Mikrodysekcja oka gryzonia

Badania okulistyczne w dawnych czasach opierały się głównie na tkance oka zmarłych osób. Jednak z biegiem lat opracowano wiele okulistycznych modeli gryzoni, a zapotrzebowanie na ludzką tkankę oka zmniejszyło się. Ze względu na niewielkie rozmiary i ograniczony obszar operacji w oku gryzonia, skuteczny dostęp do części ocznych jest mocno ograniczony.

Zazwyczaj, aby zoperować oko gryzonia, oko jest unieruchomione przez nerw wzrokowy i przeprowadzana jest sekcja. Ta praktyka jest żmudna i może uszkodzić delikatną tkankę, ponieważ kuliste oko nadal się porusza podczas sekcji. Pomimo tego, że technika ta jest korzystna w izolowaniu różnych odcinków warstw siatkówki, nie może wyznaczyć orientacji przestrzennej tkanki podczas sekcji tkanki.

Co więcej, ukierunkowana interwencja jest trudna do zlokalizowania po rozwarstwieniu ze względu na jednorodny zespół komórkowy tylnej i przedniej muszki ocznej. W tym filmie zademonstrowano zmodyfikowaną metodę chirurgiczną mikrodysekcji. Obecność dołączonej błony niktytucyjnej, czyli trzeciej powieki, ma wyjątkowe i znaczące zalety.

W tej metodzie najpierw wyłuszcza się gałkę oczną trzecią powieką, a następnie trzecią powieką służy się do unieruchomienia oka. Następnie przekłuwa się gałkę oczną przez rąbek rogówki, a nacięcie służy jako punkt wprowadzenia. Następnie, przecinając wzdłuż obwodu, oddziela się przednie i tylne muszle oczne.

Poprzez dalsze preparowanie tylnej muszli ocznej, półprzezroczysta warstwa siatkówki nerwowej jest identyfikowana i delikatnie odklejana. W ten sposób uzyskuje się warstwy neuronowe i RPE do dalszego przetwarzania. Trzecia powieka pozwoli nam wyznaczyć orientację przestrzenną oka po enukleacji.

Prześledźmy teraz szczegółową procedurę krok po kroku. Rozszerz oczy gryzoni za pomocą kropli 0,8% tropikamidu i 5% roztworów oftalmicznych fenylefryny i umieść zwierzę w ciemnym miejscu na 30 minut przed zabiegiem. Poddaj zwierzę eutanazji, podając dootrzewnowo pięciokrotne dawki znieczulenia.

Typowa dawka to 200 mikrolitrów PBS zawierająca 10 mg ketaminy i jedną mg ksylazyny. Potwierdź całkowity brak reakcji na bodziec, badając odruch pedałowania. Umieść mysz w pozycji bocznej, aby umożliwić pełny dostęp do oka.

Przygotuj do zabiegu kleszczyki do szycia Colibri, zakrzywione kleszcze, mikroostrze 15 stopni o rozmiarze trzech milimetrów, mikronożyczki sprężynowe i mikronożyczki sprężynowe pod kątem. Umieść zakrzywione kleszcze wokół gałki ocznej i uszczypnij, aby uwolnić oko od obcych przyczepów. Trzecia powieka, znana również jako błona nazębna, znajduje się w górnym rogu stycznej nosowej i może być zidentyfikowana jako niewielka półprzezroczysta wypukłość z pigmentowanymi granicami.

Następnie użyj mikronożyczek sprężynowych i przetnij wokół gałki ocznej. Małe, ciągłe nacięcia uwalniają gałkę oczną z przyczepów twardówki. Umieść zakrzywione mikronożyczki sprężynowe pod gałką oczną, aby uwolnić oko poprzez przecięcie nerwu wzrokowego.

Umieścić wyłuszczone oko na szalce Petriego zawierającej bufor PBS w taki sposób, aby gałka oczna była zanurzona w PBS. Niektóre mięśnie lub tkanki zewnątrzgałkowe zaczną odchodzić od gałki ocznej. Usuń je, odcinając je od gałki ocznej za pomocą mikronożyczek sprężynowych.

Następnie usuń nerw wzrokowy z podstawy gałki ocznej, aby umożliwić lepsze oddzielenie siatkówki w celu przygotowania całego montażu. Nie jest konieczne usuwanie nerwu wzrokowego w celu przekroju tkanek. Przenieś gałkę oczną do 1,5 ml probówki zawierającej jeden ml 4% paraformaldehydu lub PFA.

Trzymaj go przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu utrwalenia tkanek. Możliwe jest zatrzymanie się na tym etapie, pozostawiając tkankę w PFA na okres do 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jednak w przypadku izolacji żywych komórek nie należy wykonywać etapów utrwalania, a cała procedura musi być wykonywana w sposób ciągły.

