Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

Peptydy są badane jako nowe cząsteczki przeciwgrzybicze. Protokół ten może być wykorzystany do badania skuteczności przeciwgrzybiczej przeciwko ludzkiemu patogenowi grzybiczemu Candida albicans. Technika ta dostarcza danych ilościowych na temat aktywności przeciwgrzybiczej przy jednoczesnym skróceniu czasu eksperymentu i ilości odpadów z tworzyw sztucznych w porównaniu z innymi metodami, które wymagają tworzenia na agarze .

Oprócz testowania aktywności przeciwko Candida albicans, protokół ten może być wykorzystany do testowania aktywności przeciwko innym komórkom tworzącym drożdże oraz do testowania aktywności małocząsteczkowych środków przeciwgrzybiczych Rozpocznij od zaszczepienia pożądanego szczepu Candida albicans w 10 mililitrach płynnego ekstraktu drożdżowego-peptonu-dekstrozy lub pożywki YPD w probówce hodowlanej. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 230 obr./min na wytrząsarce obrotowej. Subkultura nocna kultura C. albicans i wzrost do gęstości optycznej około 1,0 do 1,2 przy długości fali 600 nanometrów.

Rozpuścić każdy peptyd w sterylnej wodzie i rozcieńczyć go do dwukrotności pożądanego najwyższego stężenia, a następnie dodać 40 mikrolitrów pożądanych roztworów podstawowych peptydów do pierwszego dołka w każdym rzędzie na okrągłodennej 96-dołkowej płytce. Następnie dodaj 20 mikrolitrów sterylnej ultraczystej wody do kolumn od 2 do 12 rzędów zawierających peptyd. Aby seryjnie rozcieńczyć roztwory podstawowe peptydów na płytce do kolumny 10, przenieś 20 mikrolitrów z kolumny 1 do kolumny 2 i wymieszaj, pipetując w górę i w dół.

Powtórzyć proces rozcieńczania do kolumny 10, która będzie zawierać 40 mikrolitrów roztworu peptydów w rozcieńczeniu 1 do 512 w stosunku do stężenia z kolumny 1. Po zakończeniu usuń 20 mikrolitrów roztworu peptydu z kolumny 10 i wyrzuć go. Przenieś subkulturę C.albicans do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj przy 3 900 g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant przez pipetowanie lub dekantację. Zawiesić osad z 1 mililitrem 2-milimolowego buforu fosforanu sodu i przenieść zawiesinę do 1,7-mililitrowej probówki wirówkowej. Osadzać komórki przez odwirowanie i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawieś osad w 1 mililitrze 2-milimolowego buforu fosforanu sodu i umyj jeszcze 2 razy, aby pozostawić umyte komórki w 1 mililitrze buforu fosforanu sodu. Określić gęstość komórek przemytej zawiesiny komórek i rozcieńczyć zawiesinę do 5 razy 10 do 5 komórek na mililitr w 2-milimolowym buforze fosforanu sodu. Wziąć rozcieńczoną zawiesinę komórek C. albicans i dodać 20 mikrolitrów do kolumn 1 do 10 i kolumny 12 każdego rzędu, a następnie dodać 20 mikrolitrów 2-milimolowego buforu fosforanu sodu do kolumny 11.

Przykryj płytkę 1 i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza na 30 minut. Przygotuj nową 96-dołkową płytkę hodowlaną, aby określić ilościowo żywotność, dodając 100 mikrolitrów YPD do wszystkich studzienek na płytce nr 2, a następnie dodaj 100 mikrolitrów 2-milimolowego buforu fosforanu sodu do wszystkich studzienek na płytce 2. Aby rozcieńczyć próbki na płytce 1, pobrać płytkę 1 z inkubatora i dodać 280 mikrolitrów 1-milimolowego buforu fosforanu sodu do każdej studzienki.

Po dokładnym wymieszaniu zawartości pipetą przenieść 8 mikrolitrów z płytki 1 do odpowiedniego dołka płytki 2. Po zakończeniu umieść przykrytą płytkę 2 na wytrząsarce do mikromiareczkowania z prędkością 350 obr./min na 17 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Wymieszać wszystkie studzienki na płytce 2, pipetując w górę i w dół, upewniając się, że wszystkie komórki są ponownie zawieszone.

Uzyskaj odczyty gęstości optycznej przy długości fali 600 nanometrów dla każdej studzienki na płytce 2 za pomocą czytnika płytek absorbancji. Wykreślić zmniejszenie żywotności w funkcji stężenia peptydów, aby obliczyć procent zahamowania wzrostu i określić wpływ peptydów na wzrost C. albicans. Po inkubacji peptydów z komórkami C. albicans, aktywność przeciwgrzybicza została określona ilościowo przy użyciu jednostek tworzących kolonie lub metody liczenia CFU i opisanego protokołu obejmującego pomiary gęstości optycznej.

Dane wykorzystujące odczyty gęstości optycznej były wysoce powtarzalne, na co wskazują niewielkie odchylenia standardowe kontrprób. Wykonując ten protokół, utrzymuj komórki Candida albicans w postaci drożdży, inkubując komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza, ponieważ pomiary gęstości optycznej w komórkach strzępkowych nie są wiarygodne. Skuteczność tej metody pozwoliła naukowcom na przeprowadzenie potrójnych badań nad aktywnością peptydów poprzez testowanie większej liczby peptydów i stężeń peptydów.