Name: Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj metodę etykietowania zbliżeniowego opartą na AirID do badania interakcji białko-białko w roślinach z użyciem ogórka Cucumis sativus. Protokół obejmuje agroinfiltrację, biotynowanie i oczyszczanie białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 32000197 dla X.H.), Specjalny Grant Finansowy od Chińskiej Fundacji Nauk Podoktorskich (Grant nr 2019T120467 dla X.H.)

1. Przygotowanie materiału roślinnego
<ol>
	<li>Cucumis sativus (ogórek) jest używany do analizy eksperymentalnej. Umieść nasiona w wodzie, inkubuj w temperaturze 50 °C przez 20 minut, a następnie umieść nasiona na bibule filtracyjnej na szalce Petriego na 12-16 godzin.</li>
	<li>Następnie przenieś nasiona do doniczek z ziemią (zakupionych komercyjnie) i hoduj w komorze klimatycznej o temperaturze 23 °C i 16 godzinach światła i 8 godzin ciemnego fotoperiodu.</li>
	<li>Utrzymuj rośliny w komorze klimatycznej przez 3-4 tygodnie, aż rośliny osiągną 3 lub 4 etapy liści, aby zapewnić skuteczną agroinfiltrację.</li>
</ol>
2. Konstruowanie AirID
<ol>
	<li>Użyj APRR2 jako białka docelowego i skonstruuj APRR2-AirID pod promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora (p35S: APRR2-AirID). Wprowadź go do wektora binarnego zgodnego z Gateway pEarleyGate1006 (dostarczonego przez dr Kathrin Schrick, Kansas State University) i zsyntetyzuj enzym PL bezpośrednio zgodnie z sekwencją podaną w pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kompetentnych komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek kompetentnych DH5α
	<ol>
		<li>Zaszczepić 2 ml LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl; pH = 7,0) komórkami E.Coli DH5α (bezpośrednio z zamrożonego wywaru bez rozmrażania) i rosnąć przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Świeżo zaszczepić 0,1%-0,5% inokulum z kultury O/N do 100 ml pożywki LB i hodować komórki, aż OD600 osiągnie wartość 0,4-0,6, a następnie inkubować kulturę w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
		<li>Przenieść kulturę do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 2500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 10 ml 0,1 M lodowatego CaCl2 i umieścić na lodzie na 15 minut. Granulować komórki za pomocą wirowania 2500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1 ml lodowatego 0,1 M CaCl2 + 20% glicerolu, podwielokrotność 100 μl do każdej probówki o pojemności 1,5 ml i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kompetentnych komórek GV3101
	<ol>
		<li>Zaszczepić 2 ml LB (zawierającego 50 μg/ml gentamycyny i 25 μg/ml ryfampicyny) pojedynczą kolonią GV3101. Inkubować kulturę O/N w temperaturze 28 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min.</li>
		<li>Zaszczepić 200 ml LB 1 ml nasyconej kultury na noc. Wstrząsnąć kulturą z prędkością 250 obr./min, inkubując ją w temperaturze 28 °C, aż OD600 będzie równa 0,5.</li>
		<li>Przenieść kulturę do czterech wstępnie schłodzonych, sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i umieścić na lodzie na 30 minut.</li>
		<li>Granulować komórki w temperaturze 2500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i umieścić granulki na lodzie.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml 0,1 M lodowatego roztworu CaCl2. Połącz komórki w jedną, wstępnie schłodzoną probówkę Oakridge o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Osadzać komórki w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml lodowatego roztworu CaCl2. Ustawić na lodzie na 30 minut.</li>
		<li>Osadzać komórki w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml 0,1 M lodowatego roztworu CaCl2</li>.
