Name: Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej. Technika ta umożliwia badania folikulogenezy oraz zastosowania w ochronie płodności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został częściowo sfinansowany przez wielostanowy projekt USDA W4112 i UC Davis Jastro Shields przyznane SM.
Autorzy chcieliby wyrazić swoje uznanie dla Central Valley Meat, Inc. za dostarczenie jajników bydlęcych używanych we wszystkich eksperymentach. Autorzy dziękują również Olivii Silverze za pomoc w przetwarzaniu jajników i izolacji mieszków włosowych.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje powtarzalną metodę pobierania pęcherzyków przedantralnych we wczesnym stadium, szczególnie w stadium pierwotnym i wczesnym stadium wtórnym, z jajnika bydlęcego. Protokół ten opiera się na poprzednich raportach 20,25,30,34,35,36 i zapewnia optymalizacje, które skutkują izolacją znaczącej liczby pęcherzyków z pojedynczego jajnika.<sup class="xref"...

Pęcherzyki jajnikowe są jednostkami funkcjonalnymi jajnika, odpowiedzialnymi za produkcję gamet (oocytów), a także hormonów krytycznych dla funkcji rozrodczych i ogólnego stanu zdrowia. Pęcherzyki pierwotne tworzą się w jajniku podczas rozwoju płodu lub w okresie noworodkowym, w zależności od gatunku1, i stanowią rezerwę jajnikową samicy. Wzrost pęcherzyków rozpoczyna się od aktywacji pierwotnych pęcherzyków, które opuszczają basen spoczynkowy i wchodzą w fazę wzrostu. Folikulogeneza preantralna, obejmująca wszystkie etapy pęcherzyków przed rozwojem antrum, jest wysoce dynamicznym procesem, który wymaga synchronicznych zmian morfologicznych i metabolicznych w oocycie i otaczających komórkach ziarnistych, napędzanych ścisłą komunikacją między tymi dwoma typami komórek2,3. Pęcherzyki przedantralne stanowią większość jednostek pęcherzykowych znajdujących się w jajniku w danym momencie4. Szacuje się, że rozwój przez preantralne etapy folikulogenezy jest o kilka tygodni dłuższy niż rozwój antralny5,6, a czas ten jest niezbędny, aby oocyt i komórki somatyczne osiągnęły wystarczającą dojrzałość, aby wejść w końcowy etap rozwoju (tj. etap antralny) i przygotować się do owulacji, zapłodnienia i rozwoju embrionalnego7,8,9.
Znaczna część obecnej wiedzy na temat folikulogenezy przedantralnej jajników pochodzi z modeli mysich10,11,12,13, częściowo ze względu na łatwość odzyskania dużej liczby tych pęcherzyków z mniejszego i mniej włóknistego jajnika. Chociaż doniesienia o izolacji dużej liczby pęcherzyków przedantralnych z jajników bydlęcych pochodzą sprzed około 30 lat14, pełniejsze zrozumienie procesów regulujących rozwój tych pęcherzyków we wczesnym stadium pozostało niezrealizowane, głównie z powodu braku zoptymalizowanych, wydajnych i powtarzalnych metod pobierania wystarczającej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych, szczególnie we wczesnych stadiach rozwoju. Wraz z rosnącym zainteresowaniem zachowaniem rezerwy jajnikowej do wykorzystania