Name: Rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Naucz się techniki izolacji pozawątrobowego układu żółciowego u noworodków myszy. Metoda zapewnia integralność przewodów żółciowych i umożliwia atraumatyczne usunięcie komórek zanieczyszczających.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Johannie Hagens, Pauline Schuppert, Clarze Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl i Magdalena Trochimiuk za ich wkład. Hans Christian Schmidt otrzymał wsparcie finansowe od Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.

Po zatwierdzeniu etycznym (N045/2021), samce i samice myszy C57BL/6 obserwowano do 9 dnia życia. Zwierzęta urodziły się i zostały dostarczone do celów doświadczalnych przez zakład dla zwierząt Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Niemcy. Noworodki były trzymane w klatce razem ze swoimi zwierzętami rodzicielskimi. Warunki środowiskowe były kontrolowane pod względem temperatury (20-24 °C), cyklu jasnego i ciemnego 12:12 oraz wilgotności względnej 40%-70%.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Przygotuj wymagany sprzęt do operacji chirurgicznej, w tym nożyczki, kleszcze itp. (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zdezynfekowane i autoklawowane narzędzia należy umieścić na sterylnej powierzchni obok stołu operacyjnego.</li>
	<li>Szybko poddaj eutanazji nowonarodzoną mysz w wieku P9 poprzez ścięcie głowy nożyczkami operacyjnymi. Umieść ciało uśpionej myszy noworodkowej na sterylnym polu operacyjnym. Przeanalizuj EBDS u 9-dniowych noworodków myszy (krok 5). 
	UWAGA: Opisana procedura preparacji daje każdemu naukowcowi odpowiednie narzędzia do usunięcia EBDS u noworodków i starszych myszy. Im starsza mysz, tym łatwiejsze przygotowanie.</li>
</ol>
2. Dostęp do jamy otrzewnowej
<ol>
	<li>Chwyć kleszczem skórę powyżej miejsca pęcherza moczowego. Naciąć otwór o średnicy 2 mm w skórze za pomocą nożyczek, nie uszkadzając otrzewnej i leżących pod nią struktur. Rozwiń cięcie do miejsca dekapitacji, podążając za lewą przednią linią pachową. Usuń skórę od lewej do prawej strony za pomocą atraumatycznych kleszczy.</li>
	<li>Chwyć otrzewną otaczającą śledzionę. Delikatnie podnieś go, aż otrzewna będzie przypominać strukturę przypominającą namiot i wytnij otwór o średnicy 1 mm w środku. Poczekaj, aż "namiot otrzewnowy" napełni się powietrzem. Użyj 10-krotnego powiększenia mikroskopowego do tego i następnych kroków.</li>
	<li>Odetnij otrzewną w oknie obramowanym dolnymi żebrami, obydwoma bocznymi obszarami brzucha i dolną częścią pęcherza, aby zapewnić pełny dostęp do wątroby, układu dróg żółciowych, żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy. 
	UWAGA: Aby poprawić dostęp do wątroby, można wykonać dodatkowe nacięcie, usuwając trzy najniższe żebra, pozostawiając nienaruszony wyrostek mieczykowaty, więzadło posenne, wątrobę i struktury dróg żółciowych. Widok na wątrobę jest łatwy do uzyskania.</li>
</ol>
3. Badanie pęcherzyka żółciowego i dróg żółciowych
UWAGA: Upewnij się, że próbka jest regularnie mokra podczas wszystkich poniższych kroków.
<ol>
	<li>Ostrożnie pociągnij wyrostek mieczykowaty w pozycji czaszkowo-komorowej, aby zbadać woreczek żółciowy. 
	UWAGA: Napięcie więzadła falciform wzrasta wraz z tym ruchem, a przyczepiony woreczek żółciowy staje się widoczny.
	<ol>
		<li>Wykonaj tylko lekkie pociągnięcie, aby uniknąć niekontrolowanego zerwania więzadła falciowatego, które może doprowadzić do zerwania pęcherzyka żółciowego z układu dróg żółciowych. Zwolnij ciągnięcie wyrostka mieczykowatego przed następnym krokiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie pociągnij dwunastnicę w dół, aby uwolnić układ dróg żółciowych. 
	UWAGA: Wraz ze wzrostem napięcia więzadła wątrobowo-nerkowego widoczna staje się tkanka dróg żółciowych.</li>
</ol>
4. Resekcja en-bloc-resekcja
<ol>
	<li>Wykonaj dolną mobilizację en-bloc, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj brodawkę dwunastnicy, która łączy układ dróg żółciowych z dwunastnicą.</li>
		<li>Przeciąć dwunastnicę około 2 cm od prawej bocznej strony brodawki.</li>
