Obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych

Opracowaliśmy mikroskop arkuszowy światła, który może zdigitalizować cały ślimak. Ten mikroskop ma zamontowane na powietrzu obiektywy o dużej odległości roboczej, które mogą obrazować małe ślimaki myszy aż do dużej ludzkiej kości skroniowej. Seryjnie kroi ślimak za pomocą wiązki laserowej, nie powodując przy tym żadnych uszkodzeń mechanicznych.

Nasza metoda obrazowania może być wykorzystana do oceny zmian patologicznych w ślimaku, takich jak utrata komórek rzęsatych i neuronów spiralnych z powodu starzenia się. Po eutanazji i odcięciu głowy myszy wykonaj grzbietowo-brzuszne nacięcie mózgu, aby wykonać hemisekcję czaszki. Usuń mózg i zidentyfikuj okrągłą bullę w podstawno-brzusznej części czaszki.

Otwórz bullę za pomocą rongeurs. Następnie zwizualizuj i usuń ślimak. Pod mikroskopem preparacyjnym przy pięciokrotnym powiększeniu nakłuj owalne okienko i usuń strzemiączko ostrym kilofem.

Następnie włóż kilof do okrągłego okienka, aby przebić membranę. Aby wykonać utrwalenie, przykryj otwarte okrągłe okienko odciętą końcówką zestawu infuzyjnego, który jest przymocowany do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej dwoma mililitrami formaliny. Powoli wlewaj formalinę przez przestrzenie perylimfatyczne ślimaka przez dwie minuty, upewniając się, że formalina wydostaje się ze ślimaka przez otwarte owalne okienko.

Odetnij nadmiar tkanki ze ślimaka. Zanurz go w butelce zawierającej 10% formaliny i umieść na noc na rotatorze. W celu odwapnienia należy trzykrotnie przepłukać ślimak w PBS przez pięć minut każdy.

Zanurzyć w butelce zawierającej 10% roztwór EDTA. Inkubuj go przez cztery dni z rotacją, codziennie zmieniając roztwór. Następnie trzykrotnie przeprowadź perfuzję ślimaka za pomocą PBS i zanurz na 15 minut między zmianami, aby usunąć całe EDTA.

Po umyciu należy odwodnić ślimak rosnącymi stężeniami etanolu przez 30 minut w każdym stężeniu. Zabarwić cały ślimak przez zanurzenie w roztworze rodaminy B na noc z rotacją. Usuń nadmiar barwnika ze ślimaka za pomocą dwóch zmian 100% etanolu z inkubacją przez pięć minut na każdą zmianę.

Przenieść zabarwiony ślimak do dwóch podmian roztworu Spalteholza na 30 minut przy każdej zmianie. Pozostawić na noc w roztworze do klarowania na zmianę. Przymocuj ślimak do pręta z próbką na owalnym i okrągłym końcu błony okiennej.

Upewnij się, że roztwór czyszczący pozostaje w ślimaku i nie tworzą się pęcherzyki. Przymocuj owalne i okrągłe końce mokrego ślimaka do pręta do suchej próbki za pomocą kleju aktywującego promieniowanie UV. Utwardź klej UV przez 10 sekund, poruszając się po ślimaku za pomocą światła UV.

Zawiesić ślimak w komorze obrazowania w optycznie przezroczystej celi fluorometru kwarcowego wypełnionej roztworem Spalteholza z prętem próbki przymocowanym do obrotowego uchwytu, który jest również przymocowany do stolika translacyjnego X/Z. Następnie użyj specjalnie zaprojektowanego programu, aby przesunąć próbkę przez arkusz świetlny w krokach osi X i Z i utwórz stos obrazów 2D w całym ślimaku. Aby przetworzyć obraz, przenieś stos obrazów do innego komputera i załaduj go do programu do renderowania 3D w celu rekonstrukcji 3D i kwantyfikacji.

Bezpośrednie odwzorowanie objętości ślimaka myszy pokazało owalne i okrągłe okna, narząd Cortiego z komórkami rzęsatymi, kanał Rosenthala był podzielony na segmenty i odwzorowany objętość, a także pokazał spiralne neurony zwojowe lub SGN na całej jego długości. Za pomocą TSLIM zobrazowano ślimak trzymiesięcznej młodej myszy i 23-miesięcznej myszy i policzono ją pod kątem SGN. Liczba komórek SGN w funkcji odległości kanału Rosenthala przedstawiona na wykresie liniowym wykazała większe SGN u młodszego zwierzęcia w środkowym i wierzchołkowym końcu ślimaka w porównaniu ze starszym zwierzęciem.

Ta pozorna utrata SGN została zwizualizowana za pomocą analizy skupień i oprogramowania do renderowania 3D. Różnice gęstości SGN zostały przedstawione na skali kolorów, gdzie klastry o dużej gęstości są żółte, a niebieskie reprezentują obszary o niższej gęstości. Analiza skupień wyraźnie obrazowała obszary o mniejszej gęstości komórek wzdłuż kanału Rosenthala.

Mikroskopia arkuszy świetlnych została zaprojektowana w celu wytworzenia dobrze wyrównanego stosu obrazów, z których można produced. 3D renderowanie objętościowe 3D struktur, a programy do renderowania pozwalają na ilościową ocenę struktur i relacji anatomicznych między różnymi strukturami. Ponieważ jednak programy do renderowania 3D oferują wiele różnych parametrów użytkownika, istnieje znaczna krzywa uczenia się, aby efektywnie korzystać z tych programów.