		<li>Dozować komórki do podwielokrotności 50 μl we wstępnie schłodzonych sterylnych probówkach polipropylenowych. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Agroinfiltracja
<ol>
	<li>Najpierw przenieś plazmid do agrobacterium
	<ol>
		<li>Przenieść 2,5 μl plazmidu wytworzonego z etapu 2.1 do właściwych komórek szczepu agrobacterium tumefaciens GV3101 i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść probówkę zawierającą plazmid i właściwe komórki do ciekłego azotu na 3 minuty.</li>
		<li>Szok termiczny w temperaturze 37 °C przez 5 minut w inkubatorze, a następnie umieścić probówkę na lodzie na 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 1 000 μl pożywki LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl; pH = 7,0) do agrobacterium i inkubować w temperaturze 30 °C i 118 obr./min przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować przy 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzucić górne 800 μl roztworu i wymieszać pozostały roztwór. Następnie ułóż go na LB (jak wspomniano w kroku 4.1.4 dodanym z agarem i 50 μg/ml kanamycyny dla plazmidu i 50 μg/ml gentamycyny i 25 μg/ml ryfampicyny dla komórek kompetentnych GV3010). Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 48 godz. 
		UWAGA: Lepiej jest wybrać kilka rodzin i przeprowadzić PCR, aby potwierdzić interesujący nas gen7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać kilka kolonii bakteryjnych z płytek i umieścić je w pożywce LB wraz z odpowiednimi antybiotykami (patrz krok 4.1.6). Inkubować w temperaturze 30 °C i 218 obr./min przez 36-48 godzin.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki do OD600 = 1,0 w buforze agroinfiltracji (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringonu).</li>
	<li>Naciekać inokulum (wygenerowane z kroku 4.3) w (abaksyjnym) naskórku za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej. 
	UWAGA: Lepiej jest naciekać cały liść i zdecydować się na replikację. W przypadku 4-5 roślin użyj jednego konstruktu. Na każdy liść wystarczy 1,5 ml zawieszonych agrobakterii.</li>
	<li>Rośliny należy utrzymywać przez 36 godzin w komorze klimatycznej przy 16-godzinnym świetle (około 75 μmol·m-2·s-1) i 8-godzinnym ciemnym fotoperiodze w temperaturze 23 °C.</li>
	<li>Po 36 godzinach infiltracji konstruktu, naciekać 1 ml 5 μM Biotyny (w 10 mM roztworze MgCl2) do już przefiltrowanych liści konstruktu.</li>
	<li>Utrzymuj traktowane rośliny przez dodatkowe 4-12 godzin przed zbraniem tkanki liściowej. 
	UWAGA: Zgodnie z poprzednim badaniem, białko docelowe osiąga szczyt po 36 godzinach, więc wybierz 36 hpi biotyna infiltracje4,6. Czas inkubacji biotyny zależy od badania docelowego, ale zgodnie z obecnym eksperymentem 8-godzinny okres inkubacji jest bardziej odpowiedni do znakowania białek.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek
UWAGA: Wszystkie materiały do pobierania próbek powinny być sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia keratyną, a wszystkie kroki protokołu powinny być wykonywane w środowisku wolnym od zanieczyszczeń.
