Name: Obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Poznaj mikroskopię arkusza świetlnego do nieinwazyjnego obrazowania ślimaka u myszy i człowieka. Ta metoda umożliwia analizę zmian patologicznych, takich jak utrata neuronów spiralnych, bez mechanicznego uszkodzenia tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte grantami z National Institute on Deafness and Other Communication Disorders of the National Institutes of Health, Kellogg Foundation oraz prywatnymi darowiznami od Bridget Sperl i Johna McCormicka. TSLIM został opracowany przy doskonałej pomocy Matthiasa Hillenbranda, Kerstin John, Meike Lawin, Michela Layhera, Tobiasa Schroetera, Petera Schachta, Olivera Dannberga i Juliana Wuestera z Uniwersytetu Technicznego w Illmenau w Niemczech, pod nadzorem ich mentorów (Stefana Sinzingera i Rene Theski) oraz Jamesa Legera.

Wszystkie procedury i wykorzystanie żywych zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone (ID protokołu #2010-38573A) przez University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC), a badacze, którzy używają tych zwierząt, zostali dokładnie przeszkoleni i przetestowani przez weterynarzy Research Animal Resources (RAR), zanim uzyskali dostęp do obiektów dla zwierząt. W tym badaniu wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy.
1. Usuwanie ślimaka w celu utrwalenia i przetwarzania tkanek do obrazowania
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji CO2 . Odetnij głowę myszy nożyczkami i wykonaj grzbietowo-brzuszne nacięcie mózgu, aby wykonać hemisekcję czaszki. Usuń mózg, zidentyfikuj okrągłą pęcherz w podstawno-brzusznej części czaszki, otwórz pęcherz za pomocą rongeurs i uwidocznij i usuń ślimak.</li>
	<li>Fiksacja: Wykonaj tę procedurę pod wyciągiem i przy użyciu mikroskopu preparacyjnego przy 5-krotnym powiększeniu. Nosić rękawice i odzież ochronną. Nakłuj owalne okienko i usuń strzemiączko ostrym kilofem. Włóż kilof do okrągłego okienka, aby przebić membranę.</li>
	<li>Przykryj otwarte okrągłe okienko odciętą końcówką zestawu do infuzji dołączonego do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 2 ml formaliny. Powoli wlewaj formalinę przez przestrzenie okołolimfatyczne ślimaka przez okres 2 minut, zauważając, że formalina wydostaje się ze ślimaka przez otwarte owalne okienko. Odetnij nadmiar tkanki ze ślimaka i zanurz w butelce zawierającej 10% formaliny, a następnie umieść na noc na rotatorze.</li>
	<li>Odwapnienie: Przepłukać ślimak w PBS 3x przez 5 minut każdy i zanurzyć w butelce zawierającej 10% roztwór disodowego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na zmianę na 4 dni, codziennie zmieniając roztwór.</li>
	<li>Odwodnienie: Ukrwić ślimak PBS 3x i zanurzyć na 15 minut między zmianami. Odwodnić ślimak rosnącymi stężeniami etanolu 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; przez 30 min w każdym stężeniu. 
	UWAGA: Ważne jest, aby usunąć całe EDTA przed odwodnieniem, ponieważ EDTA wytrąca się w etanolu. Ponadto ślimaki można pozostawić na noc w dowolnym stężeniu etanolu większym niż 70%.</li>
	<li>Barwienie: Cały ślimak należy zabarwić przez zanurzenie w roztworze izotiocynianu rodaminy B (5 μg/ml w 100% etanolu) przez noc z rotacją. Usuń nadmiar barwnika ze ślimaka, zmieniając dwukrotnie 100% etanol, po 5 minut każda.</li>
