanotowanej kolejności. Najpierw skonfiguruj kanały FITC, DAPI i Cy5 i dostosuj odpowiednie WN i offset.

Następnie, po wybraniu soczewki 100 razy olejowej i nałożeniu kropli olejku cedrowego na wierzch, umieść małe konfokalne czasze laserowe zawierające barwione komórki dendrytyczne szpiku kostnego na stoliku mikroskopowym. Kliknij przycisk skanowania. Pod mikroskopem fluorescencyjnym zlokalizuj interesujące Cię komórki, przesuwając oś x, oś y i oś z.

Dostosuj intensywność lasera, rozmiar obrazu i inne parametry, aby umożliwić skanowanie wysokiej jakości obrazów konfokalnych. Na koniec kliknij przycisk Przechwyć i zapisz obrazy. Adhezja biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do PNPE była śledzona za pomocą QCM-D.

Natychmiastowy spadek częstości wskazywał na szybkie przyleganie biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do PNPE po spotkaniu. Co więcej, delta F zmniejszała się wraz ze wzrostem stężenia biomimetycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, co odzwierciedlało efekt zależny od stężenia. Mikrocząstki PLGA i stabilizowana surfaktantem nano emulsja były słabo związane z biomimetycznymi pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, nawet przy wysokim stężeniu 80 mikrogramów na mililitr, co prawdopodobnie wynikało z braku miejsc kontaktu z komórkami odpornościowymi.

Sygnał fluorescencyjny cyjaniny-5 albuminy jaja kurzego wskazał, że całkowita ilość antygenu zinternalizowanego w komórkach jest znacznie wyższa w grupie traktowanej PNPE w porównaniu z grupą traktowaną mikrocząstkami PLGA i stabilizowaną środkami powierzchniowo czynnymi nanoemulsją. Analiza ilościowa wychwytu komórkowego wykazała istotnie wyższą względną intensywność fluorescencji i komórek dendrytycznych szpiku kostnego traktowanych PNPE niż u osób traktowanych mikrocząstkami PLGA i nanoemulsją stabilizowaną środkami powierzchniowo czynnymi. Uzyskane wyniki wykazały, że PNPE sprzyja internalizacji antygenu i skutecznie dostarcza antygen wewnątrzkomórkowo.

W celu uzyskania jednorodnej emulsji, mieszanina musi być stale wstrząsana podczas sonikacji.