Name: Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Naucz się testu redukcyjnego XTT do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis. Ta metoda pozwala badaczom oceniać aktywność metaboliczną grzybów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Ramalingaswami DBT-843-BIO (Departament Biotechnologii, Rząd Indii) oraz Nagrodę Badań nad Wczesną Karierą SER-1058-BIO (Rada Badań Naukowych i Inżynieryjnych, Rząd Indii) dla S.R. Autorzy potwierdzają przyznanie grantu ICMR-JRF dla P.C oraz grantu DBT-JRF dla P.S. Autorzy dziękują dr Ravikantowi Ranjanowi za sugestie dotyczące manuskryptu i pomoc techniczną ze strony pana Pradeepa Singha Thakura podczas SEM.

Myszy BALB/c były przetrzymywane w Obiekcie dla Małych Zwierząt (Small Animal Facility) w IIT Roorkee. Wszystkie zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności (12 h:12 h) w temperaturze 25 °C, zapewniając im dietę w formie pelletu oraz wodę ad libitum. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Etyki Badań nad Zwierzętami (IAEC) w IIT Roorkee.
1. Przygotowanie C. tropicalis
UWAGA: Grzyb Candida tropicalis należy do patogenów grupy ryzyka 2 i jest klasyfikowany jako mikroorganizm BSL2. Podczas pracy z gatunkami Candida należy zawsze używać certyfikowanych komór bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Podczas pracy z C. tropicalis należy stosować techniki aseptyczne i sterylne oraz przestrzegać zalecanych procedur bezpieczeństwa biologicznego w celu prawidłowej utylizacji tego patogenu.
<ol>
	<li>Posiew metodą kreskową C. tropicalis (szczep ATCC 750) na płytkę z agarem Sabourauda (SAB).</li>
	<li>Przygotować kulturę namnożoną przez noc z C. tropicalis poprzez zaszczepienie pojedynczej kolonii z płytki z agarem SAB do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki SAB w formie bulionu. Alternatywnie można użyć mrożonego banku w glicerolu z *C. tropicalis* i zaszczepić 100 µL zamrożonego w glicerolu stosu do sterylnej kolby stożkowej o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki SAB.</li>
	<li>Inkubować *C. tropicalis* hodować w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przy 180 obr./min w temp. 30 °C przez 24–48 h.</li>
	<li>Odwirować kulturę grzybową (komórki w fazie logarytmicznej) przy 2150 × g przez 15 min w temperaturze 21 °C.</li>
	<li>Odrzucić nadsącz i dodać 50 ml sterylnego 1x PBS do osadu. Przemyć i resuspender osad w sterylnym 1x PBS, delikatnie mieszając na wortexie.</li>
	<li>Ponownie odwiruj przy 2 150 × g przez 15 min w temperaturze 21 °COdciśnij supernatant i resuspenduj osad grzybowy w 10 ml sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Obliczanie stężenia komórek za pomocą zliczania w komorze Bürchera (haemocytometrze).</li>
	<li>Przygotować zawiesiny grzybów o końcowym zagęszczeniu 1,0 × 106 komórek/ml w podłożu RPMI 1640 z kwasem morfolinopropanosulfonowym (MOPS). Zawiesinę komórkową z kroku 1.6 należy wykorzystać niezwłocznie. 
	UWAGA: Do przygotowania jednej płytki 96-dołkowej wymagana całkowita objętość zawiesiny grzybowej wynosi 10 ml (100 µL/well). Skalować według potrzeb.</li>
</ol>
2. Tworzenie biofilmu przez C. tropicalis
<ol>
	<li>Przygotować biofilmy Candida w 96-dołkowej polistyrenowej płytce mikrotytrującej z płaskim dnem zgodnie z wcześniejszym opisem (Rycina 1)28,29.</li>
	<li>Do 96-dołkowej płytki mikrotytrującej dodać 100 µL hodowli C. tropicalis (z zapasu o stężeniu 106 komórek/mL, przygotowanego powyżej) za pomocą pipety wielokanałowej (Rycina 2A). Dwie ostatnie kolumny (11 i 12) zachować jako kontrole negatywne „bez grzyba i z surowicą” oraz „bez grzyba i bez surowicy”, nie dodając komórek grzyba. Kolumny 11 i 12 wypełnić samą pożywką RPMI 1640 MOPS w ilości 100 µL.</li>
	<li>Przykryć płytkę mikrotytrującą pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 24 h w temperaturze 37 °C w warunkach stacjonarnych.</li>
	<li>Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej (nie dotykając i nie naruszając biofilmów). Delikatnie uderzyć płytką w pozycji odwróconej o ręczniki papierowe, aby usunąć resztki pożywki.</li>
	<li>Przemyć płytkę 200 µL 1x PBS (na dołek) za pomocą pipety wielokanałowej. Dodawać PBS bardzo ostrożnie wzdłuż ścian bocznych dołka, aby uniknąć zniszczenia biofilmów. Ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Powtórzyć przemywanie PBS 2x (łącznie trzy razy).</li>
	<li>Aby usunąć nadmiar PBS, wysuszyć płytkę na powietrzu (bez pokrywki) przez 30 min w temperaturze pokojowej, wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
</ol>
3. Traktowanie biofilmu przeciwciałami
UWAGA: Biofilmy można teraz poddać procesom oceny hamowania dojrzewania biofilmu przez przeciwciała. Jako źródło przeciwciał poliklonalnych wykorzystano surowicę mysią. Od różnych grup myszy immunizowanych Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis i Sap2-parapsilosis) oraz myszy immunizowanych pozornie pobrano krew z zatoki zaocznej i wyizolowano surowicę zgodnie z wcześniejszym opisem19. Obecność przeciwciał anty-Sap2 potwierdzono za pomocą swoistego dla Sap2 testu ELISA, zgodnie z wcześniejszym opisem19.
<ol>