	<li>Oczyszczanie: Przenieść wybarwiony ślimak do dwóch odmian roztworu Spalteholz12 (salicylan metylu 5:3:benzoesan benzylu), 30 minut każdej zmiany i pozostawić na noc w roztworze oczyszczającym na zmianę. Ślimaki można pozostawić w roztworze Spalteholza na czas nieokreślony.</li>
</ol>
2. Obrazowanie ślimaków
<ol>
	<li>Przymocuj ślimak do pręta próbki na owalnym i okrągłym końcu membrany okiennej, tak aby roztwór czyszczący pozostał w ślimaku i nie powstały pęcherzyki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Należy uważać, aby w ślimaku nie tworzyły się pęcherzyki, ponieważ są one trudne do usunięcia, a pozostawione w tkance spowodują artefakty obrazowania.</li>
	<li>Użyj kleju aktywującego promieniowanie UV, aby przymocować mokry ślimak do pręta z suchą próbką (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Przymocuj ślimak na owalnym i okrągłym końcu okienka. Utwardzaj klej UV przez 10 sekund, poruszając się po ślimaku za pomocą światła UV. 
	UWAGA: Luźne przymocowanie ślimaka do pręta próbki spowoduje wady obrazowania. Ten pręt jest specjalnie wyprodukowany dla tego protokołu (szczegóły w Santi et al.8) i jest specyficzny dla naszego mikroskopu z arkuszami świetlnymi.</li>
	<li>Zawiesić ślimak w komorze obrazowania wypełnionej roztworem Spalteholza do obrazowania. Komora na próbki to optycznie przezroczysta cela fluorometru kwarcowego (Wideo 1).</li>
	<li>Przymocuj pręt próbki do obrotowego uchwytu, który jest również przymocowany do stolika translacyjnego XZ. Większość stosów uzyskuje się przez translację próbki w płaszczyznach XZ, ale można również uzyskać stosy rotacyjne.</li>
	<li>Sekcja optyczna TSLIM: Użyj niebieskiego lub zielonego lasera do wzbudzenia w zależności od rodzaju barwienia fluorochromem. Umieść arkusz światła na środku tkanki w celu ustawienia ostrości i określ powiększenie, które zostanie użyte do oświetlenia całej szerokości ślimaka. Następnie użyj specjalnie zaprojektowanego programu, aby przesunąć próbkę przez arkusz świetlny w poprzek próbki w osi X (zszywanie obrazu) i w krokach Z, aby utworzyć stos obrazów 2D w całym ślimaku.</li>
	<li>W przypadku pierwszego obrazu, pas belki arkusza świetlnego jest umieszczony na krawędzi próbki, a program skanuje całą szerokość próbki, zbierając kolumny danych (patrz łączenie obrazu; Santi et al.8), które są szerokością parametru konfokalnego (Rysunek 3) w celu uzyskania złożonego obrazu 2D o maksymalnej rozdzielczości na całej szerokości próbki. Program automatyzuje zszywanie obrazu dla każdego kroku Z, aż do całkowitego zobrazowania próbki.</li>
	<li>Przetwarzanie obrazu: Przenieś stos obrazów na inny komputer i załaduj go do programu do renderowania 3D w celu rekonstrukcji 3D i kwantyfikacji.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sekcja optyczna za pomocą mikroskopii arkuszowej światła w celu zbadania struktur ślimaka nie jest mechanicznie destrukcyjna, jak inne, bardziej tradycyjne metody histologiczne, i zapewnia pełny cyfrowy obraz struktur ślimaka względem siebie. Poprzednie metody, takie jak przygotowanie powierzchni narządu Cortiego14 , dostarczyły mapy utraty komórek rzęsatych na całej długości błony podstawnej, ale utraty SGN nie można było ocenić, ponieważ tkanka została wycięta w celu odsłonięcia narządu Cortiego...