<ol>
	<li>Odetnij przesączone liście i szybko przenieś je do ciekłego azotu, aby uniknąć degradacji białka.</li>
	<li>Wykonaj wstępne wykrywanie białka za pomocą analiz immunoblotów6; jest to wysoce zalecane przed koimmunoprecypitacją (Co-IP).</li>
</ol>
6. Całkowita ekstrakcja białka z liści
<ol>
	<li>Zmiel liście za pomocą tłuczka i moździerza, szybko dodaj 2 ml 1x PBS-BSA PH 7,4 i powoli zmielić.</li>
	<li>Weź stożkową probówkę o pojemności 15 ml, umieść filtr materiału do szybkiej filtracji na górze stożkowej probówki, przenieś mieszaninę próbek do probówki przez filtr materiału do szybkiej filtracji i trzymaj ją na lodzie.</li>
	<li>Przenieś próbki do probówki o pojemności 2 ml i dodaj 1% koktajl inhibitorów białka.</li>
	<li>Wymieszać zawartość, obracając 7-8 razy w górę i w dół, a następnie odwirować przy 1.000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść górny rozpuszczalnik próbek do nowych probówek o pojemności 2 ml, dodać 10% β-D-maltozydu (β-D.M) i umieścić na lodzie na 5 minut. Wirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Wyrównaj kolumnę odsalającą
<ol>
	<li>Odwirować kolumnę przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zaznacz jedną stronę kolumny i upewnij się, że oznaczona strona jest skierowana na zewnątrz podczas wszystkich procesów wirowania.</li>
	<li>Zdjąć górną i dolną pokrywę kolumny i odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wylać płynny roztwór z probówki zbiorczej kolumny i dodać 5 ml 1x buforu PBS do przemycia.</li>
	<li>Odwirować kolumnę o stężeniu 1 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 7.3 i 7.4 co najmniej pięć razy.</li>
</ol>
8. Mycie koralików magnetycznych
<ol>
	<li>Weź probówkę o pojemności 1,5 ml i dodaj 50 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 1x PBS-BSA do mycia, dokładnie wymieszaj i umieść na stojaku magnetycznym na 3 minuty. Wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 8.2 co najmniej trzy razy.</li>
	<li>Po każdym myciu umieść rurkę na stojaku magnetycznym, aby zaadsorbować kulki w kierunku jednej strony tuby, aby usunąć bufor myjący.</li>
</ol>
9. Wzbogacanie białek biotynylowanych
<ol>
	<li>Dodać 2 ml próbek do kolumny i odwirować przy 1 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 1 ml odsolonego ekstraktu białkowego do 50 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1, aby je zrównoważyć.</li>
	<li>Umieść probówkę na rotatorze z normalną prędkością, aby roztwór dokładnie się wymieszał i inkubował w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.</li>
	<li>Umieść koraliki na stojaku magnetycznym na 3 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy zbiorą się po jednej stronie probówki, aby delikatnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania I (2% SDS w wodzie), obracać w temperaturze RT przez 2 minuty na rotatorze i powtórzyć krok 9.4.</li>
	<li>Umieścić probówkę na rotatorze w temperaturze pokojowej na 2 minuty po dodaniu 1 ml buforu do przemywania II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v] i 1% Triton X-100). Powtórz krok 9.4.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v], 1% NP40 [v/v]) i obracać za pomocą wytrząsarki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz krok 9.4.</li>
	<li>Aby usunąć detergent, dodaj 1,7 ml 50 ml Tris-HCl (pH = 7,5) i powtórz krok 9.4. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>Przemyć kulki sześć razy przez 2 minuty każdy w 1 ml 50 mM buforu wodorowęglanu amonu w temperaturze pokojowej i powtórzyć krok 9.4.</li>
	<li>Dodać 50 μl ekstraktu białkowego zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12% (m/v) sacharozy (Suc), 2% (w/v) laurylosiarczanu litu i 1,5% (w/v) ditiotreitolu do kulek, szok termiczny w inkubatorze w temperaturze 100 °C przez 5 minut i postępować zgodnie z krokiem 9.4. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do analizy LC-MS/MS.</li>
</ol>

<ol><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+novel+protein-protein+interactions+in+liver+that+affect+glucagon+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity.</a> PloS One. 10 (6), 0129226(2015).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+host+proteins+interacting+with+Theileria+annulata+cysteine+proteinase+%28TaCP%29+by+yeast-two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+agrobacterium-mediated+method+for+transient+gene+expression+and+functional+studies+in+multiple+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species.</a> Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).</li>