	<li>Przed użyciem przeprowadzić inaktywację termiczną surowicy (źródła przeciwciał poliklonalnych) w temperaturze 56 °C przez 30 min, aby wykluczyć rolę dopełniacza w aktywności hamującej. Surowicę należy poddać inaktywacji termicznej przed przygotowaniem rozcieńczeń. 
	UWAGA: Jako dodatkowe kontrole należy zastosować surowicę z myszy immunizowanych pozornie, myszy przedimmunizowanych oraz surowicę pozbawioną przeciwciał specyficznych dla Sap219. Surowicę pozbawioną przeciwciał przygotowano zgodnie z poprzednim badaniem19. Wśród rozcieńczeń seryjnych (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1 600, 1:3 200, 1:6 400 i 1:12 800) surowicy testowanej w niniejszym protokole, zahamowanie dojrzewania biofilmu zaobserwowano przy 1:25, 1:50 i 1:100; w związku z tym wybrano rozcieńczenie 1:50, aby zachować równowagę między inhibicją a zużyciem surowicy.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia seryjne próbek surowicy inaktywowanej termicznie w sterylnym medium RPMI 1640 MOPS (1:50). Dla wszystkich próbek surowicy testowanych pod kątem hamowania dojrzewania biofilmu należy zastosować jednakowe rozcieńczenie surowicy (1:50)30.</li>
	<li>Do każdego dołka płytki mikrotitryjnej 96-dołkowej dodać 100 µL wybranego rozcieńczenia surowicy. Dla każdej próbki dodać rozcieńczenia surowicy w dubletach, zgodnie z załączonym schematem (Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Do kolumny 10 nie dodawać rozcieńczenia surowicy; dodać jedynie medium RPMI 1640 MOPS jako dodatnią kontrolę tylko z grzybem. 
		UWAGA: W kolumnie 10, w rzędach G1-G8 i H1-H8, początkowo znajdowały się komórki grzyba w RPMI-MOPS. Jednakże, mimo dodawania RPMI-MOPS do kolumny 10 również po 24 h, rzędy G1-G8 służyły jako kontrola PBS, a rzędy H1-H8 jako kontrola bez surowicy po 24 h.</li>
		<li>Do kolumny 11 dodać do wszystkich dołków rozcieńczenie surowicy 1:50, aby służyła jako ujemna kontrola bez grzyba z surowicą.</li>
		<li>Do kolumny 12 nie dodawać rozcieńczenia surowicy do żadnego dołka; pozostawić ją jako ujemną kontrolę bez grzyba i bez surowicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryć płytkę pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 24 h w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Szacowanie aktywności metabolicznej biofilmu
<ol>
	<li>Następnego dnia ostrożnie odessać surowicę za pomocą pipety wielokanałowej (unikając dotykania lub naruszania biofilmów). Delikatnie uderzyć płytką w pozycji odwróconej o arkusze absorpcyjne, aby usunąć resztki surowicy.</li>
	<li>Przemyć płytkę 200 µL 1x PBS (na studzienkę) za pomocą pipety wielokanałowej, dodając PBS wzdłuż ścianek bocznych studzienki, aby uniknąć naruszenia biofilmów. Ostrożnie odessać PBS pipetą wielokanałową i powtórzyć przemywanie PBS 2x (łącznie trzy razy). Suszyć płytkę na powietrzu (bez pokrywki) przez 30 min w temperaturze pokojowej, wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, aby usunąć nadmiar PBS.</li>
	<li>Przygotowanie XTT/menadionu:
	<ol>
		<li>Przygotować XTT w sterylnym roztworze mleczanowo-ringera jako roztwór 0,5 g/L. Rozpuścić 25 mg XTT w 50 mL filtrowanego i sterylizowanego roztworu mleczanowo-ringera. Odmierzyć aliquoty po 10 mL do oddzielnych probówek owiniętych folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy menadionu o stężeniu 10 mM. Rozpuścić 8,6 mg menadionu w 5 mL acetonu i rozdzielić po 50 µL do 100 oddzielnych mikroprobówek. Alikwoty przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór XTT/menadionu bezpośrednio przed użyciem, pobierając 10 mL XTT i dodając 1 µL menadionu w celu uzyskania roztworu roboczego o stężeniu 1 µM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 µL roztworu XTT/menadionu do każdej studzienki 96-dołkowej płytki mikrotitrazyjnej. Przykryć płytkę pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 2 h w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Przenieść 80 µL zabarwionego supernatantu z każdej studzienki do nowej płytki 96-dołkowej. Odczytać absorbancję płytki przy 490 nm.</li>
	<li>Obliczyć średnią wartości absorbancji dla studzienek w kolumnie 10 (pozytywna kontrola zawierająca tylko grzyba), która posłuży jako wartość referencyjna do obliczenia procentowego hamowania biofilmu przez każdą próbkę surowicy zgodnie z równaniem (1). 
	% hamowania biofilmu = 100 - <img alt="Stosunek wyników ELISA: Absorbancja studzienki z dodatkiem surowicy/absorbancja studzienki kontrolnej bez surowicy, wzór." src="/files/ftp_upload/64425/64425eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> × 100    (1)</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Infekcje grzybicze wywoływane przez gatunki Candida są związane z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością na całym świecie. Rosnące zagrożenie inwazyjną infekcją grzybiczą wymaga wczesnego leczenia takich zagrażających życiu chorób. Większość zakażeń Candida wiąże się z tworzeniem biofilmów, które przylegają do różnych urządzeń medycznych i są odpowiedzialne za utrzymywanie się i nawroty infekcji grzybiczych w warunkach szpitalnych31. Biofilmy składają się z komórek drożdży lub ...