w przyszłości w wspomaganym rozrodzie u ludzi, krowy stają się atrakcyjnym modelem ze względu na ich bardziej podobną budowę jajników15. Jednak jajnik bydlęcy jest znacznie bogatszy w kolagen w porównaniu do jajnika myszy 16, co sprawia, że izolacja mechaniczna przy użyciu metod opisanych dla myszy jest bardzo nieefektywna. Wysiłki mające na celu rozszerzenie technik zachowania płodności obejmują całkowity wzrost pęcherzyków przedantralnych in vitro do stadium antralnego, a następnie dojrzewanie in vitro (IVM) zamkniętych oocytów, zapłodnienie in vitro (IVF) oraz produkcję i transfer zarodków17. Do tej pory cały ten proces został osiągnięty tylko w myszach18. U bydła postęp w kierunku wzrostu pęcherzyków in vitro jest ograniczony do kilku raportów ze zmiennymi stadiami pęcherzyków na początku hodowli, a także zmienną długością hodowli między protokołami17,19.
Metody opisane w literaturze dotyczące pobierania pęcherzyków preantralnych z jajnika bydlęcego głównie wykorzystywały techniki mechaniczne i enzymatyczne, izolowane lub w kombinacji2,14,17,20. W pierwszym raporcie na temat protokołu izolacji pęcherzyków przedantralnych bydła wykorzystano homogenizator tkankowy i filtrację seryjną do przetwarzania całych jajników20. Po tym badaniu pojawiły się doniesienia łączące procedury mechaniczne i enzymatyczne, które wykorzystywały kolagenazę14. Powtarzającym się tematem podczas stosowania kolagenazy do trawienia tkanki jajnika jest potencjalne ryzyko uszkodzenia błony podstawnej pęcherzyka, co może zagrozić żywotności pęcherzyków14,21,22,23. W związku z tym zastosowano różne kombinacje metod mechanicznych, takie jak użycie rozdrabniacza tkanek i wielokrotnego pipetowania lub rozdrabniacza tkanek w połączeniu z homogenizacją20,24,25,26. Inna opisana technika mechaniczna wykorzystuje igły do wycinania pęcherzyków przedantralnych bezpośrednio z tkanki jajnika, co jest szczególnie przydatne do izolowania większych (>200 μm) pęcherzyków wtórnych. Jednak proces ten jest czasochłonny, nieefektywny w izolowaniu mniejszych pęcherzyków przedantralnych i zależy od zestawu umiejętności, gdy próbuje się go przeprowadzić w jajnikach bydła19,27,28.
Korzystając z różnych technik opisanych w literaturze, protokół ten miał na celu optymalizację izolacji pęcherzyków preantralnych z pojedynczych jajników bydlęcych w prosty, spójny i efektywny sposób, który pozwala uniknąć inkubacji w roztworach enzymatycznych. Udoskonalenie metod izolacji pęcherzyków preantralnych będzie okazją do lepszego zrozumienia tego etapu folikulogenezy i umożliwi opracowanie skutecznych systemów hodowli w celu rozwoju pęcherzyków preantralnych do stadium antralnego. Opisane w niniejszym dokumencie szczegółowe procedury izolacji pęcherzyków przedantralnych od dużego ssaka, takiego jak bydło, będą miały kluczowe znaczenie dla naukowców dążących do zbadania wczesnej folikulogenezy u gatunku niemysiego, który można przetłumaczyć na ludzi.