<li>Kido, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AirID%2C+a+novel+proximity+biotinylation+enzyme%2C+for+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions.</a> eLife. 9, 54983(2020).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+7-hydroxymethyl+chlorophyll+a+reductase+alleviates+non-programmed+cell+death+during+dark-induced+senescence+in+intact+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants.</a> Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).</li>
<li>Ammiraju, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oryza+bacterial+artificial+chromosome+library+resource%3A+construction+and+analysis+of+12+deep-coverage+large-insert+BAC+libraries+that+represent+the+10+genome+types+of+the+genus+Oryza%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza.</a> Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albino+Leaf+2+is+involved+in+the+splicing+of+chloroplast+group+I+and+II+introns+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+evolutionary+track+of+a+highly+specific+l-Arginine+oxidase+by+reconstruction+and+biochemical+analysis+of+ancestral+and+native+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).</li>
<li>Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li>
<li>Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO-specific+isopeptidase+SENP2+is+targeted+to+intracellular+membranes+via+a+predicted+N-terminal+amphipathic+%CE%B1-helix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).</li>
<li>Motani, K., Kosako, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+stimulator+of+interferon+genes+%28STING%29+induces+ADAM17-mediated+shedding+of+the+immune+semaphorin+SEMA4D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

W obecnym eksperymencie AirID został wykorzystany do znakowania zbliżeniowego, które Kido i in. opracowali za pomocą algorytmu rekonstrukcji enzymów przodków przy użyciu dużego zestawu danych genomu i pięciu konwencjonalnych enzymów BirA5. Losowe mutacje były wykorzystywane w tradycyjnej ewolucyjnej inżynierii białkowej w celu zwiększenia aktywności 9,10, ponieważ losowe mutacje nie mogą powodować dynamicznych zmian sekwencji. W porównaniu...

Różne białka komórkowe działają w ramach biologicznie regulowanego systemu, a interakcje białko-białko (PPI) są częścią tego systemu i podstawą wielu procesów komórkowych. Oprócz IPP, funkcja naturalnych białek jest promowana potranslacyjnie poprzez różne modyfikacje, takie jak tworzenie kompleksu, ubikwitynacja i fosforylacja. Dlatego badanie IPP jest istotne dla zrozumienia możliwej funkcji docelowych białek. IPP zostały przeprowadzone przy użyciu różnych technologii, takich jak analiza spektrometrii mas po immunoprecypitacji (analiza IP-MS)1, drożdżowy system dwuhybrydowy (Y2H)2, również tablice bezkomórkowe3. Metody te pozwoliły na zbadanie różnych istotnych ustaleń w dziedzinie badań. Metody te mają jednak pewne wady; na przykład Y2H jest czasochłonną i kosztowną strategią, która wymaga zbudowania biblioteki Y2H gatunków docelowych.
Dodatkowo, technika Y2H wykorzystuje drożdże, heterologiczny jednokomórkowy organizm eukariotyczny, który nie mógł dokładnie odzwierciedlić stanu komórkowego wyższych komórek eukariotycznych. IP-MS nie nadaje się do białek o wysokiej hydrofobowości i wykazuje niską skuteczność w wychwytywaniu słabych IPP. Różne niezbędne białka w roślinach, takie jak domena wiążąca nukleotydy i bogate w leucynę białka zawierające powtórzenia (NLR) oraz kinazy receptoropodobne (RLK), ulegają ekspresji na niskim poziomie i w większości przejściowo oddziałują z innymi białkami; Dlatego użycie tych metod jest niewystarczające do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji tych białek3.
Nowa technika zwana biotynylacją zbliżeniową (PB) pomaga badaczom identyfikować IPP. PB zależy od enzymów PL, które przyłączają się do białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI), a gdy białko partnerskie zbliża się do POI, PL przyłącza chemiczny znacznik biotyny do białka partnerskiego. Co więcej, oznakowane białko można zidentyfikować i szybko dowiedzieć się, które białko partnerskie przyłącza się do docelowego białka5. Poprzednie badania dowiodły, że BioID i TurboID są skutecznymi narzędziami do wykrywania IPP, zwłaszcza w roślinach, ale mają pewne ograniczenia4. BioID potrzebuje wysokiego poziomu biotyny do znakowania białek partnerskich, co zajmuje ponad 16 godzin. W porównaniu z BioID, TurboID jest bardziej korzystny, ponieważ znakuje białko w ciągu 10 minut i może znakować białko partnerskie w temperaturze pokojowej (RT). Jest również toksyczny dla komórek w pewnych warunkach i oznacza te białka, które nie wykazują interakcji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.