		<li>Przeciąć obszar odźwiernika. Upewnij się, że treść żołądka znajduje się w obszarze odźwiernika między miejscem cięcia a brodawką dwunastnicy. 
		UWAGA: Jest to ważny krok dla późniejszego zabezpieczenia orientacji dla prawidłowej lokalizacji części dwunastnicy jamy ustnej i brzusznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj górną mobilizację en-bloc.
	<ol>
		<li>Delikatnie pociągnij wyrostek mieczykowaty i uzyskaj dostęp do więzadła sierpowego.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie o długości 1 cm przez więzadło pszyste, jak najbliżej wyrostka mieczykowatego, między pęcherzykiem żółciowym a wyrostkiem mieczykowatym. Upewnij się, że nie uszkodzisz pęcherzyka żółciowego.</li>
		<li>Przetnij następujące struktury łączące między wątrobą a klatką piersiową: przełyk, żyła główna dolna, aorta piersiowa, wszystkie więzadła otaczające nagi obszar wątroby i wszystkie pozostałe na grzbiecie połączenia tkankowe. 
		UWAGA: Próbka en-bloc jest całkowicie preparowana. Zawiera wątrobę, układ dróg żółciowych i ciało dwunastnicy, które jest połączone z odźwiernikiem żołądka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Końcowe rozwarstwienie pęcherzyka żółciowego i dróg żółciowych
<ol>
	<li>Wykonaj ogólne przygotowanie, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Umieść próbkę en bloc na podkładce piankowej zwykle używanej do odwadniania. Do tego i następnych kroków użyj 20-krotnego mikroskopijnego powiększenia i dwóch mikrochirurgicznych kleszczy atraumatycznych o maksymalnym rozmiarze końcówki 6 mm.</li>
		<li>Złóż próbkę na podkładce piankowej. Zreorganizuj próbkę w prawidłowej pozycji anatomicznej. Spłaszcz ustną i brzuszną część dwunastnicy, wykonując delikatny ruch.</li>
		<li>Rozpocznij ruch od brodawki dwunastnicy i kontynuuj do krawędzi tnących za pomocą atraumatycznych kleszczy. Wygładź białą, papkowatą zawartość żołądka, która wystąpi tylko w części ustnej dwunastnicy. Upewnij się, że zidentyfikowałeś ustną i abortalną część dwunastnicy, aby wykluczyć prawdopodobną rotację dróg żółciowych.</li>
		<li>Odetnij duże resztki tkanki wątrobowej, aby rozpocząć sekcję przewodu żółciowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj ostateczną izolację.
	<ol>
		<li>Delikatnie wciśnij pozostałą tkankę wątrobową w pory maty piankowej. Upewnij się, że ruchy skrobania rozpoczynają się od układu dróg żółciowych i prowadzą do granic wątroby.</li>
		<li>Przenieść próbkę do czystszego miejsca na macie piankowej po kilku ruchach skrobania w różnych kierunkach. Wykorzystaj zaletę mniej ściśniętej tkanki wątroby w tle, aby zoptymalizować widok w celu najlepszego możliwego różnicowania między EBDS a niechcianymi komórkami. Zeskrobać tkankę wątrobową z przewodu żółciowego, aż nic lub jak najmniej z tkanki wątrobowej nie pozostanie.</li>
		<li>Przetwarzaj więzadło wątrobowo-nerkowe do momentu, aż pozostanie izolowany EBDS. Usuń śródwięzadłowe naczynia krwionośne, takie jak tętnica wątrobowa, żyła wrotna i małe pozostałości. Wyjmij ten delikatny filament, delikatnie pociągając i z dużą ostrożnością, na lewą boczną stronę. Ten etap sekcji mógł już rozpocząć się nieumyślnie lub częściowo zakończony podczas wcześniejszego usuwania tkanki wątrobowej, co ostatecznie prowadzi do tego samego wyniku. 
		UWAGA: Naczynia krwionośne wyłaniają się jako białe i bardzo delikatne włókno około 3-5 mm od brodawki dwunastnicy i łączą się z więzadłem wątrobowo-oddechowym od lewej strony bocznej, gromadząc się wraz z przewodem żółciowym do triady glissonowskiej. Po zakończeniu tego etapu próbka końcowa jest całkowicie izolowana. Jeśli zachodzi potrzeba dokumentacji, obrazy mogą być rejestrowane po uporządkowaniu struktur dróg żółciowych w ich anatomicznej pozycji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zaleca się wykonanie ostatnich kroków przygotowawczych na macie piankowej, ponieważ próbka nie będzie tak bardzo przyklejać się do powierzchni pola operacyjnego. Jeśli pory są mokre, przewód żółciowy lewituje lub unosi się. Podczas przesuwania próbki nie będzie ona przyklejać się tak mocno, jak w przypadku przygotowania na tkaninie operacyjnej, co spowoduje brak rozdarcia podczas przesuwania próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie do analizy histologicznej