Kandydoza układowa jest czwartą główną przyczyną zakażeń szpitalnych, które są związane z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością na całym świecie. Na całym świecie kandydoza układowa dotyka około 700 000 osób1. Gatunki Candida, a mianowicie C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata i C. auris, są najczęstszą przyczyną inwazyjnych zakażeń Candida2. Gatunki Candida są oportunistycznymi patogenami, które wytwarzają biofilmy3. Biofilmy są głównie związane ze zjadliwością Candida, a Candida może wytrzymać warunki stresu oksydacyjnego i osmotycznego poprzez indukowanie tworzenia biofilmu4. Biofilmy dodatkowo modulują ekspresję czynników wirulencji i składników ściany komórkowej oraz tworzą egzopolimerową matrycę ochronną, pomagając Candida przystosować się do różnych nisz gospodarza4. Biofilmy przyczyniają się do przylegania drożdży do tkanek gospodarza i instrumentów medycznych5. W związku z tym tworzenie biofilmu wiąże się z przewagą drożdży, ponieważ komórki drożdży w biofilmach mogą unikać odpowiedzi immunologicznej gospodarza6. Tworzenie biofilmu chroni również chorobotwórcze drożdże przed działaniem leków przeciwgrzybiczych5. Zmniejszona wrażliwość biofilmów C. albicans na amfoterycynę B została wykazana przez Pierce et al.7,8. Ponadto biofilmy wykazują lekooporność przeciwgrzybiczą na flukonazol, co upośledza skuteczne leczenie kandydozy układowej9,10.
Mikroby mają wrodzoną tendencję do przylegania do różnych powierzchni biotycznych i abiotycznych, co powoduje powstawanie biofilmu. Candida albicans, który jest grzybem dymorficznym, występuje w postaci drożdży i strzępek, a jego tworzenie biofilmu zostało scharakteryzowane w różnych systemach modelowych in vitro i in vivo11. Etapy tworzenia biofilmu obejmują przyleganie komórek Candida do podłoża, filamentację, proliferację i dojrzewanie biofilmu11. Początkowo forma drożdżowa C. albicans przylega do substratów, w tym wyrobów medycznych i tkanek ludzkich, następnie następuje filamentacja i proliferacja C. albicans do postaci strzępkowych i pseudostrzępkowych, a na końcu dojrzewanie biofilmów osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej11. Powstawanie biofilmu w dużej mierze przyczynia się do mechanizmów patogenezy C. albicans12. Gatunki Candida tworzą biofilmy odporne na leki, co sprawia, że ich eliminacja jest trudna13. Niewielka podgrupa populacji wytwarzającej biofilm C. albicans została opisana jako wysoce odporna na leki przeciwgrzybicze amfoterycyna B i chlorheksydyna14. Warto zauważyć, że komórki drożdży w biofilmach wykazują wysoką oporność na terapię wielolekową w porównaniu z komórkami drożdży w fazie planktonu i fazie proliferacji14. Zasugerowano, że komórki drożdży występujące w biofilmach są wysoce tolerancyjne na leki przeciwgrzybicze, co przyczynia się do przetrwania C. albicans w biofilmach14. Stwierdzono, że te istniejące komórki są fenotypowymi wariantami C. albicans, a nie mutantami14. Co więcej, komórki biofilmów Candida, znane jako "komórki trwałe", są tolerancyjne na wysokie dawki amfoterycyny-B i przyczyniają się do przeżycia Candida, stanowiąc tym samym duże obciążenie nawracającymi ogólnoustrojowymi infekcjami Candida u osób z grupy wysokiego ryzyka15.
Wzrost oporności na leki przeciwgrzybicze u szczepów Candida wymaga badań nad nowymi środkami przeciwgrzybiczymi i immunoterapiami. Jak wynika z wyżej wymienionych badań, biofilmy Candida wykazują zmniejszoną podatność na leki przeciwgrzybicze. Dlatego istnieje potrzeba poprawy immunoterapii w celu kontrolowania tworzenia biofilmu Candida. Wcześniejsze badania wykazały, że CAGTA może zapewnić skuteczną ochronę przed ogólnoustrojowymi infekcjami Candida poprzez hamowanie tworzenia biofilmu C. albicans in vitro16. Inne badanie wykazało, że immunizacja myszy białkiem rAls3-N C. albicans indukuje wysokie miana przeciwciał, które zakłócają tworzenie biofilmu C. albicans in vitro17. Przeciwciała anty-Als3-N wywierały również hamujący wpływ na rozprzestrzenianie się C. albicans z biofilmów17. Szczepionka NDV-3A oparta na C. albicans jest obecnie w fazie badań klinicznych i stwierdzono również, że surowice anty-NDV-3A zmniejszają tworzenie biofilmu C. auris18. Niedawne badanie zidentyfikowało hamowanie tworzenia biofilmu przez przeciwciała Sap2 jako mechanizm ochronny w mysim modelu kandydozy układowej19.