Ślimak jest obwodowym narządem zmysłów dla słuchu u ssaków. Ma złożoną spiralną anatomię powtarzających się komórek czuciowych i nośnych, które są anatomicznie wyspecjalizowane w wykrywaniu wibracji dźwiękowych i przekazywaniu ich do mózgu w celu percepcji słuchu. Głównymi elementami czuciowymi są wewnętrzne i zewnętrzne komórki rzęsate oraz ich unerwiające włókna nerwowe, których ciała komórkowe tworzą spiralny zwój, który znajduje się w kanale Rosenthala (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Te struktury czuciowe i neuronalne są ułożone tonotopowo w taki sposób, że dźwięki o wysokiej częstotliwości są transdukowane w podstawie ślimaka, a dźwięki o niskiej częstotliwości są transdukowane w ślimaku apex2. Mapa anatomiczna tego rozmieszczenia komórek czuciowych wzdłuż spiralnej długości podtrzymującej błony podstawnej nazywana jest cytocochleogram3 i może być porównana z ubytkiem słuchu w funkcji częstotliwości, jak pokazano na audiogramie.
Błoniasty labirynt ślimaka, który jest otoczony gęstą kością, sprawia, że technicznie trudno jest badać więcej niż jedną strukturę ślimaka na raz. Dlatego uzasadnieniem dla opracowania mikroskopu z arkuszami świetlnymi jest wytworzenie dobrze wyrównanych seryjnych odcinków całego ślimaka, tak aby wszystkie struktury ślimaka mogły być badane względem siebie w rekonstrukcjach 3D. Voie i wsp.4 oraz Voie i Spelman5 zaprojektowali pierwszy mikroskop z arkuszami świetlnymi, zwany mikroskopem OPFOS (ang. orthogonal plane fluorescence optical sectioning), do optycznego przekroju całego ślimaka. Jednak mikroskop ten nigdy nie został opracowany komercyjnie; dlatego naszym celem było skonstruowanie mikroskopu z lekką blachą zwanego cienkowarstwowym mikroskopem obrazowania laserowego (TSLIM; <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Szczegóły projektu i konstrukcji dla TSLIM zostały wcześniej opublikowane8. Firma TSLIM wprowadziła kilka ulepszeń w stosunku do OPFOS, w tym wykorzystanie kamery cyfrowej o słabym oświetleniu w porównaniu z kamerą CCD do zbierania obrazów, optycznie kodowane mikropozycjonery do dokładnego i powtarzalnego ruchu próbki przez arkusz świetlny, zastosowanie dostępnej na rynku, optycznie przezroczystej komory na próbki oraz barwienie rodaminą w etanolu, a nie w roztworze czyszczącym, aby zapobiec wytrącaniu się plam w tkance. Komercyjny rozwój mikroskopów arkuszowych, takich jak SPIM6, skupił się na obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości żywych, małych, przezroczystych preparatów, ale nie nadają się one do obrazowania całego ślimaka, ponieważ nie mają odpowiedniej odległości roboczej. Przegląd rozwoju innych mikroskopów z arkuszami świetlnymi został opublikowany przez Santi7. Główną przewagą TSLIM nad innymi metodami histologicznymi do badania ślimaka jest optyczne cięcie tkanek w celu rekonstrukcji 3D przy jednoczesnym zachowaniu integralności próbki, dzięki czemu można ją wykorzystać innymi metodami histologicznymi. Kolejną zaletą obrazowania TSLIM jest to, że tylko cienka warstwa światła wytworzona przez laser jest naświetlana na tkankę, w porównaniu z ekspozycją na lasera o całej grubości tkanki, jak w mikroskopii konfokalnej. Oczyszczanie tkanek w celu zminimalizowania rozproszenia światła oraz fakt, że tylko niewielka część tkanki jest wystawiona na działanie lasera, powoduje minimalne blaknięcie fluorochromu (fotowybielanie) dzięki obrazowaniu laserowemu za pomocą arkuszy świetlnych. Jednak proces utrwalania, odwadniania i oczyszczania zmienia morfologię struktur ślimaka i powoduje kurczenie się tkanek w porównaniu z żywymi tkankami. Rzeczywista wielkość skurczu tkanek, który występuje, nie została określona.
TSLIM został opracowany przez Shane'a Johnsona i ośmiu niemieckich studentów inżynierii optycznej (zobacz Podziękowania). Szczegóły budowy TSLIM zostały dostarczone przez Santi et al.8 oraz wersję skanującą (sTSLIM) przez Schröter et al.9. TSLIM funkcjonuje jako nieniszczący mikrotom do optycznego cięcia próbek oraz jako mikroskop do zbierania seryjnych przekrojów 2D na całej szerokości i grubości ślimaka. TSLIM może obrazować zarówno małe (mm), jak i duże (cm), grube próbki. Soczewki są montowane pneumatycznie, co pozwala na pracę na duże odległości z obiektywami do zbierania 1x i 2x na mikroskopie preparacyjnym. Mikroskop preparacyjny posiada również optykę zmiennoogniskową, która pozwala TSLIM na rozdzielenie struktur subkomórkowych i synaptycznych na komórkach. TSLIM jest wyposażony zarówno w niebieski (473 nm), jak i zielony (532 nm) laser do oświetlenia, który pozwala na użycie różnych sond fluorescencyjnych do obrazowania. Celem projektu TSLIM jest wytworzenie dobrze dopasowanych przekrojów optycznych 2D w całym ślimaku w celu kompletnej cyfrowej rekonstrukcji tkanek ślimaka. Ponieważ jest to metoda fluorescencyjna, ligandy i immunohistochemia mogą być również wykorzystywane do identyfikacji określonych struktur ślimaka.