<ol>
	<li>Wyizolowaną próbkę umieścić w roztworze buforowym, specjalnym podłożu lub utrwalaczach zawierających formalinę (patrz tabela materiałów) tak szybko, jak to możliwe po rozebraniu.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie rozwiązanie magazynowe w zależności od dalszych planowanych etapów obróbki. 
	UWAGA: Używaj utrwalaczy zawierających formalinę tylko pod otworem wentylacyjnym ze względu na ostrą toksyczność, i różne zagrożenia dla zdrowia. 
	UWAGA: W prezentowanym badaniu próbki EBDS zostały wprowadzone do paraformaldehydu, odwodnione i zatopione w parafinie. Były przechowywane w temperaturze pokojowej i schłodzone przed podziałem. W komorze grzewczej plastry o grubości 2 μm przechowywano przez noc i barwiono przy użyciu konwencjonalnej hematoksyliny i eosin4 (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Liwinski, T., Schramm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prim%C3%A4r+sklerosierende+Cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Internist%22%5BJournal%5D)">Primär sklerosierende Cholangitis.</a> Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).</li>
<li>Kobayashi, H., Stringer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Neonatology%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia.</a> Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).</li>
<li>Patman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract%3A+Newly+identified+biliatresone+causes+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369(2015).</li>
<li>Mack, C. L., Sokol, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+pathogenesis+and+etiology+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia.</a> Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).</li>
<li>Karjoo, S., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neonatal+extrahepatic+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51621(2014).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+normal+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%3A+Advances+in+Integrative+Anatomy+and+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of normal bile ducts.</a> The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).</li>
<li>Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructure+and+development+of+the+normal+and+pathologic+biliary+tract+in+humans%2C+including+blood+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply.</a> Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).</li>
<li>Banales, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte pathobiology.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).</li>
<li>de Buy Wenniger, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholangiocyte+glycocalyx+stabilizes+the+%27biliary+HCO3-+umbrella%27%3A+an+integrated+line+of+defense+against+toxic+bile+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases%22%5BJournal%5D)">The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids.</a> Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).</li>
<li>Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+inflammation+and+proinflammatory+cytokines+in+cholangiocyte+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Khandekar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+the+mouse+extrahepatic+bile+duct%3A+Implications+for+neonatal+susceptibility+to+biliary+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury.</a> Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).</li>
<li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9226(2015).</li>
<li>Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W artykule tym opisano i omówiono tworzenie i walidację nowego podejścia chirurgicznego do usuwania EBDS u poddanych eutanazji nowonarodzonych myszy. Wyniki mikroskopowe i histologiczne pokazują, że metoda ta szybko wykrywa EBD i preparuje je w pobliżu brzegów przewodu, nawet u nowonarodzonych myszy. Do opisanego protokołu wymagane są wyłącznie narzędzia chirurgiczne oraz mikroskop o powiększeniu 20x. Co więcej, podejście to pozwala na odizolowanie całego EBDS. Technika jest bardzo wydajna, prosta i łatwa do odtworzenia....