Aby przezwyciężyć te problemy, AirID, opracowany przez Kido et al., jest bardziej wydajny niż reszta enzymów znakujących, chociaż podobieństwo sekwencji wynosi 82% między BioID a AirID5. Aby sprawdzić skuteczność AirID, przeprowadziliśmy eksperyment z wykorzystaniem punktu POI ze znanymi powiązaniami. Eksperyment ten potwierdził, że AirID może bez wątpienia znakować powiązane białka w komórkach roślinnych. AirID jest cennym enzymem do analizy IPP in vitro i w komórkach. Powoduje mniejszą toksyczność i jest mniej błędny w procesach czasowych niż TurboID do oznaczania osób niebędących partnerami, co prowadzi do zabicia komórki. Pokazuje to, że AirID jest bardziej konkurencyjny niż inne enzymy znakujące biotynylację zbliżeniową. Jest dokładniejszy, ma większy potencjał w procesach czasochłonnych i jest mniej toksyczny in vitro i w żywych komórkach. Obecny protokół opisuje identyfikację oddziałujących białek APRR2 przy użyciu AirID jako enzymu PL; Ponadto metoda ta może być stosowana do innych białek w celu zbadania IPP u gatunków roślin.

<table><tbody><tr><td>Acetosyringone</td><td>Pekin solaribo nauka i technologia Co.Ltd</td><td>S1519</td><td></td></tr><tr><td>Acryl/Bis 30% roztwór</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>1510KA4528</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioFroxx GmbH</td><td>D64683</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>tsingke (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>TSJ001</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G313BA0018</tr><tr><td>Biotyna</td><td>BBI nauki przyrodnicze G908BA0012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI nauki przyrodnicze</td><td>E209BA0008</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne komórki GV3101</td><td>Wykonane w obecnym eksperymencie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca</td><td>Thermo scientific</td><td>WC321753</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dezoksycholowy</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G818BA0029</tr><tr><td>DH5&alfa; kompetentne komórki</td><td>Wykonane w obecnym eksperymencie</td><td></td><td>E.coli DH5&alpha;</td></tr><tr><td>&beta;-D-maltozyd</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S818</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>E104BA0029</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>161BA0031</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>H209BA0003</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Beijing solaribo nauka i technologia Co.Ltd</td><td>M8019</td><td></td></tr><tr><td>MiraCloth</td><td>EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Niemcy</td><td>3429963</td><td>Filtr do szybkiej filtracji</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>20200819</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>H324BA0003</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>N8030</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów białka</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S3450</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr> 5820172 <tr><td>SDS</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S1015</td><td></td></tr><tr><td>Silwet</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne sprzężone ze streptawidyną-C1</td><td>Wzbogacanie biotechnologii</td><td>7E511E1</td><td>Koraliki magnetyczne</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Servicebio</td><td>G2056</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>GB03BA007</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co.Ltd</td><td>F828BA0020</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo scientific</td><td>LP0042</td><td></td></tr></tbody></table>

etykietowanie zbliżeniowe oparte na airid dla interakcji białko-białko w roślinach

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

W komórkach ssaków i roślinach, metody znakowania zbliżeniowego (PL) z użyciem zmodyfikowanej peroksydazy askorbinianowej (APEX) lub ligazy biotyny Escherichia coli BirA (znanej jako BioID) okazały się skuteczne w identyfikacji interakcji białko-białko (PPI). APEX, BioID i TurboID, poprawiona wersja BioID, oprócz tego, że są cennymi technologiami, mają pewne ograniczenia. Niedawno opracowany AirID, nowatorska wersja BioID do identyfikacji zbliżeniowej w interakcjach białko-białko, przezwyciężyła te ograniczenia. Wcześniej AirID był stosowany w modelach zwierzęcych, podczas gdy obecne badanie pokazuje zastosowanie AirID w roślinach, a wyniki potwierdziły, że AirID działa lepiej w systemach roślinnych w porównaniu z innymi enzymami PL, takimi jak BioID i TurboID, do znakowania białek, które są proksymalne do białek docelowych. Oto protokół krok po kroku do identyfikacji partnerów interakcji białkowych przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2) jako modelu. Metody opisują budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, transformację biotyny, ekstrakcję białek i wzbogacanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa. Wyniki wskazują, że AirID jest nowym i idealnym enzymem do analizy IPP u roślin. Metoda może być stosowana do badania innych białek w roślinach.