Początkowo cylindryczna soczewka była używana do produkcji dwóch przeciwstawnych gaussowskich arkuszy światła, ale wytworzyła artefakty obrazowania absorpcyjnego. Ze względu na pracę Keller et al.10, stała soczewka cylindryczna została zastąpiona lustrem galwanometru skaningowego, aby uzyskać arkusz świetlny9. Ponadto, ponieważ środek arkusza świetlnego jest najcieńszy w pasie belki, obrazy 2D sTSLIM są tworzone poprzez zebranie kompozytu kolumn danych osi X na całej szerokości próbki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Ta metoda została po raz pierwszy opisana przez Buytaerta i Dircksa11. Niestandardowe oprogramowanie TSLIM do sterowania i zbierania obrazów zostało opracowane przy użyciu graficznego programu do sterowania urządzeniami. Arkusz światła przechodzi przez próbkę i oświetla płaszczyznę fluorescencyjną w tkance. Ta płaszczyzna fluorescencyjna jest rzutowana prostopadle przez przezroczystą próbkę i jest zbierana przez mikroskop preparacyjny. Optycznie kodowane mikropozycjonery umożliwiają skanowanie przez pas wiązki w osi X w celu zebrania pojedynczego złożonego obrazu 2D, a następnie mikropozycjoner osi Z przesuwa próbkę na głębszą płaszczyznę w tkance, aby uzyskać stos szeregowych, przekrojonych obrazów 2D (Wideo 1, <silna klasa = "xfig">Rysunek 4). Stos obrazów translacyjnych jest zbierany na całej szerokości, grubości i długości ślimaka, a zszywanie obrazów nie jest wymagane (film 2). Stos obrazów jest przenoszony do innego komputera i ładowany do programu do renderowania 3D w celu rekonstrukcji 3D i kwantyfikacji. Stosy obrazów zawierają wszystkie cyfrowe informacje o morfologii ślimaka w rozdzielczości mikroskopu. Jeśli jednak wymagana jest wyższa rozdzielczość, nienaruszony ślimak można dalej przetwarzać za pomocą destrukcyjnych metod histologicznych, takich jak cięcie mikrotomowe, skanowanie i transmisyjna mikroskopia elektronowa.
Program do renderowania 3D służy do segmentacji różnych struktur ślimaka do renderowania 3D i analizy ilościowej. W celu segmentacji każda struktura na każdym obrazie 2D stosu jest śledzona za pomocą innego koloru za pomocą tabletu graficznego i pióra (Rysunek 5). Do tej pory podzielono na segmenty 20 różnych struktur ślimaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 6). Po segmentacji można wykonać różnorodne analizy 3D. Na przykład oprogramowanie do renderowania 3D może wirtualnie przeciąć ślimak w dowolnej płaszczyźnie wzdłuż środka ciężkości struktury. Wideo 3 pokazuje przekrój styczny do narządu Cortiego, który odsłania komórki rzęsate wzdłuż błony podstawnej. Proces ten wymaga najpierw ręcznej segmentacji interesującej nas struktury. Następnie środek ciężkości konstrukcji jest obliczany na podstawie dopasowania metodą najmniejszych kwadratów punktów splajnu umieszczonych wzdłuż środka konstrukcji od jej podstawy do wierzchołka, co pozwala na przybliżenie długości konstrukcji (wideo 4). Podobny proces zwany szkieletyzacją można wykorzystać do wizualizacji promieniowej szerokości konstrukcji wzdłuż jej długości za pomocą mapy kolorów (wideo 4). Całkowita objętość każdej struktury jest obliczana przez program po segmentacji, ale odległości względne można również określić ilościowo i wizualizować za pomocą map kolorów w oprogramowaniu do renderowania 3D (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7). Struktury segmentowe można również eksportować w celu uzyskania powiększonych, solidnych renderingów modeli z tworzywa sztucznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 8). Ponadto półautomatyczne zliczanie komórek może być również wykonywane za pomocą oprogramowania do renderowania 3D (<silna klasa="xfig">Rysunek 9). Immunohistochemia i wiązanie ligandów mogą być wykorzystywane do barwienia określonych struktur ślimaka, a struktury te można wyizolować od innych struktur ślimaka w celu oceny morfometrycznej, takiej jak wytworzenie cytocochleogramu (<silna klasa="xfig">Rysunek 10). Długość, szerokość, powierzchnię, objętość i liczbę wszystkich struktur ślimaka można określić na podstawie modeli 3D, co czyni to podejście idealnym do mapowania uszkodzeń ślimaka w przypadku zaburzeń funkcjonalnych. W szczególności uszkodzenia ślimaka spowodowane starzeniem się, urazami wywołanymi hałasem lub innymi urazami można pokazać i określić ilościowo w rekonstrukcjach ślimaka 3D z sekcji optycznych 2D. Po digitalizacji ślimaka istnieje wiele algorytmów obrazowania, które można wykorzystać do oceny uszkodzenia ślimaka dowolnej tkanki w ślimaku w rejestrze anatomicznym na inne tkanki ślimaka.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie do renderowania 3D</td><td>Amira ThermoFisher Adres naukowy</td><td></td><td>: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>benzoesan benzylu (W213810)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Adres: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic&nbsp;</td><td>Bondic&nbsp;</td><td></td><td>Adres: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada</td></tr><tr><td>Etanol 95% i 100%&nbsp;</td><td>University of Minnesota</td><td></td><td>Adres: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455</td></tr><tr><td>Dihydrat soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)&nbsp; (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Adres: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Program graficzny LabVIEW i Vision</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Adres: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>salicylan metylu (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Adres: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny Olympus MVX10</td><td>Olympus Corp</td><td></td><td>Adres: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Izotiocynian rodaminy B, (283924)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Adres: skrytka pocztowa, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Komórka flurometru Starna (3-G-20)</td><td>Komórka</td><td></td> Starna <td>Adres: skrytka pocztowa 1919, Atascadero, CA 82423</td></tr></tbody></table>

obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Głuchota jest najczęstszym zaburzeniem sensorycznym, dotykającym około 5% lub 430 milionów ludzi na całym świecie, według Światowej Organizacji Zdrowia1. Starzenie się lub starczowzroczność jest główną przyczyną odbiorczego ubytku słuchu i charakteryzuje się uszkodzeniem komórek rzęsatych, neuronów spiralnych (SGN) i prążkowia naczyniowego. Struktury te znajdują się w ślimaku, który ma złożoną, spiralną anatomię błoniastych tkanek zawieszonych w płynie i otoczonych kością. Właściwości te sprawiają, że technicznie trudne jest zbadanie i ilościowe określenie zmian histopatologicznych. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opracowaliśmy mikroskop arkuszowy światła (TSLIM), który może obrazować i digitalizować cały ślimak, aby ułatwić badanie zależności między strukturą a funkcją w uchu wewnętrznym. Dobrze wyrównane sekcje szeregowe całego ślimaka tworzą stos obrazów do trójwymiarowego (3D) renderowania objętości i segmentacji poszczególnych struktur w celu wizualizacji 3D i analizy ilościowej (tj. długości, szerokości, powierzchni, objętości i liczby). Ślimaki wymagają minimalnych etapów przetwarzania (utrwalanie, odwapnienie, odwadnianie, barwienie i oczyszczanie optyczne), z których wszystkie są kompatybilne z późniejszym obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości za pomocą skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ponieważ wszystkie tkanki są obecne w stosach, każda struktura może być oceniana indywidualnie lub w odniesieniu do innych struktur. Ponadto, ponieważ obrazowanie wykorzystuje sondy fluorescencyjne, immunohistochemia i wiązanie ligandów mogą być wykorzystywane do identyfikacji określonych struktur i ich objętości lub rozmieszczenia 3D w ślimaku. Tutaj użyliśmy TSLIM do zbadania ślimaków od starszych myszy w celu ilościowego określenia utraty komórek rzęsatych i neuronów spiralnych zwojów. Ponadto wykorzystano zaawansowane analizy (np. analizę skupień) do wizualizacji lokalnych redukcji neuronów zwoju spiralnego w kanale Rosenthala wzdłuż jego objętości 3D. Podejścia te pokazują zdolność mikroskopii TSLIM do ilościowego określania zależności struktura-funkcja w ślimakach i między ślimakami.