Geneza i progresja cholagiopatii, takich jak atrezja dróg żółciowych, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych (PSC) i pierwotne zapalenie dróg żółciowych (PBC) są albo nieznane, albo niekompletne1,2. Ograniczona wiedza na temat pochodzenia i postępu tych chorób prowadzi do niedostatku opcji terapeutycznych3. Najtrudniejszą przeszkodą w badaniu zaburzeń dróg żółciowych u noworodków jest uzyskanie molekularnego zrozumienia patofizjologii. Jednym z podstawowych kluczy do lepszego zrozumienia patologii molekularnej jest najlepsza możliwa obserwacja dotkniętej chorobą tkanki. Aby uniknąć zmniejszonej porównywalności i rozbieżności między badaniami, takimi jak obserwacja potencjalnej etiologii wirusowej atrezji dróg żółciowych4, pojawia się potrzeba jak najlepszego przygotowania i udostępnienia wykonanych technik sekcji. Czyste przygotowanie tkanki docelowej jest niezbędne do późniejszych badań mikroskopowych lub hodowli komórek i organoidów 3D. Jednak w zaburzeniach noworodków u myszy próbki tkanek są rzadkie i występują tylko w niewielkiej ilości ze względu na bardzo mały rozmiar. Jeśli chodzi o zaburzenia dróg żółciowych, opisano trudności w czystym przygotowaniu dróg żółciowych u mysich noworodków5. Ze względu na noworodkowy etap rozwoju różnicowanie tkanek nie jest zbyt zaawansowane, co komplikuje przygotowanie i zwiększa trudność w porównaniu z przygotowaniem próbek dorosłych. W związku z tym operacyjna grupa robocza zbadała nową strategię przygotowania EBDS w modelu noworodkowym myszy. W niniejszym badaniu technika ta pozwala na skuteczną sekcję każdej próbki.
System dróg żółciowych jest umieszczony dootrzewnowo w prawej górnej części brzucha, wychodząc z wątroby. Pęcherzyk żółciowy znajduje się pod powierzchnią trzewną prawego płata wątroby. Przewód żółciowy wraz z żyłą wrotną i tętnicą wątrobową jest osadzony w więzadle wątrobowo-nerkowym. Łączy się bezpośrednio z wątrobą i dwunastnicą i odprowadza płyn żółciowy do dwunastnicy6. Anatomicznie przewód żółciowy jest podzielony na prawy i lewy przewód wątrobowy, wspólny przewód wątrobowy, przewód torbielowaty i przewód choledochus, który powstaje w wyniku zbiegu przewodu torbielowatego i wspólnego przewodu wątrobowego7. Ten ostatecznie opróżnia płyn żółciowy i ślinę z przewodu trzustkowego do dwunastnicy przez bańkę Vatera.
Cholangiocyty wyściełają przewód żółciowy wewnątrz i zewnątrzwątrobowo, mieszkając w skomplikowanej niszy anatomicznej, gdzie pomagają w produkcji żółci i homeostazie8. Płyn żółciowy codziennie przechodzi przez te wyspecjalizowane komórki nabłonkowe w wysokich stężeniach. W szczególności konserwacja parasola HCO3 jest bardzo ważna dla ochrony przed toksycznością kwasów żółciowych9. Cholangiocyty są pierwszą linią obrony w układzie wątrobowo-żółciowym przed, na przykład, mikroorganizmami luminalnymi10. Skuteczność obronna cholangiocytów przed atakami toksycznymi może być osłabiona przez predyspozycje genetyczne. Toksyczne przeciążenie powoduje uszkodzenia i zniszczenia, a zatem może prowadzić do cholangiopatii. Co więcej, rozwijający się przewód żółciowy nie jest w pełni zdolny do wszystkich mechanizmów samoobronnych, co prowadzi do większej podatności na toksyny środowiskowe w drogach żółciowych noworodków11.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>CHEMSOLUTE</td><td>11365000</td><td>stosowany jako środek odwadniający</td></tr><tr><td>30 G canula</td><td>B Braun/Sterican, Melsungen Niemcy</td><td>4656300</td><td>canula do hydratacji próbki</td></tr><tr><td>Odpowietrznik</td><td>C + P M&ouml; belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Niemcy</td><td>Tec-Ononmic AZ 1200</td><td>zastosowanie odpowietrznika pomaga uniknąć wdychania utrwalaczy zawierających formalinę</td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia Braun</td><td>B Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>2351744</td><td>soli fizjologicznej; Pojemnik: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterylny</td></tr><tr><td>Większe kleszcze mikrochirurgiczne</td><td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td><td>FD253R</td><td>proste, 180 mm (7"), końcówka platformy, uchwyt okrągły, szerokość: 0,800 mm, pokryte pyłem diamentowym, niesterylne, opcjonalne narzędzie wielokrotnego użytku do obserwacji i każdego etapu przygotowania, z wyjątkiem bardzo końcowego przygotowania; Dzielenie skóry otrzewnej</td></tr><tr><td>Kamera " Kamera SmartCAM 5" &nbsp;</td><td>Basler and Vision Engineering, Send, Wielka