Name: Mikrodysekcja oka gryzonia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj protokół mikrodysekcji oka gryzonia z wykorzystaniem błony migotkowej do immobilizacji tkanek. Ta metoda umożliwia precyzyjne izolowanie warstw siatkówki przy minimalnym uszkodzeniu delikatnych struktur oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Alaknanda Mishra, Wydział Biologii Komórki i Anatomii Człowieka, Uniwersytet Kalifornijski w Davis, USA, przeszkoliła nas w tej metodzie w Narodowym Instytucie Immunologii w New Delhi. Prace te zostały wsparte grantem podstawowym otrzymanym z Departamentu Biotechnologii Rządu Indii dla Narodowego Instytutu Immunologii w New Delhi. P.S. otrzymała stypendium naukowe Katedry Biotechnologii.

Ta procedura została zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Narodowego Instytutu Immunologii w New Delhi. Numer seryjny homologacji to IAEC#480/18. Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Kontroli i Nadzoru Doświadczeń na Zwierzętach, Ministerstwa Rybołówstwa, Hodowli Zwierząt i Mleczarstwa, Rządu Indii, pod nadzorem profesjonalnego lekarza weterynarii w SAF, NII.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Rozszerz oczy gryzoni za pomocą kropli 0,8% tropikamidu i 5% roztworów oftalmicznych fenylefryny do każdego oka. Umieść zwierzę w ciemnym miejscu na 30 minut przed zabiegiem. 
	UWAGA: Środek przeciwbólowy nie jest wymagany, ponieważ zwierzę jest poddawane eutanazji natychmiast po zakończeniu 30 minut. Adaptacja do ciemności i rozszerzenie oczu zwierzęcia pozwala obserwatorowi sprawdzić, czy nie ma łez i uszkodzeń oka przed zabiegiem. Dodatkowo rozszerzenie jest korzystne podczas pracy z pigmentowaną tkanką gałki ocznej.</li>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji poprzez dootrzewnowe podanie 5-krotnej dawki znieczulenia. Typowa dawka to 200 μl PBS zawierającego 10 mg ketaminy i 1 mg ksylazyny. 
	UWAGA: Dawka do eutanazji zwierzęcia to ketamina w dawce 400-500 mg/kg masy ciała i ksylazyna w dawce 50 mg/kg masy ciała podawana dootrzewnowo. Dla typowej myszy o masie ciała 20 g dawka wynosiłaby 200 μl PBS zawierającego 10 mg ketaminy (100 μl roztworu podstawowego 100 mg/ml ketaminy) i 1 mg ksylazyny (100 μl roztworu podstawowego 10 mg/ml ksylazyny).</li>
	<li>Potwierdź całkowity brak reakcji na bodziec, badając odruch pedałowania. Brak bicia serca i oddychania są również ważnymi wskaźnikami.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji bocznej, aby umożliwić pełny dostęp do oka.</li>
	<li>Przygotuj kleszczyki do szycia Colibri, kleszczyki zakrzywione, mikroostrze (15°, rozmiar 3 mm), mikronożyczki sprężynowe i mikronożyczki sprężynowe pod kątem gotowe do zabiegu.</li>
</ol>
2. Wyłuszczenie oka myszy wraz z trzecią powieką
<ol>
	<li>Umieść mysz w pozycji bocznej, aby umożliwić pełny dostęp do oka. Otwórz zewnętrzne powieki kleszczami, aby optymalnie uwidocznić trzecią powiekę. 