Zgodnie z poprzednimi badaniami, gen ogórka APRR2 jest genem kandydującym kontrolującym kolor białych, niedojrzałych owoców8. W niniejszej pracy opracowano protokół wykorzystujący AirID jako enzym znakowania bliskościowego w celu zidentyfikowania białka oddziałującego z APRR2 u ogórka. Konstrukt wprowadzono do liści ogórka, a po 36 h od infiltracji podano biotynę. Po 48 h pobrano próbki do analizy western blot w celu potwierdzenia pomyślnej transformacji. Białka wyekstrahowano zg...

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

AirID jest cennym enzymem do interakcji białko-białko i powoduje mniejszą toksyczność i mniej błędów w procesach zachodzących w czasie niż inne enzymy znakujące bliskość. Przedstawiono protokół krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentu znakowania zbliżeniowego na ogórku lub Cucumis sativus przy użyciu białka APRR2-AirID AT4G18020 jako modelu. Procedurę zademonstrują Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng i Min Zhang z mojego laboratorium.Zacznij od przeniesienia nasion Cucumis sativus lub ogórka do wody, inkubacji w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut, a następnie umieszczenia nasion na bibule filtracyjnej na szalce Petriego na 12 do 16 godzin. Później przenieś nasiona do doniczek z ziemią i hoduj je w komorze klimatycznej w temperaturze 23 stopni Celsjusza w 16 godzinach światła i 18 godzin ciemności przez trzy do czterech tygodni. Przenieś 2,5 mikrolitra plazmidu EarleyGate 100 do właściwych komórek szczepu agrobacterium tumefaciens GV3101.Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut, a następnie przenieść ją do ciekłego azotu na trzy minuty. Aby wywołać szok cieplny, przenieś probówkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie umieść probówkę na lodzie na dwie minuty.Dodaj 1 000 mikrolitrów pożywki Luria Bertani lub LB do komórek agrobacterium poddanych szokowi cieplnemu. Po inkubacji komórek w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 118 obr./min przez godzinę, odwirować je w temperaturze 3000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant o pojemności 800 mikrolitrów i wymieszaj pozostały roztwór.Umieść go na podłożu LB uzupełnionym 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i gentamycyny oraz 25 mikrogramami na mililitr ryfampicyny. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zbierz kilka kolonii bakterii z talerzy.Umieść je w płynnym podłożu LB, uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami i inkubuj płynny LB w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 218 obr./min przez 36 do 48 godzin. Po dwóch minutach wirowania w temperaturze 3 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ponownie zawieś osad w buforze do agroinfiltracji, aby dostosować gęstość optyczną do jednej przy długości fali 600 nanometrów. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki bezigłowej naciekaj cały naskórek powierzchni abakcjalnej 1,5 mililitra zawieszonego inokulum agrobakteryjnego.Utrzymuj rośliny w komorze klimatycznej w temperaturze 23 stopni Celsjusza przy świetle 75 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę przez 16 godzin w ciemności przez osiem godzin Po 36 godzinach naciekaj jeden mililitr z pięciu mikrogramów biotyny do już przefiltrowanych liści. Po czterech do 12 godzinach infiltracji biotyny odetnij liście i szybko przenieś je do ciekłego azotu, aby uniknąć degradacji białka. Zmiel liście za pomocą tłuczka i moździerza i szybko dodaj dwa mililitry PBS BSA o pH 7,4, a następnie