Brytania</td><td>EVC131A</td><td>opcjonalny moduł kamery Lynx Exo: typ czujnika: CMOS, rozdzielczość 2560 x 1920 pikseli, rozmiar czujnika: 1/2"; Służy do produkcji wideo i oceny technicznej</td></tr><tr><td>Maszyna do odwadniania/Citadel 2000 Tissue Processor</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Niemcy</td><td>12612613</td><td>służy do automatycznego odwadniania, krótki program (ok. 4,8 h)</td></tr><tr><td>Gąbka do odwadniania&nbsp;</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td> Gąbka <td>TT56.1</td><td>do końcowego etapu preparacji, odpowiednie są również inne gąbki/podkładki piankowe o minimalnej wielkości porów 60 na cal, zaleca się użycie dwóch podkładek piankowych na kasetę do zatapiania, aby przykryć próbkę od dołu i od góry, aby zapobiec przesuwaniu się przez perforację kaset do zatapiania</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Nie powoduje ostrej choroby; t zawierają Calzium lub Magnez, 500 ml</td></tr><tr><td>Kasety do zatapiania</td><td>Engelbrecht GmbH, Ederm&uuml; nde, Niemcy</td><td>17990</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Niemcy</td><td>41-6660-00</td><td>roztwór barwiący, gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki CeramaCut</td><td>FST, Heidelberg Niemcy</td><td>14959-09</td><td>Końcówki: Sharp-Sharp, Stop / Materiał: Stal nierdzewna pokryta ceramiką, ząbkowana:, Tak; Cecha: CeramaCut, Kształt końcówki: Prosta, Krawędź tnąca: 22 mm, Długość: 9 cm; Nacięcie skóry, nacięcie okienka otrzewnej</td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>FST, Heidelberg Niemcy</td><td>11051-10</td><td>Długość: 10 cm, Kształt końcówki: zakrzywiona, ząbkowana, Szerokość końcówki: 0,8 mm, Wymiary końcówki: 0,8 x 0,7 mm, Stop / Materiał: Stal nierdzewna</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Niemcy</td><td>41-5130-00</td><td>roztwór barwiący, gotowy do użycia</td></tr><tr><td>mikroskop Highresolotion</td><td>Inżynieria wizji, Wyślij Wielka Brytania</td><td>EVO503&nbsp;</td><td>Możliwość powiększenia do 60x, zastosowano tylko powiększenie od 6x do 20x&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Niemcy</td><td>BX60F5</td><td></td></tr><tr><td>Osłona mikroskopu Glases</td><td>Marienfeld, Lauda-K&ouml; nigshofen, Niemcy</td><td>101244</td><td>szerokości 60 mm, wykonane ze szkła SCHOTT D 263</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Niemcy</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Nu&szlig; loch, Niemcy</td><td>SM2010R</td><td>Narzędzie do cięcia (2 &mikro; m-plasterki)&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka Omnifix-F 1 ml</td><td>B Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>9161406V</td><td>strzykawka bez kaniuli</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td><td>4511</td><td>Tissue-Tek Wosk parafinowy Tek III, bez</td></tr><tr><td>DMSO Maszyna do zatapiania parafiny</td><td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Niemcy</td><td>TES 99</td><td>Maszyna do zatapiania wykorzystana w tym badaniu składała się z następujących trzech pojedynczych modułów: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. Próbka powinna być zanurzona w parafinie bezpośrednio po odwodnieniu, nie należy wykonywać tymczasowego przechowywania w lodówce ze względu na możliwe kurczenie się i wilgoć w lodówce</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Morphisto</td><td>1176201000</td><td>Przygotuj 1 ml porcji w 2 ml stożkowych probówkach Eppendorfa do próbek wątroby i 0,5 ml porcji w 1 ml stożkowych probówkach Eppendorf do próbek pozawątrobowych dróg żółciowych, 4% w PBS ph 7,4&nbsp;</td></tr><tr><td>Małe kleszcze mikrochirurgiczne&nbsp;</td><td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&uuml; tthard, Bayern, Niemcy</td><td>(00)165</td><td>Uchwyt okrągły, prosty, końcówka 0,3 mm, narzędzie do obserwacji i każdego etapu przygotowania, szczególnie przydatne w końcowym przygotowaniu</td></tr><tr><td>Linijka ze stali nierdzewnej</td><td>Agntho's AB, Liding&ouml;, Szwecja</td><td>30085-15</td><td>150mm z metrycznym i Nożyczki chirurgiczne z podziałką calową</td></tr><tr><td>&ndash; Ostro-do dekapitacji</td><td>FST, Heidelberg Niemcy</td><td>14001-14</td><td>Urządzenie do dekapitacji</td></tr><tr><td>Szafka grzewcza</td><td>Haraeus, Hanau, Niemcy</td><td>T 6060</td><td>pokrojone próbki należy przechowywać w komorze grzewczej, aby zapewnić przymocowanie próbki do szkiełek mikroskopowych</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