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół in vitro do oceny wpływu przeciwciał specyficznych dla antygenu obecnych w surowicy poliklonalnej uzyskanej z różnych grup myszy szczepionych Sap2 na wstępnie uformowane biofilmy Candida tropicalis. Aby to osiągnąć, zoptymalizowano i opracowano w laboratorium metodę opartą na teście redukcji XTT, która może mierzyć żywotność biofilmu w szybki, czuły i wysokoprzepustowy sposób, w obecności lub braku przeciwciał.
Test XTT służy do pomiaru komórkowej aktywności metabolicznej jako wskaźnika żywotności komórek, proliferacji komórkowej i cytotoksyczności20. Ten test kolorymetryczny opiera się na redukcji żółtej soli tetrazolowej, 3'-[1-(fenyloaminokarbonylo)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksy-6-nitro)benzenosulfonowego hydratu (XTT) do pomarańczowego barwnika formazanu przez metabolicznie aktywne komórki. Ponieważ tylko żywe komórki mogą redukować XTT, ilość zredukowanego formazanu XTT jest proporcjonalna do intensywności koloru i żywotności komórek. Utworzony barwnik formazanu jest rozpuszczalny w wodzie i jest bezpośrednio oznaczany ilościowo za pomocą czytnika płytek. Ze względu na swoją rozpuszczalność w wodzie, test XTT pozwala na badanie nienaruszonych biofilmów, a także badanie wrażliwości biofilmu na leki, bez naruszania struktury biofilmu21. Dodatkowo metoda ta jest wdrażana w ocenach żywotności grzybów Candida ze względu na łatwość użycia, szybkość, dokładność, wysoką przepustowość i wysoki stopień odtwarzalności7,22.
Oprócz testu redukcji XTT, zidentyfikowano również wiele alternatywnych technik pomiaru ilości biofilmu. Niektóre z nich obejmują zastosowanie testu redukcji MTT, barwienie fioletem krystalicznym, kwantyfikację DNA, ilościową PCR, kwantyfikację białek, pomiar masy suchych komórek i liczenie żywotnych kolonii. Procedury te różnią się znacznie pod względem wymagań czasowych i kosztowych. Taff i in. przeprowadzili analizę porównawczą siedmiu różnych testów ilościowych biofilmu Candida i stwierdzili, że test XTT zapewnił najbardziej powtarzalną, dokładną i wydajną metodę ilościowego szacowania biofilmów C. albicans23. Techniki barwienia, takie jak fiolet krystaliczny, mają pewne ograniczenia; Test fioletu krystalicznego pośrednio określa ilość biofilmu, mierząc gęstość optyczną matrycy i komórek biofilmu barwionego fioletem krystalicznym. Chociaż test fioletu krystalicznego zapewnia dobrą miarę masy biofilmu, nie daje miary żywotności biofilmu, ponieważ barwi zarówno komórki drobnoustrojów, jak i macierz zewnątrzkomórkową24. Dhale i in. stwierdzili ponadto, że test redukcji XTT był najbardziej czułą, powtarzalną, dokładną, wydajną i specyficzną metodą wykrywania produkcji biofilmu w porównaniu z testem fioletu krystalicznego25. Doniesienia literaturowe wykazały, że test XTT dobrze koreluje z parametrem CFU/ml w metodzie liczenia CFU. Jednak w porównaniu z testem XTT, metoda CFU jest pracochłonna i powolna26. Co więcej, frakcja oderwanych żywych komórek może nie być reprezentatywna dla początkowej populacji biofilmu27. Chociaż test redukcji XTT wydaje się najlepszą dostępną opcją do ilościowego określenia żywotności, istnieje kilka ograniczeń tej techniki. Chociaż metoda XTT jest przydatna do porównań obejmujących jeden szczep grzyba, jej zastosowanie może być ograniczone w przypadku porównywania różnych szczepów i gatunków grzybów. Porównania między szczepami mogą być trudne ze względu na brak szczegółowej standaryzacji, ponieważ różne szczepy metabolizują substraty o różnych możliwościach21.