Ponieważ tematem tego specjalnego wydania jest obrazowanie skutków starzenia się w ślimaku, jako przykłady zostaną wykorzystane ślimaki myszy młodej (3-miesięcznej, HS2479, szczep CBA) oraz myszy starej (23-miesięcznej, HS2521, szczep C57). Należy zauważyć, że TSLIM umożliwia obrazowanie wielu rodzajów preparatów, w tym ślimaków ludzi, ssaków, innych gryzoni i ryb, a także innych organów, takich jak mózg.
Johnson i wsp. 13 opublikowali artykuł na temat SGN u młodych (3-...

Mikroskop z arkuszami świetlnymi został opracowany do obrazowania i digitalizacji całego ślimaka.

Obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Opracowaliśmy mikroskop arkuszowy światła, który może zdigitalizować cały ślimak. Ten mikroskop ma zamontowane na powietrzu obiektywy o dużej odległości roboczej, które mogą obrazować małe ślimaki myszy aż do dużej ludzkiej kości skroniowej. Seryjnie kroi ślimak za pomocą wiązki laserowej, nie powodując przy tym żadnych uszkodzeń mechanicznych.Nasza metoda obrazowania może być wykorzystana do oceny zmian patologicznych w ślimaku, takich jak utrata komórek rzęsatych i neuronów spiralnych z powodu starzenia się. Po eutanazji i odcięciu głowy myszy wykonaj grzbietowo-brzuszne nacięcie mózgu, aby wykonać hemisekcję czaszki. Usuń mózg i zidentyfikuj okrągłą bullę w podstawno-brzusznej części czaszki.Otwórz bullę za pomocą rongeurs. Następnie zwizualizuj i usuń ślimak. Pod mikroskopem preparacyjnym przy pięciokrotnym powiększeniu nakłuj owalne okienko i usuń strzemiączko ostrym kilofem.Następnie włóż kilof do okrągłego okienka, aby przebić membranę. Aby wykonać utrwalenie, przykryj otwarte okrągłe okienko odciętą końcówką zestawu infuzyjnego, który jest przymocowany do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej dwoma mililitrami formaliny. Powoli wlewaj formalinę przez przestrzenie perylimfatyczne ślimaka przez dwie minuty, upewniając się, że formalina wydostaje się ze ślimaka przez otwarte owalne okienko.Odetnij nadmiar tkanki ze ślimaka. Zanurz go w butelce zawierającej 10% formaliny i umieść na noc na rotatorze. W celu odwapnienia należy trzykrotnie przepłukać ślimak w PBS przez pięć minut każdy.Zanurzyć w butelce zawierającej 10% roztwór EDTA. Inkubuj go przez cztery dni z rotacją, codziennie zmieniając roztwór. Następnie trzykrotnie przeprowadź perfuzję ślimaka za pomocą PBS i zanurz na 15 minut między zmianami, aby usunąć całe EDTA.Po umyciu należy odwodnić ślimak rosnącymi stężeniami etanolu przez 30 minut w każdym stężeniu. Zabarwić cały ślimak przez zanurzenie w roztworze rodaminy B na noc z rotacją. Usuń nadmiar barwnika ze ślimaka za pomocą dwóch zmian 100% etanolu z inkubacją przez pięć minut na każdą zmianę.Przenieść zabarwiony ślimak do dwóch podmian roztworu Spalteholza na 30 minut przy każdej zmianie. Pozostawić na noc w roztworze do klarowania na zmianę. Przymocuj ślimak do pręta z próbką na owalnym i okrągłym końcu błony okiennej.Upewnij się, że roztwór czyszczący pozostaje w ślimaku i nie tworzą się pęcherzyki. Przymocuj owalne i okrągłe końce mokrego ślimaka do pręta do suchej próbki za pomocą kleju aktywującego promieniowanie UV. Utwardź klej UV przez 10 sekund, poruszając się po ślimaku za pomocą światła UV.Zawiesić ślimak w komorze obrazowania w optycznie przezroczystej celi fluorometru kwarcowego wypełnionej roztworem Spalteholza z prętem próbki przymocowanym do obrotowego uchwytu, który jest również przymocowany do stolika translacyjnego X/Z. Następnie użyj specjalnie zaprojektowanego programu, aby przesunąć próbkę przez arkusz świetlny w krokach osi X i Z i utwórz stos obrazów 2D w całym ślimaku. Aby przetworzyć obraz, przenieś stos obrazów do innego komputera i załaduj go do programu do renderowania 3D w celu rekonstrukcji 3D i kwantyfikacji.Bezpośrednie odwzorowanie objętości ślimaka myszy pokazało owalne i okrągłe okna, narząd Cortiego z komórkami rzęsatymi, kanał Rosenthala był podzielony na segmenty i odwzorowany objętość, a także pokazał spiralne neurony zwojowe lub SGN na całej jego długości. Za pomocą TSLIM zobrazowano ślimak trzymiesięcznej młodej myszy i 23-miesięcznej myszy i policzono ją pod kątem SGN. Liczba komórek SGN w funkcji odległości kanału Rosenthala przedstawiona na wykresie liniowym wykazała większe SGN u młodszego zwierzęcia w środkowym i wierzchołkowym końcu ślimaka w porównaniu ze starszym zwierzęciem.Ta pozorna utrata SGN została zwizualizowana za pomocą analizy skupień i oprogramowania do renderowania 3D. Różnice gęstości SGN zostały przedstawione na skali kolorów, gdzie klastry o dużej gęstości są żółte, a niebieskie reprezentują obszary o niższej gęstości. Analiza skupień wyraźnie obrazowała obszary o mniejszej gęstości komórek wzdłuż kanału Rosenthala.Mikroskopia arkuszy świetlnych została zaprojektowana w celu wytworzenia dobrze wyrównanego stosu obrazów, z których można produced. 3D renderowanie objętościowe 3D struktur, a programy do renderowania pozwalają na ilościową ocenę struktur i relacji anatomicznych między różnymi strukturami. Ponieważ jednak programy do renderowania 3D oferują wiele różnych parametrów użytkownika, istnieje znaczna krzywa uczenia się, aby efektywnie korzystać z tych programów.