Rozwarstwienie mysich dróg żółciowych u noworodków zostało opisane jako trudne. Głównym celem opisanej standardowej procedury operacyjnej jest izolacja pozawątrobowego przewodu żółciowego (EBD) u noworodków myszy bez uszkodzenia przewodu żółciowego podczas preparacji. Ze względu na wyjątkowo dokładne przygotowanie w porównaniu z linią komórkową cholangiocytów i pobranie całego pozawątrobowego układu dróg żółciowych (EBDS), opisane podejście jest niezwykle przydatne w badaniach nad zwierzęcymi modelami chorób dróg żółciowych u noworodków, takich jak atrezja dróg żółciowych. Po eutanazji uzyskano dostęp do jamy otrzewnej, a układ dróg żółciowych, dwunastnicę i wątrobę zostały usunięte za pomocą unikalnej resekcji en-bloc (EbR). Wyekstrahowaną próbkę umieszcza się na macie piankowej, a EBD preparuje się z zanieczyszczających komórek w sposób atraumatyczny bez konieczności dotykania. Istotną zaletą tej metody jest rozwarstwienie całego EBDS. Należy zachować ostrożność ze względu na mały rozmiar i ilość tkanki dróg żółciowych. Stosując opisaną technikę, nie dochodzi do uszkodzenia cholangiocytów. Ponadto czystość techniki jest powtarzalna (n = 10). Dzięki temu można pobierać optymalnie porównywalne próbki. Ponadto żadna tkanka dróg żółciowych nie zostaje uszkodzona, ponieważ podczas przygotowania można uniknąć kontaktu z układem dróg żółciowych, pozostawiając płyn żółciowy wewnątrz pęcherzyka żółciowego. Co najważniejsze, podczas wykonywania końcowego rozwarstwienia pęcherzyka żółciowego i dróg żółciowych, mikroinstrumenty atraumatyczne stosowano tylko nieznacznie po bokach przewodu żółciowego, nie uciskając go. Jest to klucz do czystej i nienaruszonej próbki i niezbędny do dalszych badań histologicznych lub izolacji cholangiocytów. Podsumowując, opisana innowacyjna technika rozwarstwiania umożliwia szczególnie niedoświadczonym operatorom wyposażonym w niezbędny sprzęt odizolowanie EBDS tak czysto, jak to tylko możliwe.