<table><tbody><tr><td>5-3/4 "Jednorazowa szklana pipeta Pasteura z sodą wapniową</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>63A54</td><td>Pipeta Pasteura, której można używać do usuwania mieszków włosowych z gruzu podczas wyszukiwania na szalce Petriego</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Rozcieńczony do 4%; utrwalanie pęcherzyków do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>20 ml Strzykawka Luer-lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z116882-100EA</td><td>Strzykawka używana z igłą 18 G do usuwania pęcherzyków z 40 &mu; m Sitko komórkowe</td></tr> <tr><td># 21 Sterylne ostrze skalpela</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-365-023</td><td>Służy do cięcia jajników i usuwania medula</td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-547</td><td>Służy do filtrowania filtratu z 300 &mu; m sitko komórkowe</td></tr><tr><td>104 mm Plastikowy lejek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-348C</td><td>Rozmiar może się różnić, ale upewnij się, że gaz serowy jest odpowiednio przycięty i że homogenat jajnika nie rozleje się ponad</td></tr><tr><td>300 &mu; m Sitko do komórek</td><td>pluriSelect&nbsp;</td><td>43-50300-03</td><td>Służy do filtrowania filtratu z gazy serowej&nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml Kolba Erlenmeyera</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB500500</td><td>Lejek i kolba służące do wyłapywania filtratu z gazy serowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterylne igły Air-Tite 18 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-817-151</td><td>18 G zapewniają wystarczający nacisk, aby usunąć mieszki włosowe z 40 &mu; m sitko komórkowe</td></tr><tr><td>Sterylne igły Air-Tite 27 G 13 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-171</td><td>Igły, których można używać do manipulowania wszelkimi zanieczyszczeniami, w których utknęły mieszki</td></tr> włosowe <tr><td>BD Hoechst 33342 Roztwór</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB561908</td><td>Fluorescencyjne barwienie DNA</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G&nbsp;</td><td>Składnik mediów do płukania mieszków włosowych</td></tr><tr><td>Cheese Cloth</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71748-00</td><td>Pierwszy etap filtracji homogenatu jajnikowego przeznaczony do usuwania dużych zanieczyszczeń tkankowych</td></tr><tr><td>Klasyczne maszynki do golenia z podwójną krawędzią</td><td>Wilkinson Sword</td><td>N/A</td><td>Żyletki, które najlepiej pasują do rozdrabniacza tkanek McIlwain i nie tępią się szybko</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne osła-anty-królika, Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>Przeciwciało wtórne do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Eisco Latex Pipette Bulbs</td><td>Fisher Scientific</td><td>S29388</td><td>Gumowa gruszka do stosowania z pipetami Pasteura</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Składnik pożywki do płukania mieszków</td></tr> włosowych <tr><td>Homogenizator</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>Homogenizacja tkanki jajnika w celu uwolnienia pęcherzyków&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>Oprogramowanie używane do analizy immunolokalizacji fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>McIlwain</td><td>Tissue Chopper Ted Pella</td><td>10184</td><td>Służy do cięcia tkanki jajnikowej wystarczająco małej do homogenizacji</td></tr><tr><td>Mikroskop - Stereoskop</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ILLT</td><td>Mikroskop preparacyjny używany do wyszukiwania i pobierania pęcherzyków z filtratu</td></tr><tr><td>Mikroskop - Odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Diaphot 300</td><td>Mikroskop odwrócony używany do wizualizacji izolowanych mieszków włosowych w dużym powiększeniu w jasnym polu</td></tr><tr><td>Mikroskop - odwrócony</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Mikroskop odwrócony używany do wizualizacji dużego powiększenia jasnego pola i epifluorescencji izolowanych mieszków włosowych</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td>Olej do pokrywania kropli pożywki do płukania mieszków włosowych, aby zapobiec parowaniu podczas wyszukiwania</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Składnik pożywki do płukania mieszków</td></tr> włosowych <tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td>Odczynnik do buforu blokującego barwienie</td></tr><tr><td>immunologiczne Nunc 4-dołkowe naczynia do IVF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144444</td><td>4-dołkowe naczynia do izolacji pęcherzyków i mycia</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Składnik pożywki do płukania mieszków</td></tr> włosowych <tr><td>szalka Petriego 60 mm OD x 13,7 mm</td><td>Ted Pella</td><td>10184-04</td><td>Szalka Petriego, która najlepiej pasuje do McIlwain Tissue Chopper</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>Bufor do płukania jajników i mieszków</td></tr> włosowych <tr><td>Plastikowa deska do krojenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A Deska</td><td>do krojenia o rozmiarach wystarczających do bezpiecznego cięcia jajniki</td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon (PVP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td>Dodatek PVP (0,1% w/v) do PBS zapobiega przywieraniu pęcherzyków do płytki lub siebie nawzajem&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Podłoże montażowe do fluorescencyjnie znakowanych komórek lub tkanek</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Zestaw do czyszczenia kolumny RNA</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-ludzkie Cx37 / GJA4</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RT Zestaw do</td><td>syntezy cDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu (1N/certyfikowany)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td>Służy do zwiększania pH podłoża do 7,6-7,8</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Składnik medium do mycia mieszków włosowych</td></tr><tr><td>Kwadratowa szalka Petriego 100 mm x 15 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60872-310</td><td>Kratkowe szalki Petriego pozwalają na skuteczniejszą identyfikację mieszków włosowych&nbsp;</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>Mastermix do reakcji PCR</td></tr><tr><td>Filtr butelkowy z gwintem Steritop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2GPT02RE</td><td>Służy do sterylizacji podłoża do mycia mieszków włosowych</td></tr><tr><td>Bezpieczny dla SYBR barwnik żelowy DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Barwienie do wizualnych produktów PCR na żelu agarozowym</td></tr><tr><td>TCM199 z Hank' s Sole</td><td>Gibco</td><td>12-350-039</td><td>Składnik medium do płukania mieszków włosowych</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Detergent do immunologicznego buforu permeabilacyjnego</td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Odczynnik do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>Służy do badania żywotności izolowanych pęcherzyków</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td></td><td></td><td>Detergent do immunologicznego buforu do płukania</td></tr><tr><td>Podgrzewacz Uniwersalny</td><td>WTA</td><td>20931</td><td>Ciepła płytka do utrzymywania mieszków włosowych na poziomie 38,5 & deg; C podczas poszukiwań pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Wiretrol II Kalibrowane mikropipety</td><td>Drummond</td><td>50002-005</td><td>Szklane mikropipety do manipulowania mieszkami włosowymi</td></tr></tbody></table>

izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

Zrozumienie pełnego procesu folikulogenezy u ssaków jest kluczowe dla poprawy technologii wspomaganego rozrodu u zwierząt gospodarskich, ludzi i zagrożonych gatunków. Badania ograniczały się głównie do pęcherzyków antralnych i dużych pęcherzyków przedantralnych ze względu na trudności w izolacji mniejszych pęcherzyków przedantralnych, zwłaszcza u dużych ssaków, takich jak bydło. W pracy przedstawiono skuteczne podejście do pobierania dużej liczby małych pęcherzyków przedantralnych z pojedynczego jajnika bydlęcego. Korę poszczególnych jajników bydlęcych pokrojono w kostkę o wielkości 500 μm za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizowano przez 6 minut przy 9 000-11 000 obr./min za pomocą sondy o średnicy 10 mm. Duże zanieczyszczenia oddzielono od homogenatu za pomocą gazy serowej, a następnie przeprowadzono seryjną filtrację przez sitka o wielkości komórek 300 μm i 40 μm. Zawartość zatrzymaną w sitku o wielkości 40 μm przepłukano do naczynia poszukiwawczego, w którym zidentyfikowano mieszki włosowe i zebrano je w kropli pożywki. Żywotność pobranych mieszków włosowych badano za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Metoda ta umożliwia wyizolowanie dużej liczby żywotnych małych pęcherzyków przedantralnych z pojedynczego jajnika bydlęcego w ciągu około 90 minut. Co ważne, metoda ta jest całkowicie mechaniczna i pozwala uniknąć użycia enzymów do dysocjacji tkanki, co może spowodować uszkodzenie mieszków włosowych. Pęcherzyki uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak izolacja RNA do RT-qPCR, immunolokalizacja określonych białek i hodowla in vitro.

Przegląd i kluczowe etapy 
Stosując niniejszy protokół, można niezawodnie wyizolować małe przedantralne pęcherzyki jajnikowe bydła z pojedynczych jajników w ilościach istotnych eksperymentalnie. Z łącznej liczby 30 powtórzeń uzyskano średnio 41 pęcherzyków na powtórzenie, w zakresie od 11 do 135 pęcherzyków (Rysunek 4A). W 14 powtórzeniach określono stopień rozwoju pęcherzyków zgodnie z wcześniejszym opisem26, mierząc średnicę pęcherzyków za pomocą...

Postęp w badaniach nad folikulogenezą preantralną wymaga skutecznych metod izolacji pęcherzyków z pojedynczych jajników. Przedstawiono uproszczony, mechaniczny protokół izolacji pęcherzyków z jajników bydlęcych za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizatora. Metoda ta pozwala na pobranie dużej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych z jednego jajnika.

