Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Protokół ten pozwala na skuteczną i powtarzalną izolację pęcherzyków przedantralnych we wczesnym stadium z pojedynczego jajnika bydlęcego i stwarza nowe możliwości badania folikulogenezy jajników u gatunków innych niż bydło. Dzięki zastosowaniu większej liczby pęcherzyków z jednego jajnika, technika ta umożliwia leczenie in vivo przed pobraniem jajników lub pobranie wielu próbek w czasie od tego samego zwierzęcia za pomocą biopsji jajnika. Izolacja i kriokonserwacja pęcherzyków przedantralnych we wczesnym stadium może być cenną opcją dla zachowania płodności u młodych kobiet poddawanych leczeniu gonadotoksycznemu, takiemu jak chemioterapia, a także konserwacji plazmy zarodkowej zagrożonych gatunków.

Procedurę zademonstrują Stephanie McDonnell, Amanda Morton i Juliana Candelaria, doktorantki z mojego laboratorium. Na początek przenieś jajniki w laboratorium do ciepłego, sterylnego PBS zawierającego Pen-Strep i wybierz jajniki z wieloma małymi pęcherzykami antralnymi i bez wyraźnego ciałka żółtego. Usuń nadmiar tkanki łącznej i tłuszczu z jajników za pomocą nożyczek.

Przenieś jeden jajnik na deskę do krojenia na papierze stołowym. Za pomocą skalpela przeciąć jajnik na pół wzdłużnie od jednego miejsca przyczepu więzadła do przeciwległego miejsca przyczepu. Trzymaj jedną połowę jajnika na desce do krojenia, która ma być przetworzona, a drugą połowę jajnika umieść z powrotem w ciepłym PBS zawierającym Pen-Strep.

Aby usunąć rdzeń, przekrój wzdłuż krzywizny jajnika w odległości około 2 milimetrów od powierzchni, nie przecinając kory z odsłoniętym rdzeniem skierowanym do góry. Przetnij nacięcie, aby usunąć większość rdzenia. Odwróć jajnik do połowy tak, aby nabłonek był skierowany do góry i użyj skalpela, aby zakończyć odcinanie rdzenia od kory i odciąć pozostałą białą tkankę łączną wokół krawędzi części jajnika, która była połączona z więzadłami.

Po usunięciu większości rdzenia użyj skalpela, aby przyciąć korę do grubości około 1 milimetra, manipulując skalpelem małymi ruchami w przód iw tył, aby ogolić pozostałą część rdzenia, a następnie przeciąć każdą połowę kory jajnika na dwie części. Trzymaj kawałki kory w ciepłym PBS zawierającym Pen-Strep, aż będą gotowe do siekania. Przenieść pojedynczy fragment kory na szalkę Petriego na rozdrabniaczu tkanek i zwilżyć tkankę trzema lub czterema kroplami ciepłego PBS zawierającego Pen-Strep.

Trzymając kawałek tkanki stabilnie za pomocą kleszczy, naciśnij raz przycisk Reset, aby uruchomić rozdrabniacz tkanek. Po pocięciu całego kawałka kory na paski, użyj pokrętła uchwytu ostrza, aby podnieść ostrze z szalki Petriego, a kleszczy, aby usunąć tkankę z ostrza. Po obróceniu uchwytu płytki o 90 stopni, ponownie naciśnij przycisk Reset i przełóż ostrze całkowicie przez paski tkanki.

Użyj pokrętła uchwytu ostrza, aby podnieść ostrze z szalki Petriego, a kleszczy, aby usunąć wszelkie tkanki z ostrza, jak pokazano wcześniej. Używając pipety transferowej i ciepłego PBS zawierającego Pen-Strep, umyj posiekaną tkankę do wstępnie ogrzanej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Włóż stożkową rurkę z powrotem do kąpieli wodnej lub perełkowej, aby utrzymać posiekaną tkankę w cieple, powtarzając procedurę siekania z pozostałymi trzema połówkami jajnika.

Aby uzyskać najlepsze wyniki cięcia, użyj klucza do nakrętki, aby odkręcić nakrętkę z ramienia tnącego i zdejmij podkładkę i zatrzask ostrza. Za pomocą kleszczy zdejmij ostrze z ramienia siekającego. Odwróć go tak, aby nieużywana krawędź była skierowana w stronę szalki Petriego i umieść go z powrotem na ramieniu siekającym.

Po upewnieniu się, że homogenizator jest podłączony, a prędkość jest ustawiona na drugi pasek, włóż 10-milimetrową sondę generatora do urządzenia zgodnie ze specyfikacją producenta. Następnie ustaw minutnik na 1 minutę i włóż sondę do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej posiekaną tkankę kory z jednego jajnika i wystarczającą ilość PBS zawierającą Pen-Strep, aby napełnić probówkę do linii 25 mililitrów. Głębokość, na którą wkładana jest sonda, musi wynosić 1/3 wysokości cieczy mierzonej od dna komory.