Rysunek 1A przedstawia EBDS noworodka myszy, który został wypreparowany zgodnie z opisaną techniką. Mikroskopowo nie jest widoczna żadna dalsza tkanka wątroby. Tkanka wątroby została usunięta podczas końcowych etapów izolacji protokołu i można ją było łatwo odróżnić od tkanki przewodów żółciowych ze względu na kolor i konsystencję. Rysunek 1B ukazuje wyizolowaną próbkę w porównaniu ze skalą milimetrową. Długość EBD (mierzona od pęcherzyka żółciowego do brodawki ...

Do obserwacji zaburzeń dróg żółciowych u noworodków u myszy, niezbędny jest nienaruszony przewód żółciowy i skuteczne przygotowanie. W związku z tym z powodzeniem opracowano nowe podejście do izolowania całego pozawątrobowego układu dróg żółciowych u mysich noworodków przy zachowaniu integralności przewodu żółciowego.

Rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

W wielu sprawozdaniach oceniających pozawątrobowy układ dróg żółciowych stwierdzono, że uzyskano próbki, ale nie podano sposobu ich uzyskania, co rodzi wątpliwości co do porównywalności. Główną zaletą tej techniki jest to, że cały pozawątrobowy układ żółciowy może zostać wypreparowany, a zanieczyszczone komórki mogą zostać usunięte w sposób atraumatyczny. Nasz protokół preparacyjny może być ogólnie stosowany do podejść eksperymentalnych pracujących nad zaburzeniami dróg żółciowych u noworodków u myszy, mających na celu rozwarstwienie pozawątrobowego układu żółciowego.Niektóre cechy protokołu, na przykład pozostawienie żołądka przyczepionego do dwunastnicy, mogą być przydatne w badaniach nad atrezją dwunastnicy, aby umożliwić prawidłową orientację przez częściowo strawione mleko wyrażane przez żołądek. Na początku technika może wymagać trochę czasu na trening. Ćwiczenie i podążanie za podejściem krok po kroku zwiększy szybkość i wynik.Na początek umieść zdezynfekowane i autoklawowane narzędzia na sterylnej powierzchni obok stołu operacyjnego. Po wykonaniu nacięcia w otrzewnej należy rozszerzyć cięcie do miejsca dekapitacji, zgodnie z lewą linią pachową czołową. Usuń skórę od lewej d

extrahepatic-bile-duct-gall-bladder-dissection-nine-day-old-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje procedurę generowania modelu myszy z ostrym żółciowym zapaleniem trzustki poprzez trzustkowy wlew taurocholanu sodu. Model ten pomaga badać zmiany patofizjologiczne wywołane przez taurocholan sodu w trzustce.