	UWAGA: Trzecia powieka, znana również jako błona nosowa, znajduje się w kierunku górnego rogu stycznej nosowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Zidentyfikuj trzecią powiekę jako niewielką półprzezroczystą wypukłość z pigmentowaną granicą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść zakrzywione kleszcze wokół gałki ocznej i ściśnij, aby uwolnić oko od obcych przyczepów. Zminimalizuje to krwawienie do oka z otaczającej tkanki.</li>
	<li>Zastąp zakrzywione kleszczyki sprężynowymi mikronożyczkami i przetnij wokół gałki ocznej z przymocowaną do niej trzecią powieką. Użyj małych, ciągłych nacięć, aby uwolnić gałkę oczną z otaczających przyczepów tkankowych.</li>
	<li>Umieść zakrzywione mikronożyczki sprężynowe pod gałką oczną, aby uwolnić oko poprzez przecięcie nerwu wzrokowego. Upewnij się, że gałka oczna jest całkowicie zwolniona z oczodołu.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie obcych tkanek
<ol>
	<li>Umieścić wyłuszczone oko myszy poddanej eutanazji na szalce Petriego z buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) o pH 7,4, z szalką Petriego wypełnioną w taki sposób, aby gałka oczna była zanurzona w PBS.</li>
	<li>Unieruchom wyłuszczoną gałkę oczną myszy z dołączoną trzecią powieką jedną ręką za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zawieś gałkę oczną w płynnym podłożu, aby umożliwić bardziej efektywną obsługę. Niektóre mięśnie lub tkanki zewnątrzgałkowe zaczną odchodzić od gałki ocznej. Usuń je, odcinając je od gałki ocznej za pomocą mikronożyczek sprężynowych.</li>
	<li>Wytnij i usuń nerw wzrokowy z podstawy gałki ocznej za pomocą mikronożyczek, aby umożliwić lepsze oddzielenie siatkówki w przypadku preparatów do pełnego montażu. 
	UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie nerwu wzrokowego w celu przekroju tkanki.</li>
	<li>Przemyć gałkę oczną PBS i przenieść ją do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) na minimum 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia tkanki. 
	UWAGA: Na tym etapie procedurę można przerwać, pozostawiając tkankę w PFA na okres do 12 godzin w temperaturze 4 °C. Jednak w przypadku izolacji żywych komórek nie należy wykonywać etapów utrwalania, a całą procedurę należy wykonywać bez przerw.</li>
</ol>
4. Analiza wyłuszczonego oka w celu uzyskania przedniej i tylnej muszki ocznej
<ol>
	<li>Po utrwaleniu PFA (w przypadku pobierania żywych komórek należy postępować bez utrwalania gałki ocznej), przenieś gałkę oczną na szalkę Petriego zawierającą PBS i umieść ją pod mikroskopem preparacyjnym w celu wykonania kolejnej procedury.</li>
	<li>Unieruchomij gałkę oczną, mocno przytrzymując trzecią powiekę kleszczami do szycia Colibri.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w rąbku, przekłuwając go za pomocą mikroostrza. Rąbek to połączenie rogówkowo-twardówkowe. Wykonaj nacięcie najlepiej naprzeciwko trzeciej powieki, tworząc w ten sposób punkt dostępu dla mikronożyczek sprężynowych. 
	UWAGA: Użycie mikroostrza o nachyleniu 15° i wielkości 3 mm może zapewnić lepszą kontrolę nad głębokością tego nacięcia.</li>
	<li>Następnie, używając tego nacięcia jako punktu wyjścia, za pomocą mikronożyczek wykonaj małe i ciągłe nacięcia wzdłuż obwodu rąbka rogówkowo-twardówkowego. Najpierw wykonaj półkole nacięć, zaczynając od punktu nacięcia do trzeciej powieki. Następnie uzupełnij pozostałe półkole nacięć po drugiej stronie. Na koniec wykonaj nacięcie wokół trzeciej powieki, aby oddzielić tylną miseczkę od przedniej miseczki. 
	UWAGA: W zależności od interesującej muszli ocznej, błonę oczną można pozostawić przymocowaną do przedniej lub tylnej muszli ocznej.</li>
	<li>Usuń soczewkę z tylnej miseczki za pomocą kleszczy, aby uzyskać tylną miseczkę składającą się z warstwy siatkówki nerwowej i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Soczewka, tylna miseczka i przednia miseczka oka są w ten sposób oddzielone. 