imaging-the-aging-cochlea-with-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Danio pręgowany to modelowy system, który posiada wiele cennych cech, w tym przejrzystość optyczną, szybki rozwój zewnętrzny oraz, co szczególnie ważne dla dziedziny słuchu i równowagi, zewnętrznie zlokalizowane czuciowe komórki rzęsate. W tym artykule opisano, w jaki sposób transgeniczny danio pręgowany może być używany do oznaczania zarówno mechanosensacji komórek rzęsatych, jak i funkcji presynaptycznych in toto.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych w linii bocznej u larw danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

Tutaj prezentujemy protokół dla Mikroskopii Konduktancji Jonów Sondy Skaczącej (HPICM), techniki bezkontaktowej sondy skanującej, która umożliwia nanoskalowe obrazowanie wiązek stereorzęsek w żywych słuchowych komórkach rzęsatych.

Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków

Przedstawiono protokół przetwarzania ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków poprzez immunoznakowanie aferentnych struktur synaptycznych i komórek rzęsatych, wygaszanie autofluorescencji w starzejącej się tkance, preparowanie i szacowanie długości ślimaka oraz ilościowe określanie synaps w stosach obrazów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego.

Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Tutaj prezentujemy protokół dla mysiego modelu ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). Aby wywołać NIHL, opracowaliśmy nowe i proste urządzenie wykorzystujące tekturę falistą, klatkę pułapkę na szczury i głośnik. Odpowiedź słuchowa pnia mózgu i obrazowanie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do oceny odpowiednio funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

Poznaj mikroskopię arkusza świetlnego do nieinwazyjnego obrazowania ślimaka u myszy i człowieka. Ta metoda umożliwia analizę zmian patologicznych, takich jak utrata neuronów spiralnych, bez mechanicznego uszkodzenia tkanek.

Obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych

Przeglądaj więcej filmów