<table><tbody><tr><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>BD Falcon</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-Przygotowane</td><td></td> <td>w laboratorium</td><td>NaCl : 4 g KCl : 0,1 g Na2HPO4:&nbsp; 0,72 g KH2PO4 : 0,12 g Woda 500 ml. Dostosuj pH do 7,4</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml BD</td><td>Falcon</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania</td><td></td> Inkubator <td>Nunc</td> 442404 <td></td></tr><tr><td></td><td>Ogólny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek do mikromiareczkowania</td><td></td> Menadione Sigma M5625 Ogólny <td></td><td></td>Wielokanałowa</tr><tr><td></td><td></td><td></td> pipeta i końcówki Ogólny <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td>, <td>Tarson</td><td>460090</td><td></td></tr>, <tr><td>mleczan Ringersa</td><td>,</td> <td>przygotowany w laboratorium</td>, <td>chlorek sodu 0,6 g, mleczan sodu 0,312 g, chlorek potasu 0,035 g, chlorek wapnia 0,027 g, woda 100 ml. Dostosuj do pH 7,0&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 MOPS</td><td>Himedia</td><td>AT180</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza Sabouraud Agar</td><td>SRL</td><td>24613</td><td></td></tr><tr><td>Bulion dekstroza Sabouraud</td><td>SRL</td><td>24835</td><td></td></tr><tr><td>XTT&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>X6493</td><td></td></tr></tbody></table>

rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy candida tropicalis

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Gatunki Candida są czwartą najczęstszą przyczyną ogólnoustrojowych zakażeń szpitalnych. Kandydoza układowa lub inwazyjna często wiąże się z tworzeniem się biofilmu na wszczepionych urządzeniach lub cewnikach, co wiąże się ze zwiększoną zjadliwością i śmiertelnością. Biofilmy wytwarzane przez różne gatunki Candida wykazują zwiększoną odporność na różne leki przeciwgrzybicze. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania skutecznych immunoterapii lub leczenia wspomagającego przeciwko biofilmom Candida. Podczas gdy rola odporności komórkowej jest dobrze znana w ochronie przed Candida, rola odporności humoralnej została zbadana w mniejszym stopniu.
Postawiono hipotezę, że hamowanie tworzenia i dojrzewania biofilmu jest jedną z głównych funkcji przeciwciał ochronnych, a wcześniej wykazano, że przeciwciała przeciwko cewie zarodkowej Candida albicans (CAGTA) hamują wzrost in vitro i tworzenie biofilmu C. albicans. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół oceny roli przeciwciał w biofilmach tworzonych przez C. tropicalis. Metodologia tego protokołu obejmuje tworzenie biofilmu C. tropicalis na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych, które następnie inkubowano w obecności lub bez przeciwciał specyficznych dla antygenu, a następnie test 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilido-2H-tetrazolium (XTT) w celu pomiaru aktywności metabolicznej komórek grzybów w biofilmie.
Specyficzność została potwierdzona przez użycie odpowiednich kontroli surowicy, w tym surowicy zubożonej w przeciwciała Sap2. Wyniki pokazują, że przeciwciała obecne w surowicy uodpornionych zwierząt mogą hamować dojrzewanie biofilmu Candida in vitro. Podsumowując, artykuł ten dostarcza ważnych spostrzeżeń na temat potencjału przeciwciał w opracowywaniu nowych immunoterapii oraz synergicznych lub wspomagających terapii przeciwko biofilmom podczas inwazyjnej kandydozy. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