	UWAGA: W przypadku pracy z nieutrwalonymi tkankami, przednie i tylne bańki mogą być teraz trawione enzymatycznie w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej rogówki lub siatkówki.</li>
	<li>W celu utrwalenia tkanek przenieś te kubki do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 4% PFA przez 12 godzin w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po utrwaleniu tkankę można zanurzyć w odpowiednim podłożu, a w celu uzyskania skrawków rogówki lub siatkówki można wykonać kriosekcję lub sekcję parafinową.</li>
</ol>
5. Izolacja warstwy siatkówki nerwowej i RPE
<ol>
	<li>Ponownie wprowadzić tylną miseczkę na szalkę Petriego zawierającą bufor PBS, aby zanurzyć tkankę.</li>
	<li>Sprawdź obecność siatkówki nerwowej. Można to uwidocznić jako nieprzezroczystą warstwę na pigmentowanej warstwie RPE, która jest przymocowana na obrzeżym obwodu miseczki.</li>
	<li>Przytrzymaj trzecią powiekę kleszczami, aby unieruchomić tylną miseczkę, i oderwij siatkówkę nerwową, zaczynając od obrzeża za pomocą drugiej pary kleszczy. 
	UWAGA: Zaleca się bardzo delikatne i lekkie ruchy dłoni, aby nie uszkodzić tkanki. Przy wyjściu nerwu wzrokowego zakrzywione nożyczki sprężynowe można wsunąć pod siatkówkę nerwową i wykonać cięcie, aby całkowicie uwolnić warstwy, jeśli siatkówka nerwowa pozostaje przyczepiona, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 3. Opcjonalnie uwolnij lub odłącz siatkówkę delikatnymi pociągnięciami za pomocą miękkiej szczoteczki. Nie byłoby to jednak właściwe w przypadku pobierania siatkówki do badania histologicznego. 
	UWAGA: W ten sposób uzyskuje się siatkówkę nerwową i pigmentowaną warstwę RPE z trzecią powieką.</li>
</ol>
6. Segmentacja warstw siatkówki i RPE dla całych wierzchowców
<ol>
	<li>Ponownie wprowadzić przednie i tylne bańki do szalki Petriego zawierającej bufor PBS i umieścić szalkę pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Unieruchom miseczkę przednią, przytrzymując trzecią powiekę.</li>
	<li>Użyj kątowych mikronożyczek sprężynowych, aby wykonać cięcie około 3/4 średnicy muszli ocznej obok trzeciej powieki, przecinając od obwodu prostopadle w kierunku środka optyki.</li>
	<li>Trzymaj trzecią powiekę i wykonaj cięcie obok pierwszego cięcia.</li>
	<li>Wykonaj podobne cięcie między drugim cięciem a trzecią powieką. 
	UWAGA: Trzy lub cztery takie równoodległe nacięcia otwierają półkuliste miseczki w kształt kwiatu, który opada płasko i można go łatwo zamontować.</li>
	<li>Unieruchom tylną miseczkę, przytrzymując trzecią powiekę.</li>
	<li>Wykonaj te same czynności, co przy wykonywaniu nacięć (kroki 6.3-6.5) na miseczce przedniej, aby wykonać trzy lub cztery jednakowo odległe nacięcia na miseczce tylnej. 
	UWAGA: W przypadku histologii siatkówki nerwowej wyizolowanej w kroku 5 wykonaj podobne nacięcia, aby upewnić się, że opada płasko na powierzchnię. Nie wykonuj bardzo głębokich nacięć na środku kubka, ponieważ może to spowodować, że sekcje liści łatwo się rozpadną lub rozdzielą.</li>
	<li>Wykonaj barwienie i zamontuj całe tkanki, aby uzyskać efektywną wizualizację7,8. 
	UWAGA: Obecność błony ocznej działa jako stały wskaźnik fizyczny nosowej strony muszli ocznej w całych mocowaniach. Pomaga rozgraniczyć grzbietową/brzuszną stronę muszli ocznej, ponieważ trzecia powieka muszli ocznej wskazuje orientację nosową/brzuszną.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+%28PDXs%29+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li>
<li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576(2018).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563(2011).</li>
<li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546(2013).</li>
<li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+wholemount+technique%3A+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li>
<li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163(2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stwierdzono, że mikrodysekcja oka jest trudnym zadaniem ze względu na mały rozmiar i kulisty kształt oka gryzonia, a oko gryzoni wymaga innowacyjnych technik skutecznego obchodzenia się z nim8. 
W obecnie zademonstrowanej metodzie wyłuszczona gałka oczna myszy jest uzyskiwana z dołączoną trzecią powieką w celu skutecznej i łatwej obsługi. Za pomocą trzeciej powieki gałka oczna może zostać całkowicie unieruchomiona, co pozwala na łatwe przeprowadzenie sekcji przy minimal...

