Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

Ten protokół in vitro, oparty na 96-dołkowej płytce, może być wykorzystany do zbadania hamującego wpływu przeciwciał przeciwko nowym środkom przeciwgrzybiczym na aktywność metaboliczną komórek grzybów w biofilmach Candida. W porównaniu z innymi metodami, jest to wysoce czuła, dokładna, wysokoprzepustowa, powtarzalna, przyjazna dla użytkownika i opłacalna technika oceny wpływu przeciwciał lub środków przeciwgrzybiczych na rozwój biofilmów Candida. Test ten może być wykorzystany do oceny skuteczności nowych leków lub terapii opartych na przeciwciałach, a także kandydatów na szczepionki przeciwko biofilmom Candida, które są związane z nasileniem inwazyjnej kandydozy.

Metoda ta może być stosowana do badania wpływu nowych środków przeciwgrzybiczych lub przeciwciał podczas tworzenia lub dojrzewania biofilmu w różnych warunkach przy użyciu różnych szczepów grzybów lub źródeł przeciwciał. Tę procedurę zademonstruje Pan Pankaj Chandley, doktor nauk humanistycznych pracujący w moim laboratorium. Na początek dodaj 100 mikrolitrów kultury Candida tropicalis do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

Za pomocą pipety wielokanałowej napełnij dwie ostatnie kolumny 100 mikrolitrami samego podłoża RPMI 1640 MOPS. Przykryj płytkę do mikromiareczkowania pokrywką i folią aluminiową i inkubuj płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach stacjonarnych. Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej.

Delikatnie odwróć płytkę na bibułce i postukaj, aby usunąć resztki nośnika. Umyj płytkę 200 mikrolitrami 1X PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety wielokanałowej i dwukrotnie przemyć PBS.

Aby usunąć nadmiar PBS, należy wysuszyć płytkę na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbek surowicy inaktywowanej termicznie w sterylnym pożywce RPMI 1640 MOPS. Dodać 100 mikrolitrów wybranego rozcieńczenia surowicy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

W kolumnie 10 dodać tylko pożywkę MOPS RPMI 1640 do kontroli pozytywnej opartej wyłącznie na grzybach. Dodać rozcieńczenie surowicy w proporcji od 1 do 50 do wszystkich studzienek w kolumnie 11, aby służyły jako kontrola ujemna surowicy bez grzybów i surowicy. Po przykryciu płytki pokrywką i folią aluminiową inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia, po ostrożnym zassaniu serum za pomocą pipety wielokanałowej, delikatnie postukaj w odwróconą płytkę, aby usunąć resztki surowicy. Powtórz mycie PBS trzy razy i susz płytkę na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wysuszyć nadmiar PBS. Następnie rozpuść 25 miligramów XTT w 50 mililitrach sterylizowanego przez filtr mleczanu Ringera.

Podwielokrotność 10 mililitrów w oddzielnych tubach. Przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie rozpuść 8,6 miligrama menadionu w pięciu mililitrach acetonu.

A po rozprowadzeniu 50 mikrolitrów w 100 oddzielnych mikroprobówkach przechowuj porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Weź 10 mililitrów XTT i dodaj jeden mikrolitr menadionu, aby uzyskać jednomikromolowy roztwór roboczy. Dodać 100 mikrolitrów roztworu menadionu XTT na dołek 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

Następnie, po przykryciu płytki pokrywką i folią aluminiową, inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Na koniec przenieś 80 mikrolitrów kolorowego supernatantu z każdej studzienki do świeżej płytki 96-dołkowej i odczytaj płytkę przy 490 nanometrach. Surowica myszy uodpornionych na Sap2-parapsilosis może zapobiec dojrzewaniu wstępnie uformowanych biofilmów Candida tropicalis o 65% w porównaniu do 45% w surowicy Sap2-albicans i 55% u myszy uodpornionych Sap2-tropicalis.

Ogólnie rzecz biorąc, hamowanie biofilmu przez surowicę immunologiczną Sap2 było znacznie wyższe niż przez pozorowaną surowicę immunologiczną, która wynosi 16% i 13% w surowicy przedimmunologicznej. Hamowanie biofilmu było prawie nieistotne przy stosowaniu PBS i braku kontroli surowicy. Podczas wykonywania czynności prania należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec przerwaniu biofilmu.

Roztwór XTT należy przygotować tuż przed użyciem i natychmiast dodać do płytki. Postępując zgodnie z tą procedurą, użytkownicy mogą ocenić wpływ nowych środków przeciwgrzybiczych, kandydatów na szczepionki lub przeciwciał podczas tworzenia i dojrzewania biofilmu Candida w różnych warunkach badawczych przy użyciu różnych szczepów grzybów.