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

Protokół ten pozwala na skuteczną i powtarzalną izolację pęcherzyków przedantralnych we wczesnym stadium z pojedynczego jajnika bydlęcego i stwarza nowe możliwości badania folikulogenezy jajników u gatunków innych niż bydło. Dzięki zastosowaniu większej liczby pęcherzyków z jednego jajnika, technika ta umożliwia leczenie in vivo przed pobraniem jajników lub pobranie wielu próbek w czasie od tego samego zwierzęcia za pomocą biopsji jajnika. Izolacja i kriokonserwacja pęcherzyków przedantralnych we wczesnym stadium może być cenną opcją dla zachowania płodności u młodych kobiet poddawanych leczeniu gonadotoksycznemu, takiemu jak chemioterapia, a także konserwacji plazmy zarodkowej zagrożonych gatunków.Procedurę zademonstrują Stephanie McDonnell, Amanda Morton i Juliana Candelaria, doktorantki z mojego laboratorium. Na początek przenieś jajniki w laboratorium do ciepłego, sterylnego PBS zawierającego Pen-Strep i wybierz jajniki z wieloma małymi pęcherzykami antralnymi i bez wyraźnego ciałka żółtego. Usuń nadmiar tkanki łącznej i tłuszczu z jajników za pomocą nożyczek.Przenieś jeden jajnik na deskę do krojenia na papierze stołowym. Za pomocą skalpela przeciąć jajnik na pół wzdłużnie od jednego miejsca przyczepu więzadła do przeciwległego miejsca przyczepu. Trzymaj jedną połowę jajnika na desce do krojenia, która ma być przetworzona, a drugą połowę jajnika umieść z powrotem w ciepłym PBS zawierającym Pen-Strep.Aby usunąć rdzeń, przekrój wzdłuż krzywizny jajnika w odległości około 2 milimetrów od powierzchni, nie przecinając kory z odsłoniętym rdzeniem skierowanym do góry. Przetnij nacięcie, aby usunąć większość rdzenia. Odwróć jajnik do połowy tak, aby nabłonek był skierowany do góry i użyj skalpela, aby zakończyć odcinanie rdzenia od kory i odciąć pozostałą białą tkankę łączną wokół krawędzi części jajnika, która była połączona z więzadłami.Po usunięciu większości rdzenia użyj skalpela, aby przyciąć korę do grubości około 1 milimetra, manipulując skalpelem małymi ruchami w przód iw tył, aby ogolić pozostałą część rdzenia, a następnie przeciąć każdą połowę kory jajnika na dwie części. Trzymaj kawałki kory w ciepłym PBS zawierającym Pen-Strep, aż będą gotowe do siekania. Przenieść pojedynczy fragment kory na szalkę Petriego na rozdrabniaczu tkanek i zwilżyć tkankę trzema lub czterema kroplami ciepłego PBS zawierającego Pen-Strep.Trzymając kawałek tkanki stabilnie za pomocą kleszczy, naciśnij raz przycisk Reset, aby uruchomić rozdrabniacz tkanek. Po pocięciu całego kawałka kory na paski, użyj pokrętła uchwytu ostrza, aby podnieść ostrze z szalki Petriego, a kleszczy, aby usunąć tkankę z ostrza. Po obróceniu uchwytu płytki o 90 stopni, ponownie naciśnij przycisk Reset i przełóż ostrze całkowicie przez paski tkanki.Użyj pokrętła uchwytu ostrza, aby podnieść ostrze z szalki Petriego, a kleszczy, aby usunąć wszelkie tkanki z ostrza, jak pokazano wcześniej. Używając pipety transferowej i ciepłego PBS zawierającego Pen-Strep, umyj posiekaną tkankę do wstępnie ogrzanej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Włóż stożkową rurkę z powrotem do kąpieli wodnej lub perełkowej, aby utrzymać posiekaną tkankę w cieple, powtarzając procedurę siekania z pozostałymi trzema połówkami jajnika.Aby uzyskać najlepsze wyniki cięcia, użyj klucza do nakrętki, aby odkręcić nakrętkę z ramienia tnącego i zdejmij podkładkę i zatrzask ostrza. Za pomocą kleszczy zdejmij ostrze z ramienia siekającego. Odwróć go tak, aby nieużywana krawędź była skierowana w stronę szalki Petriego i umieść go z powrotem na ramieniu siekającym.Po upewnieniu się, że homogenizator jest podłączony, a prędkość jest ustawiona na drugi pasek, włóż 10-milimetrową sondę generatora do urządzenia zgodnie ze specyfikacją producenta. Następnie ustaw minutnik na 1 minutę i włóż sondę do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej posiekaną tkankę kory z jednego jajnika i wystarczającą ilość PBS zawierającą Pen-Strep, aby napełnić probówkę do linii 25 mililitrów. Głębokość, na którą wkładana jest sonda, musi wynosić 1/3 wysokości cieczy