Dyssekcja oka jest ważną techniką w badaniach okulistycznych i umożliwiła badaczom dostęp do segmentów oka w celu przeprowadzenia badań celowanych. Wcześniej badacze okulistów opierali się w swoich badaniach na tkance oka od osób chorych. Jednak stopniowo rosnąca liczba szczepów okulistycznych modeli gryzoni1 na przestrzeni lat zmniejszyła zapotrzebowanie na ludzką tkankę oka. Te szczepy myszy pozwoliły na głębsze zrozumienie chorób oczu i interwencji. Stworzyły one jednak również zapotrzebowanie na innowacyjne techniki mikropreparacji oka. Niewielkie rozmiary i ograniczony obszar działania poważnie ograniczają skuteczny dostęp do części nośnych. Ponadto, ze względu na jednorodny montaż komórkowy tylnej i przedniej muszli ocznej, trudno jest przeprowadzić ukierunkowane interwencje po sekcji. Obecne techniki mikropreparacji lasera2 i mikrodysekcji chirurgicznej3,4 są niewystarczające do spełnienia takich wymagań badań okulistycznych. Mikropreparacja laserowa jest bardzo skuteczna w analizie pojedynczych komórek, ale konkretna tkanka musi zostać poddana mikrosekcji przed zabiegiem laserowym2. Technika ta pozwala wyizolować małe obszary zainteresowania ze wstępnie wypreparowanej tkanki w celu analizy molekularnej. W związku z tym technika ta nie nadaje się do przygotowania całych wierzchowców ani do izolacji osiowo upakowanych warstw oka w celu optymalnej wizualizacji.
Metoda chirurgiczna jest najczęściej stosowaną techniką; metoda ta polega na unieruchomieniu oka za pomocą nerwu wzrokowego5, a następnie wykonaniu sekcji. Ta praktyka jest żmudna i może uszkodzić każdą delikatną tkankę, ponieważ kuliste oko nadal się porusza podczas sekcji. Pomimo tego, że technika ta jest korzystna dla izolowania różnych odcinków warstw siatkówki, nie może wyznaczyć orientacji przestrzennej tkanki podczas sekcji.
Podczas sekcji, utrzymanie obecności dołączonej błony naszywkowej lub trzeciej powieki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) prezentuje unikalne i znaczące korzyści. W tej metodzie najpierw gałka oczna jest wyłuszczona trzecią powieką. Następnie, trzecia powieka służy do unieruchomienia oka6 (Rysunek 2A). Następnie przekłuwa się gałkę oczną przez rąbek rogówki i używa nacięcia jako punktu wejścia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, C). Następnie muszle oczne są rozdzielane poprzez nacięcie wzdłuż obwodu z przodu i z tyłu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D-G). Poprzez dalsze preparowanie tylnej muszli ocznej, można zidentyfikować półprzezroczystą warstwę siatkówki nerwowej i delikatnie ją odkleić. Trzy lub cztery równoodległe nacięcia są następnie wykonywane w otrzymanych półkulistych przednich i tylnych miseczkach, które pozwalają tym miseczkom w kształcie kwiatów opadnąć płasko na szkiełko (<silna klasa="xfig">Ryc. 2H).
Trzecia powieka pomaga w łatwej i efektywnej obsłudze podczas sekcji, zapewniając w ten sposób minimalne uszkodzenia tkanki podczas dostępu do różnych warstw oka i podczas tworzenia całych warstw. Co więcej, obecność trzeciej powieki pomaga zlokalizować i zbadać zlokalizowane interwencje podczas wizualizacji.
Procedura, w naszym laboratorium, została przeprowadzona na myszy CBA/J lub rd1 w P28 dowolnej płci. Zabieg może być wykonywany na każdym szczepie, wieku i płci zwierzęcia i nie ma uprzedzeń zgodnie z tymi cechami.