*Candida tropicalis* biofilmy hodowano w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych, a obrazowanie przeprowadzano przy 40-krotnym powiększeniu przy użyciu mikroskopu odwróconego (Rycina 1A). Biofilm zabarwiono następnie fioletem krystalicznym i obserwowano przy powiększeniu 40x przy użyciu mikroskopu odwróconego (Rysunek 1B). Skaningowa mikroskopia elektronowa przedstawia reprezentatywny obraz *C. tropicalis* biofilm (Rycina 1...

Protokół oparty na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej przy użyciu testu redukcji 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilid-2H-tetrazolium (XTT) jest opisany tutaj, w celu zbadania wpływu przeciwciał na biofilmy utworzone przez C. tropicalis. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

Ten protokół in vitro, oparty na 96-dołkowej płytce, może być wykorzystany do zbadania hamującego wpływu przeciwciał przeciwko nowym środkom przeciwgrzybiczym na aktywność metaboliczną komórek grzybów w biofilmach Candida. W porównaniu z innymi metodami, jest to wysoce czuła, dokładna, wysokoprzepustowa, powtarzalna, przyjazna dla użytkownika i opłacalna technika oceny wpływu przeciwciał lub środków przeciwgrzybiczych na rozwój biofilmów Candida. Test ten może być wykorzystany do oceny skuteczności nowych leków lub terapii opartych na przeciwciałach, a także kandydatów na szczepionki przeciwko biofilmom Candida, które są związane z nasileniem inwazyjnej kandydozy.Metoda ta może być stosowana do badania wpływu nowych środków przeciwgrzybiczych lub przeciwciał podczas tworzenia lub dojrzewania biofilmu w różnych warunkach przy użyciu różnych szczepów grzybów lub źródeł przeciwciał. Tę procedurę zademonstruje Pan Pankaj Chandley, doktor nauk humanistycznych pracujący w moim laboratorium. Na początek dodaj 100 mikrolitrów kultury Candida tropicalis do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.Za pomocą pipety wielokanałowej napełnij dwie ostatnie kolumny 100 mikrolitrami samego podłoża RPMI 1640 MOPS. Przykryj płytkę do mikromiareczkowania pokrywką i folią aluminiową i inkubuj płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach stacjonarnych. Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej.Delikatnie odwróć płytkę na bibułce i postukaj, aby usunąć resztki nośnika. Umyj płytkę 200 mikrolitrami 1X PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety wielokanałowej i dwukrotnie przemyć PBS.Aby usunąć nadmiar PBS, należy wysuszyć płytkę na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbek surowicy inaktywowanej termicznie w sterylnym pożywce RPMI 1640 MOPS. Dodać 100 mikrolitrów wybranego rozcieńczenia surowicy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.W kolumnie 10 dodać tylko pożywkę MOPS RPMI 1640 do kontroli pozytywnej opartej wyłącznie na grzybach. Dodać rozcieńczenie surowicy w proporcji od 1 do 50 do wszystkich studzienek w kolumnie 11, aby służyły jako kontrola ujemna surowicy bez grzybów i surowicy. Po przykryciu płytki pokrywką i folią aluminiową inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia, po ostrożnym zassaniu serum za pomocą pipety wielokanałowej, delikatnie postukaj w odwróconą płytkę, aby usunąć resztki surowicy. Powtórz mycie PBS trzy razy i susz płytkę na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wysuszyć nadmiar PBS. Następnie rozpuść 25 miligramów XTT w 50 mililitrach sterylizowanego przez filtr mleczanu Ringera.Podwielokrotność 10 mililitrów w oddzielnych tubach. Przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie rozpuść 8,6 miligrama menadionu w pięciu mililitrach acetonu.A po rozprowadzeniu 50 mikrolitrów w 100 oddzielnych mikroprobówkach przechowuj porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Weź 10 mililitrów XTT i dodaj jeden mikrolitr menadionu, aby uzyskać jednomikromolowy roztwór roboczy. Dodać 100 mikrolitrów roztworu menadionu XTT na dołek 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.Następnie, po przykryciu płytki pokrywką i folią aluminiową, inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Na koniec przenieś 80 mikrolitrów kolorowego supernatantu z każdej studzienki do świeżej płytki 96-dołkowej i odczytaj płytkę przy 490 nanometrach. Surowica myszy uodpornionych na Sap2-parapsilosis może zapobiec dojrzewaniu wstępnie uformowanych biofilmów Candida tropicalis o 65% w porównaniu do 45% w surowicy Sap2-albicans i 55% u myszy uodpornionych Sap2-tropicalis.Ogólnie rzecz biorąc, hamowanie biofilmu przez surowicę immunologiczną Sap2 było znacznie wyższe niż przez pozorowaną surowicę immunologiczną, która wynosi 16% i 13% w surowicy przedimmunologicznej. Hamowanie biofilmu było prawie nieistotne przy stosowaniu PBS i braku kontroli surowicy. Podczas wykonywania czynności prania należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec przerwaniu biofilmu.Roztwór XTT należy przygotować tuż przed użyciem i natychmiast dodać do płytki. Postępując zgodnie z tą procedurą, użytkownicy mogą ocenić wpływ nowych środków przeciwgrzybiczych, kandydatów na szczepionki lub przeciwciał podczas tworzenia i dojrzewania biofilmu Candida w różnych warunkach badawczych przy użyciu różnych szczepów grzybów.