Po utrwaleniu PFA przenieś gałkę oczną na szalkę Petriego zawierającą PBS i umieść ją pod mikroskopem preparacyjnym w celu wykonania kolejnej procedury. Unieruchomij gałkę oczną, mocno przytrzymując trzecią powiekę kleszczami do szycia Colibri. Rąbek to połączenie twardówkowo-rogówkowe.

Wykonaj małe nacięcie w rąbku, przekłuwając go za pomocą mikroostrza. Nacięcie wykonuje się najlepiej naprzeciwko trzeciej powieki. Następnie, używając tego nacięcia jako punktu wyjścia, za pomocą mikronożyczek wykonaj małe i ciągłe nacięcia wzdłuż obwodu rąbka twardówki rogówki.

Najpierw wykonaj półkole nacięć, zaczynając od punktu nacięcia do trzeciej powieki. Następnie wykonaj pozostałe półkole nacięć po drugiej stronie. Na koniec wykonaj nacięcie wokół trzeciej powieki, aby oddzielić tylną i przednią miseczkę.

Usuń soczewkę z tylnej miseczki za pomocą kleszczy, aby uzyskać tylną miseczkę składającą się z siatkówki nerwowej i warstwy RPE oraz przedniej miski rogówki. W przypadku pracy z nieutrwalonymi tkankami, przednie i tylne bańki mogą być teraz trawione enzymatycznie w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej rogówki lub siatkówki. W celu utrwalenia tkanek przenieś te kubki do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 1 ml 4% PFA na 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po utrwaleniu tkanka może być osadzona w odpowiednim podłożu i można wykonać kriosekcję lub cięcie parafinowe w celu uzyskania skrawków rogówki lub siatkówki. Ponownie wprowadzić tylną miseczkę na szalkę Petriego zawierającą bufor PBS. Nieprzezroczystą warstwą pigmentowanej warstwy RPE jest siatkówka nerwowa.

Oderwij siatkówkę nerwową za pomocą drugich kleszczy. Zaleca się bardzo delikatny i lekki ruch ręki, aby nie uszkodzić tkanki. Na wyjściu nerwu wzrokowego zakrzywione nożyczki sprężynowe można włożyć pod siatkówkę nerwową i wykonać cięcie, aby całkowicie uwolnić warstwy, jeśli siatkówka nerwowa pozostaje przyczepiona.

Siatkówkę można również uwolnić lub odczepić, delikatnie głaszcząc ją miękką szczoteczką. Ponownie wprowadzić bańkę przednią i tylną na płytkę Petriego zawierającą bufor PBS. Za pomocą skośnych mikronożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie obok trzeciej powieki od obrzeża prostopadle do środka optyki.

Trzymaj trzecią powiekę i wykonaj cięcie obok pierwszego cięcia. Wykonaj podobne cięcie między drugim cięciem a trzecią powieką. Trzy lub cztery takie równoodległe nacięcia otwierają półkuliste miseczki w kształt kwiatka, który opada płasko i można go łatwo zamontować.

Nie wykonuj bardzo głębokich nacięć aż do środka kubka, ponieważ może to spowodować, że sekcje liści łatwo się rozpadną lub rozdzielą. Płynne medium pozwala przedniej muszli ocznej uzyskać zakrzywioną strukturę. Wykonaj te same czynności, co przy wykonywaniu nacięć na tylnej miseczce, aby wykonać trzy lub cztery równoodległe nacięcia na przedniej miseczce.

Tkanki są teraz gotowe do dalszego barwienia. Na tym rysunku pokazano całą górę przedniej miseczki. Tkankę rogówki poddano mikrodysekcji zgodnie z opisem w celu odsłonięcia naczyń limfatycznych w tkance spojówkowej przyczepionej płatka rogówki.

Na tym rysunku pokazano całą siatkówkę nerwową. Unaczynienie siatkówki siatkówki nerwowej zostało zabarwione izolektyną i jest widoczne jako zielone naczynia. W tej metodzie wyłuszczona gałka oczna myszy jest uzyskiwana z dołączoną trzecią powieką, co zapewnia skuteczną i łatwą obsługę.

Trzecia powieka całkowicie unieruchamia gałkę oczną i pozwala na przeprowadzenie sekcji z łatwością i minimalną liczbą błędów. Ta metoda jest korzystna w przypadku sekcji specyficznych dla tkanki oka, analizy pojedynczych komórek i całych mas. Jednak potrzeba powtarzalnego utrwalania tkanek sprawia, że tkanka jest niezdolna do hodowli komórkowej lub takich potrzeb związanych z żywymi komórkami.

W związku z tym procedura musi być wykonywana w ciągłości w celu izolacji żywych komórek.