Zwierzęta zostały pozyskane z komercyjnych źródeł (zobacz Tabelę Materiałów) i przechowywane w Small Animal Facility (SAF) w National Institute of Immunology (NII). Trzymano je w indywidualnych wentylowanych klatkach (IVC) i zapewniano im dostęp ad libitum do zakwaszonej, autoklawowanej wody i pożywienia. Utrzymywano je w temperaturze 21-23 °C i w cyklu 14 h/10 h światło/ciemność.
Poniżej znajduje się zmodyfikowana metoda chirurgiczna mikro-preparacji oka myszy.

<table><tbody><tr><td>Paracetamol (Biocetamol)</td><td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne</td></tr><tr><td>)Zestaw fosfatazy alkalicznej (DEA)</td><td>Coral Clinical System, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Automatyczny analizator</td><td>Tulip, Alto Santracruz, Indie</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Analizator biochemiczny do testu czynnościowego wątroby</td></tr><tr><td>Betadine ( Povidon-Jod Solution)</td><td>Win-Medicare; &nbsp; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego (klasa I)</td><td>Kartos międzynarodowy; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola</td><td>Olympus, Japonia</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Myszy wsobne CBA/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Nr zapasowy 000654</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime (Taxim)</td><td>AlKem ; Indie</td><td></td><td>cefotaksym do wstrzykiwań sodu, brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>Sigma ; US</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Patyczki kosmetyczne</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd ; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma ; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Drape Sheet</td><td>JSD Surgicals, Delhi, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Roztwór Eozyny Y, alkoholowa</td><td>Sigma ; Kleszcze HT110132</td><td></td><td></td>amerykańskie</tr><tr><td></td><td>duże chirurgiczne; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>System znieczulenia gazowego</td><td>Ugo Basile; Włochy</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Himedia, Indie</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji (Veet)</td><td>Reckitt Benckiser, Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny, Mayer's</td><td>Sigma ; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa</td><td>Himedia; Indie</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder owiec</td><td>Sigma ; US</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>I.V. Kaniula (plusflon)</td><td>Mediplus, Indie</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD ; </td><td>Nr ref. US 303060</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran ( Foran)</td> <td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>Wziewny środek znieczulający</td></tr><tr><td>Ketamina (Ketamax)</td> <td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td><td></td><td>Chlorowodorek ketaminy IP, brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Meloxicam (Melonex)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Mikro uchwyty igłowe proste i zakrzywione</td><td>Mercian ; &nbsp; Anglia</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikro uchwyty igłowe proste & zakrzywiony</td><td>Mercian ; &nbsp; Anglia</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Histo-Line Laboratories, Włochy</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa nić</td><td>Potężna ; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Himedia; Indie</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Odświeżający żel do łez/mgiełki do oczu</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, Indie</td><td>P3060</td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Major Surgicals; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Główne chirurgiczne; Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ; US</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma ; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne nr 22</td><td>La Medcare, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Tablica chirurgiczna</td><td>wyprodukowana</td><td></td> lokalnie <td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Biała taśma chirurgiczna</td><td>3M Indie ; Indie</td><td>1530-1</td><td>Nici chirurgiczne z mikroporami</td></tr><tr><td></td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, Indie</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (1 ml, 26 g)</td> <td>Dispo Van; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Trymer (maszynka do strzyżenia)</td><td>Philips</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Braun</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; Indie</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Xylaxin)</td><td>Indian Immunologicals Limited</td><td></td><td>Środek uspokajający, przedznieczulający, przeciwbólowy i zwiotczający mięśnie</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja oka gryzonia

Microdissection of the Rodent Eye

Mikro-rozwarstwienie oka gryzonia polega na segmentacji wyłuszczonej gałki ocznej z dołączoną błoną oczną, czyli trzecią powieką, w celu uzyskania przedniej i tylnej gałki ocznej. Dzięki tej technice można uzyskać podczęści oka, w tym tkankę rogówki, tkankę nerwową, tkankę nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i soczewkę, do całościowego montażu, kriosekcji i/lub zawiesin jednokomórkowych określonej tkanki oka. Obecność trzeciej powieki ma wyjątkowe i znaczące zalety, ponieważ korzystnie wpływa na utrzymanie orientacji oka, co jest ważne dla zrozumienia fizjologii oka po każdej zlokalizowanej interwencji lub w badaniach obejmujących analizę oku odnoszącą się do topografii przestrzennej oka.
