Rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy

W wielu sprawozdaniach oceniających pozawątrobowy układ dróg żółciowych stwierdzono, że uzyskano próbki, ale nie podano sposobu ich uzyskania, co rodzi wątpliwości co do porównywalności. Główną zaletą tej techniki jest to, że cały pozawątrobowy układ żółciowy może zostać wypreparowany, a zanieczyszczone komórki mogą zostać usunięte w sposób atraumatyczny. Nasz protokół preparacyjny może być ogólnie stosowany do podejść eksperymentalnych pracujących nad zaburzeniami dróg żółciowych u noworodków u myszy, mających na celu rozwarstwienie pozawątrobowego układu żółciowego.

Niektóre cechy protokołu, na przykład pozostawienie żołądka przyczepionego do dwunastnicy, mogą być przydatne w badaniach nad atrezją dwunastnicy, aby umożliwić prawidłową orientację przez częściowo strawione mleko wyrażane przez żołądek. Na początku technika może wymagać trochę czasu na trening. Ćwiczenie i podążanie za podejściem krok po kroku zwiększy szybkość i wynik.

Na początek umieść zdezynfekowane i autoklawowane narzędzia na sterylnej powierzchni obok stołu operacyjnego. Po wykonaniu nacięcia w otrzewnej należy rozszerzyć cięcie do miejsca dekapitacji, zgodnie z lewą linią pachową czołową. Usuń skórę od lewej do prawej strony za pomocą atraumatycznych kleszczy.

Pod mikroskopem przytrzymaj otrzewną otaczającą śledzionę. Delikatnie podnieś go, aż otrzewna będzie przypominać strukturę przypominającą namiot i wytnij jednomilimetrowy otwór pośrodku. Poczekaj, aż namiot otrzewnowy zostanie wypełniony powietrzem.

Odetnij otrzewną w oknie obramowanym dolnymi żebrami, obydwoma bocznymi obszarami brzucha i dolną częścią pęcherza. Zapewnij pełny dostęp do wątroby, układu dróg żółciowych, żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego. Zbadaj pęcherzyk żółciowy i drogi żółciowe, ostrożnie pociągając wyrostek mieczykowaty w pozycji brzusznej czaszki.

Unikaj zerwania więzadła poskrowego, które może prowadzić do zerwania pęcherzyka żółciowego z układu dróg żółciowych. Następnie zwolnij ciągnięcie wyrostka mieczykowatego. Delikatnie pociągnij dwunastnicę w dół, aby uwolnić system dróg żółciowych.

Następnie wykonaj dolną mobilizację En-bloc identyfikując brodawkę dwunastnicy, która łączy układ dróg żółciowych z dwunastnicą. Przeciąć dwunastnicę około dwóch centymetrów po prawej bocznej stronie brodawki. Następnie przetnij obszar odźwiernika.

Upewnij się, że zawartość żołądka znajduje się w obszarze odźwiernika między miejscem cięcia a brodawką dwunastnicy. Aby wykonać górną mobilizację En-bloc, delikatnie pociągnij wyrostek mieczykowaty i uzyskaj dostęp do więzadła mieszkowatego. Wykonaj jednocentymetrowe przecięcie przez więzadło falciform między pęcherzykiem żółciowym a blisko wyrostka mieczykowatego.

Przetnij struktury łączące między wątrobą a klatką piersiową, takie jak przełyk, żyła główna dolna, aorta piersiowa i wszystkie więzadła otaczające goły obszar wątroby. Przetnij również wszystkie pozostałe grzbietowo połączenia tkankowe. Pod 20-krotnym powiększeniem mikroskopowym umieść próbkę En-bloc na podkładce piankowej.

Zbierz próbkę, reorganizując ją w prawidłowej pozycji anatomicznej. Delikatnymi ruchami spłaszcz ustną i brzuszną część dwunastnicy. Za pomocą kleszczy atraumatycznych rozpocznij ruch spłaszczający na brodawce dwunastnicy i kontynuuj do krawędzi tnących.

Następnie wygładź białą, papkowatą zawartość żołądka w części ustnej dwunastnicy. Zidentyfikuj ustną i oraliczną część dwunastnicy, aby wykluczyć prawdopodobną rotację dróg żółciowych. Odetnij duże resztki tkanki wątrobowej przed wypreparowaniem przewodu żółciowego.

Po wykonaniu kilku ruchów skrobania przenieś próbkę w czystsze miejsce na macie piankowej. Użyj mniej ściśniętej tkanki wątroby w tle, aby zoptymalizować widok pod kątem różnicowania między EBDS a niechcianymi komórkami. Przetwarzaj więzadło wątrobowo-nerkowe do momentu, aż pozostanie izolowany EBDS.

Obserwuj, jak tętnica wątrobowa i żyła wrotna powstają jako białe i bardzo delikatne włókno, około trzech do pięciu milimetrów doustnie od brodawki dwunastnicy. Ostrożnie wyjmij ten delikatny filament, delikatnie pociągając w lewą boczną stronę. Upewnij się, że ruchy skrobania zaczynają się od układu dróg żółciowych i prowadzą do granic wątroby.

Korzystając z tego protokołu, EBDS wypreparowano z dziewięciodniowych mysich noworodków. Długość izolowanego EBDS od pęcherzyka żółciowego do brodawki dwunastnicy wynosiła mniej niż 10 milimetrów, a średnica delikatnego przewodu choledochus wahała się od 0,05 do 0,2 milimetra. Barwienie eozyną hematoksyliną przeprowadzono na przekroju podłużnym EBDS przy otwartym świetle.

Cholangiocyty zostały zidentyfikowane wokół światła jako monowarstwa i zostały zabarwione na ciemniejszy kolor. Naukowcy powinni dzielić się i standaryzować techniki operacyjne, takie jak protokoły preparacji i iniekcji, aby poprawić porównywalność i szybką użyteczność swoich badań i wyników. Wcześniejsza sekcja będzie korzystna dla podejść histologicznych i jednokomórkowych, takich jak izolacja wewnątrz- i zewnątrz-cholangiocytów, ponieważ powoduje zmniejszenie zanieczyszczenia kultur komórkowych.