mierzonej od dna komory.Po uruchomieniu timera włącz homogenizator, upewniając się, że spód sondy nie dotyka rurki i trzymaj probówkę nieruchomo, gdy homogenizator jest włączony. Po 1 minucie homogenizacji wyjmij sondę z probówki, a następnie usuń tkankę łączną zatykającą otwory wentylacyjne w przestrzeni między nożem wirnika a rurką wirnika lub kawałki kory wbite w sondę za pomocą kleszczy i umieść je z powrotem w probówce. Wlać rozproszoną tkankę do lejka pokrytego gazą, włożyć do kolby Erlenmeyera i wypłukać zawartość probówki do lejka za pomocą ciepłego PBS.Na koniec opłucz gazę ciepłym PBS. Spraw, aby płyn w małych fragmentach przeszedł przez otwory w szmatce, przekręcając gazę wokół fragmentów tkanki w dół i ściskając, aż cały nadmiar płynu i tkanki zostanie usunięty z gazy. Po ponownym otwarciu gazy nad lejkiem, przepłukać gazę PBS zawierającą Pen-Strep za pomocą pipety transferowej i ponownie przecisnąć przez szmatkę wszelkie pozostałe fragmenty tkanki.Za pomocą hemostatu przytrzymać sitko o średnicy 300 mikrometrów nad zlewką o pojemności 200 mililitrów i przelać filtrat z kolby Erlenmeyera przez sitko do komórek. Jeśli sitko zostanie zatkane tkanką, delikatnie postukaj nim o zlewkę, a następnie odwróć sitko do góry nogami i wytrząśnij duże resztki chusteczki na papier stołowy. Przepłukać zawartość kolby za pomocą ciepłego PBS zawierającego Pen-Strep do momentu, aż nie pozostaną żadne fragmenty tkanek i wlać ją do sitka komórkowego.Następnie, trzymając sitko o średnicy 40 mikrometrów z hemostatem nad drugą zlewką o pojemności 200 mililitrów, przelać przez sitko cały początkowy filtrat obecny w pierwszej zlewce o pojemności 200 mililitrów, a następnie przepłukać zawartość zlewki ciepłym PBS zawierającym Pen-Strep, aż nie pozostaną żadne fragmenty tkanek i wlać go do sitka komórkowego. Po dopasowaniu igły o rozmiarze 18 G do strzykawki o pojemności 20 mililitrów, należy napełnić strzykawkę środkiem do płukania mieszków włosowych. Za pomocą hemostatu trzymaj sitko do komórek o długości 40 mikrometrów do góry nogami na kwadratowej szalce Petriego i użyj strzykawki, aby wypłukać zawartość sitka komórkowego do naczynia.Przenieś kwadratową szalkę Petriego do stereoskopu z ciepłym stolikiem ustawionym na 38,5 stopnia Celsjusza z powiększeniem ustawionym między 1,25 a 3,2x. Po zidentyfikowaniu pęcherzyków na kwadratowej szalce Petriego, przenieś mieszek włosowy do płukania kropli za pomocą mikropipety. Całkowita liczba wyizolowanych pęcherzyków przedantralnych na powtórzenie przy użyciu 6-minutowej homogenizacji tkanek wynosi średnio 41 pęcherzyków na powtórzenie, w zakresie od 11 do 135 pęcherzyków.Ocena stadium rozwojowego 476 izolowanych pęcherzyków wykazała, że większość z nich znajdowała się w początkowej fazie rozwoju, mierząc od 40 do 79 mikrometrów i zawierając jedną warstwę prostopadłościennych komórek ziarnistych. Homogenizacja kory jajnikowej przez 6 minut dała większą liczbę pęcherzyków przedantralnych w porównaniu z 5 minutami homogenizacji przy tej samej prędkości. Ekspresję transkryptu markera komórek ziarnistych receptora FSH i markera komórek rozrodczych DAZL w pęcherzykach oceniano za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją, wykazując, że zarówno pierwotne, jak i wczesne pęcherzyki wtórne wykazywały ekspresję receptora FSH i transkryptów DAZL.Immunofluorescencyjna lokalizacja CX37 w izolowanych pęcherzykach przedantralnych zarówno w stadium pierwotnym, jak i wczesnym, drugorzędowym pokazuje, że CX37 był zlokalizowany w plazmie O, będąc nieobecnym w jądrze miejsca O i błonie komórek ziarnistych. Z naszego doświadczenia wynika, że prawidłowe rozwarstwienie cienkiej warstwy tkanki korowej, rozdrobnienie tkanki do odpowiedniego rozmiaru i właściwa homogenizacja są kluczowymi krokami zapewniającymi uwolnienie żywotnych pęcherzyków z tkanki. Wyizolowane pęcherzyki preantralne mogą być wykorzystane do odpowiedzi na pytania, takie jak regulacja wzrostu pęcherzyków przedantralnych oraz charakter interakcji między komórkami ziarnistymi a oocytem, ułatwiając w ten sposób opracowanie bardziej wydajnych warunków hodowli.