a-soluble-tetrazolium-based-reduction-assay-to-evaluate-effect

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Zacznij od zawiesiny bakteryjnej w podłożu odżywczym.Dodaj zawiesinę do wielodołowej płyty i inkubuj.Składniki odżywcze zawarte w podłożu ułatwiają wzrost i przyczepianie bakterii.Przyklejone bakterie wydzielają pozakomórkowe substancje polimerowe składające się z polisacharydów, białek i DNA, tworząc warstwę biofilmu.Myj wielokrotnie z buforem, aby usunąć niezwiązane bakterie.Odwróć płytę, aby usunąć resztki płynu z studni i pozwolić biofilmowi wyschnąć.Traktuj utrwalaczem, aby zachować...

Ocena powstawania biofilmu bakteryjnego za pomocą testu na bazie barwnika kationowego

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy,...

Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Źródło: Bucher, T. i in. Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzowania inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp. (2016).Ten film pokazuje, jak integralność matrycy biofilmu wpływa na odporność bakterii na etanol, porównując jednostki tworzące kolonie w biofilmach nieleczonych i zaburzonych przez inhibitory. Zmniejszone CFU w próbkach objętych inhibitorami pokazują, że macierz zewnątrzkomórkowa jest niezbędna do ochrony komórek osadzonych w biofilmie przed...

Test odporności na etanol w celu oceny integralności matrycy biofilmu

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania wpływu przeciwciał na biofilmy grzybów. Chorobotwórczy grzyb Candida tropicalis wydziela czynnik wirulencji wydzielający proteinazę aspartylową 2 (Sap2), ułatwiając tworzenie biofilmu. Po wprowadzeniu inaktywowanej termicznie surowicy zawierającej przeciwciała specyficzne dla Sap2, które hamują dojrzewanie biofilmu, ocenia się żywotność komórek grzyba za pomocą testu chromogennego.

Test in vitro w celu oceny wpływu przeciwciał na biofilm Candida tropicalis

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Naucz się testu redukcyjnego XTT do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis. Ta metoda pozwala badaczom oceniać aktywność metaboliczną grzybów in vitro.

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

Przeglądaj więcej filmów