Po uruchomieniu timera włącz homogenizator, upewniając się, że spód sondy nie dotyka rurki i trzymaj probówkę nieruchomo, gdy homogenizator jest włączony. Po 1 minucie homogenizacji wyjmij sondę z probówki, a następnie usuń tkankę łączną zatykającą otwory wentylacyjne w przestrzeni między nożem wirnika a rurką wirnika lub kawałki kory wbite w sondę za pomocą kleszczy i umieść je z powrotem w probówce. Wlać rozproszoną tkankę do lejka pokrytego gazą, włożyć do kolby Erlenmeyera i wypłukać zawartość probówki do lejka za pomocą ciepłego PBS.

Na koniec opłucz gazę ciepłym PBS. Spraw, aby płyn w małych fragmentach przeszedł przez otwory w szmatce, przekręcając gazę wokół fragmentów tkanki w dół i ściskając, aż cały nadmiar płynu i tkanki zostanie usunięty z gazy. Po ponownym otwarciu gazy nad lejkiem, przepłukać gazę PBS zawierającą Pen-Strep za pomocą pipety transferowej i ponownie przecisnąć przez szmatkę wszelkie pozostałe fragmenty tkanki.

Za pomocą hemostatu przytrzymać sitko o średnicy 300 mikrometrów nad zlewką o pojemności 200 mililitrów i przelać filtrat z kolby Erlenmeyera przez sitko do komórek. Jeśli sitko zostanie zatkane tkanką, delikatnie postukaj nim o zlewkę, a następnie odwróć sitko do góry nogami i wytrząśnij duże resztki chusteczki na papier stołowy. Przepłukać zawartość kolby za pomocą ciepłego PBS zawierającego Pen-Strep do momentu, aż nie pozostaną żadne fragmenty tkanek i wlać ją do sitka komórkowego.

Następnie, trzymając sitko o średnicy 40 mikrometrów z hemostatem nad drugą zlewką o pojemności 200 mililitrów, przelać przez sitko cały początkowy filtrat obecny w pierwszej zlewce o pojemności 200 mililitrów, a następnie przepłukać zawartość zlewki ciepłym PBS zawierającym Pen-Strep, aż nie pozostaną żadne fragmenty tkanek i wlać go do sitka komórkowego. Po dopasowaniu igły o rozmiarze 18 G do strzykawki o pojemności 20 mililitrów, należy napełnić strzykawkę środkiem do płukania mieszków włosowych. Za pomocą hemostatu trzymaj sitko do komórek o długości 40 mikrometrów do góry nogami na kwadratowej szalce Petriego i użyj strzykawki, aby wypłukać zawartość sitka komórkowego do naczynia.

Przenieś kwadratową szalkę Petriego do stereoskopu z ciepłym stolikiem ustawionym na 38,5 stopnia Celsjusza z powiększeniem ustawionym między 1,25 a 3,2x. Po zidentyfikowaniu pęcherzyków na kwadratowej szalce Petriego, przenieś mieszek włosowy do płukania kropli za pomocą mikropipety. Całkowita liczba wyizolowanych pęcherzyków przedantralnych na powtórzenie przy użyciu 6-minutowej homogenizacji tkanek wynosi średnio 41 pęcherzyków na powtórzenie, w zakresie od 11 do 135 pęcherzyków.

Ocena stadium rozwojowego 476 izolowanych pęcherzyków wykazała, że większość z nich znajdowała się w początkowej fazie rozwoju, mierząc od 40 do 79 mikrometrów i zawierając jedną warstwę prostopadłościennych komórek ziarnistych. Homogenizacja kory jajnikowej przez 6 minut dała większą liczbę pęcherzyków przedantralnych w porównaniu z 5 minutami homogenizacji przy tej samej prędkości. Ekspresję transkryptu markera komórek ziarnistych receptora FSH i markera komórek rozrodczych DAZL w pęcherzykach oceniano za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją, wykazując, że zarówno pierwotne, jak i wczesne pęcherzyki wtórne wykazywały ekspresję receptora FSH i transkryptów DAZL.

Immunofluorescencyjna lokalizacja CX37 w izolowanych pęcherzykach przedantralnych zarówno w stadium pierwotnym, jak i wczesnym, drugorzędowym pokazuje, że CX37 był zlokalizowany w plazmie O, będąc nieobecnym w jądrze miejsca O i błonie komórek ziarnistych. Z naszego doświadczenia wynika, że prawidłowe rozwarstwienie cienkiej warstwy tkanki korowej, rozdrobnienie tkanki do odpowiedniego rozmiaru i właściwa homogenizacja są kluczowymi krokami zapewniającymi uwolnienie żywotnych pęcherzyków z tkanki. Wyizolowane pęcherzyki preantralne mogą być wykorzystane do odpowiedzi na pytania, takie jak regulacja wzrostu pęcherzyków przedantralnych oraz charakter interakcji między komórkami ziarnistymi a oocytem, ułatwiając w ten sposób opracowanie bardziej wydajnych warunków hodowli.