isolation-small-preantral-follicles-from-bovine-ovary-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Ten film opisuje izolację oocytów antralnych ze świeżo pobranych jajników myszy. Te antralne oocyty mogą być wykorzystane do dalszej charakterystyki i badań rozwojowych.

Izolacja oocytów antralnych myszy: metoda izolowania oocytów antralnych ze świeżo pobranych jajników myszy

Ten film opisuje technikę izolowania kompleksu wzgórko-oocytów lub COC z jajników świni. Wyizolowany nienaruszony COC może być wykorzystany do przeprowadzenia zapłodnienia in vitro - techniki wspomaganego rozrodu w celu opracowania metod leczenia niepłodności.

Izolacja kompleksu oocytów Cumulusa świni: technika izolacji kompleksu oocytów Cumulus z pęcherzyka jajnika świni w celu zapłodnienia in vitro

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Opisujemy procedury izolacji rosnących oocytów z pęcherzyków jajnikowych we wczesnych stadiach rozwoju, a także tworzenie systemu hodowli in vitro, który może wspierać wzrost i różnicowanie aż do fazy pełnej dojrzałości.

Strategia hodowli in vitro oocytów z wczesnego pęcherzyka antralnego u bydła

Tutaj prezentujemy prostą metodę rozdzielania komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajników danio pręgowanego, która ułatwi badania rozwoju jajników u danio pręgowanego.

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji i oczyszczania komórek jajnika z pęcherzyków antralnych. Omawiamy metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych, a także zbierania nienaruszonych pęcherzyków antralnych, które są traktowane enzymatycznie w celu uwolnienia wielu typów komórek rezydujących w pęcherzykach, w tym ziarnistości, osłonki, śródbłonka, komórek krwiotwórczych i zrębowych.

Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Tutaj opisujemy protokół separacji żółtka, komórek ziarnistych i komórek osłonki w ptasich pęcherzykach przedowulacyjnych. Ta precyzyjna obsługa umożliwia krytyczne badania nad rolą tych warstw w funkcjach rozrodczych, pomagając w zrozumieniu rozwoju pęcherzyków włosowych, regulacji hormonalnej i badań nad chorobami w celu zwiększenia plonów rolnych i wglądu biomedycznego.

Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

W artykule przedstawiono model kohodowli komórek osłonki bydlęcej i komórek ziarnistych. Metoda ta może potencjalnie służyć jako wiarygodna podstawa do analiz skoncentrowanych na badaniu komunikacji parakrynnej i transportu substratu między komórkami somatycznymi w obrębie pęcherzyka.

Zmodyfikowany system kohodowli w celu zrozumienia interakcji komórek ziarnisto-osłonkowych w jajniku bydła

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej. Technika ta umożliwia badania folikulogenezy oraz zastosowania w ochronie płodności.

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Przeglądaj więcej filmów