Model ostrego żółciowego zapalenia trzustki: metoda generowania mysiego modelu ostrego żółciowego zapalenia trzustki za pomocą infuzji z przewodu trzustkowego

Opisano technikę izolowania cholangiocytów z pozawątrobowych dróg żółciowych u noworodków myszy. Kanaliki są skrupulatnie preparowane, a następnie komórki są izolowane przez wyrost w gęstych żelach kolagenowych. Metoda ta stanowi przydatne narzędzie do badania rozwoju i patologii pozawątrobowych dróg żółciowych.

Izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków

Zakłócenie przepływu żółci powoduje ciężkie zapalne cholestatyczne uszkodzenie wątroby z charakterystyczną, zależną od czasu sekwencją zmian morfologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół chirurgicznego podwiązania przewodu żółciowego wspólnego u myszy, który pozwala na wywołanie silnej odpowiedzi zwłóknieniowej po 21 do 28 dniach.

Podwiązanie dróg żółciowych u myszy: indukcja zapalnego uszkodzenia wątroby i zwłóknienia przez chalestazę obturacyjną

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Narzędzia do diagnozowania zaburzeń wchłaniania kwasów żółciowych i pomiaru transportu kwasów żółciowych in vivo są ograniczone. Opisano innowacyjne podejście na żywych zwierzętach, które wykorzystuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego protonem (1H) i fluorem (19F); Ta nowatorska metodologia ma potencjał translacyjny w badaniach przesiewowych w kierunku złego wchłaniania kwasów żółciowych w praktyce klinicznej.

Wykorzystanie wielofluorowanych kwasów żółciowych i rezonansu magnetycznego in vivo do pomiaru transportu kwasów żółciowych

Tutaj prezentujemy częściowe podwiązanie dróg żółciowych jako chirurgiczny model uszkodzenia i regeneracji wątroby u gryzoni.

Częściowe podwiązanie dróg żółciowych u myszy: kontrolowany model zlokalizowanej cholestazy obturacyjnej

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodę opartą na nanocząstkach srebra do łagodzenia zespołu atrezji dróg żółciowych w eksperymentalnym modelu myszy z atrezją dróg żółciowych. Solidne zrozumienie procesu przygotowania odczynnika i techniki wstrzykiwania noworodków na myszach pomoże zapoznać badaczy z metodą stosowaną w badaniach na modelu noworodkowym myszy.

Metoda nanocząstek srebra w łagodzeniu zespołu atrezji dróg żółciowych u myszy

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest najcięższą chorobą przewodu pokarmowego (GI), która często występuje u wcześniaków, szczególnie u niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej, z wysoką śmiertelnością i niejasną patogenezą. Przyczyna NEC może być związana z nieprawidłowościami w zakresie regulacji immunologicznej. Model zwierzęcy NEC jest niezbędnym narzędziem do badań immunologicznych nad chorobą NEC. Modele zwierzęce NEC zwykle wykorzystują nowonarodzone myszy C57BL/6J; Myszy...

Mysi model martwiczego zapalenia jelit u noworodków BALB/c

Stworzyliśmy mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby, który dostarcza odpowiedniego modelu zwierzęcego do mechanistycznego badania atrezji dróg żółciowych (BA) wywołanego przez wirusa i platformy dla przyszłych terapii BA.

Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Naucz się techniki izolacji pozawątrobowego układu żółciowego u noworodków myszy. Metoda zapewnia integralność przewodów żółciowych i umożliwia atraumatyczne usunięcie komórek zanieczyszczających.

Rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy

Przeglądaj więcej filmów