W tej metodzie, wyłuszczyliśmy gałkę oczną w oczodole wraz z trzecią powieką, ostrożnie i powoli przecinając mięśnie zewnątrzgałkowe i przecinając nerw wzrokowy. Gałka oczna została przebita przez rąbek rogówki za pomocą mikroostrza. Jako punkt wejścia wykorzystano nacięcie, pozwalające na przecięcie wzdłuż połączenia rogówkowo-twardówkowego poprzez wprowadzenie przez miejsce nacięcia mikronożyczek. Wykonywano małe i ciągłe nacięcia na obwodzie, aż do rozdzielenia miseczek. Można je dalej preparować, delikatnie złuszczając półprzezroczystą warstwę siatkówki nerwowej za pomocą kleszczy do szycia Colibri w celu uzyskania warstw siatkówki nerwowej i RPE. Ponadto wykonano trzy/cztery równoodległe cięcia od obwodu prostopadle do środka nerwu wzrokowego, aż do dotarcia do nerwu wzrokowego. To otworzyło półkuliste miseczki w kształt różyczki, dzięki czemu opadały płasko i można je było łatwo zamontować. Technika ta została zastosowana w naszym laboratorium do całych zrostów rogówki i odcinków siatkówki. Obecność trzeciej powieki wyznacza orientację nosowo-skroniową, co pozwala na badanie różnych interwencji terapii komórkowej po przeszczepie, a tym samym na ukierunkowaną walidację fizjologiczną niezbędną do wizualizacji i dokładnej reprezentacji w takich badaniach.

Przygotowano preparat całego oka/tkanki rogówki myszy rd1, aby zbadać potencjalną limfangiogenezę w tkance przedniej/rogówkowej w stanie chorobowym. Przylegająca tkanka spojówki z trzeciej powieki posłużyła jako kontrola pozytywna, ponieważ rogówka nie posiada naczyń limfatycznych. Na potrzeby badania tkankę rogówkową wypreparowano wraz ze spojówką i utrwalono w 4% PFA, a następnie poddano permeabilizacji i blokowaniu. Tkankę zabarwiono następnie przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko markerowi śródbłonka limfatycznego...

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Badania okulistyczne w dawnych czasach opierały się głównie na tkance oka zmarłych osób. Jednak z biegiem lat opracowano wiele okulistycznych modeli gryzoni, a zapotrzebowanie na ludzką tkankę oka zmniejszyło się. Ze względu na niewielkie rozmiary i ograniczony obszar operacji w oku gryzonia, skuteczny dostęp do części ocznych jest mocno ograniczony.Zazwyczaj, aby zoperować oko gryzonia, oko jest unieruchomione przez nerw wzrokowy i przeprowadzana jest sekcja. Ta praktyka jest żmudna i może uszkodzić delikatną tkankę, ponieważ kuliste oko nadal się porusza podczas sekcji. Pomimo tego, że technika ta jest korzystna w izolowaniu różnych odcinków warstw siatkówki, nie może wyznaczyć orientacji przestrzennej tkanki podczas sekcji tkanki.Co więcej, ukierunkowana interwencja jest trudna do zlokalizowania po rozwarstwieniu ze względu na jednorodny zespół komórkowy tylnej i przedniej muszki ocznej. W tym filmie zademonstrowano zmodyfikowaną metodę chirurgiczną mikrodysekcji. Obecność dołączonej błony niktytucyjnej, czyli trzeciej powieki, ma wyjątkowe i znaczące zalety.W tej metodzie najpierw wyłuszcza się gałkę oczną trzecią powieką, a następnie trzecią powieką służy się do unieruchomieni

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Ten rękopis przedstawia protokół histologicznego przygotowania preparatów z gałek ocznych gryzoni. Dzięki proponowanej metodzie wewnętrzną siatkówkę można łatwo zobrazować i ocenić pod mikroskopem świetlnym. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów.

Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj protokół mikrodysekcji oka gryzonia z wykorzystaniem błony migotkowej do immobilizacji tkanek. Ta metoda umożliwia precyzyjne izolowanie warstw siatkówki przy minimalnym uszkodzeniu delikatnych struktur oka.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Przeglądaj więcej filmów