powoli miel.Przenieś mieszaninę próbek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów przez filtr z materiału filtracyjnego do szybkiej filtracji umieszczony na niej i utrzymuj probówkę na lodzie. Przenieś próbki do dwumililitrowej probówki. Dodaj 1% koktajl inhibitorów białka i wymieszaj zawartość, obracając probówkę w górę i w dół siedem do ośmiu razy przed odwirowaniem.Po zakończeniu przenieś supernatant do nowej dwumililitrowej probówki i dodaj 10% beta-D-maltozydu. Umieść probówkę na lodzie na pięć minut, a następnie odwiruj w temperaturze 20 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zrównoważyć kolumnę odsalającą, zaznacz jedną stronę kolumny i odwiruj ją zaznaczoną stroną skierowaną na zewnątrz.Zdjąć górną i dolną pokrywę kolumny i ponownie odwirować w temperaturze 1 000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wylać płynny roztwór z probówki zbiorczej kolumny i przemyć probówkę pięcioma mililitrami buforu PBS z odwirowaniem, jak poprzednio wykazano, co najmniej pięć razy. Dodaj jeden mililitr PBS BSA do 50 mikrolitrów kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1 w 1,5 mililitrowej probówce i dokładnie wymieszaj.Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na trzy minuty, aby wchłonąć koraliki w kierunku jednej strony tuby. Wyrzucić supernatant z drugiej strony i powtórzyć trzykrotne płukanie PBS BSA. Aby wzbogacić biotynylowane białko, dodaj dwa mililitry próbek do kolumny.Po odwirowaniu kolumny w sile 1000 G przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodać jeden mililitr odsolonego ekstraktu białkowego do 50 mikrolitrów kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1. Dokładnie wymieszaj roztwór, umieszczając rurkę zawierającą kulki magnetyczne na rotatorze z normalną prędkością i temperaturą pokojową na 30 minut. Następnie umieść koraliki na stojaku magnetycznym na trzy minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy zbiorą się po jednej stronie tuby.Delikatnie usunąć supernatant i dodać jeden mililitr buforu do płukania. Obracaj rurkę przez dwie minuty na rotatorze i powtórz krok wykonany na stojaku magnetycznym, aby usunąć supernatant. Podobnie wykonaj mycie jednym mililitrem do płukania dwa i trzy, jak pokazano wcześniej.Następnie usuń detergent z do mycia, dodając 1,7 mililitra 50-milimolowego chlorowodorku tris i powtarzając krok wykonany na stojaku magnetycznym. Wykonać sześć dwuminutowych płukań każdym, używając jednego mililitra 50-milimolowego buforu wodorowęglanu amonu. Po zakończeniu dodaj 50 mikrolitrów ekstraktu białkowego zawierającego 50 milimolowy chlorowodorek tris, 12% sacharozy, 2% laurylosiarczanu litu i 1,5% ditiotreitolu do kulek i umieść probówkę w inkubatorze w temperaturze 100 stopni Celsjusza na pięć minut, aby wywołać szok cieplny.Po powtórzeniu kroku na stojaku magnetycznym, przechowuj supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy LCMS/MS. Analiza western blot wyekstrahowanych białek wykazała udaną ekspresję białek i biotynylację w infiltrowanych liściach ogórka. Wyższy poziom ekspresji znakowanych białek i dodatkowych prążków w porównaniu z grupą kontrolną potwierdził pomyślne znakowanie docelowych białek genu będącego przedmiotem zainteresowania przez AirID.Wyniki potwierdzono przy użyciu przeciwciał Anti-Flag i Anti-Mass, pokazując pasmo docelowe z przeciwciałem Anti-Flag we wszystkich przekształconych próbkach. Po wzbogaceniu biotynylowanych białek w kulki magnetyczne sprzężone ze streptawidyną C1 zaobserwowano wiele białek o różnych rozmiarach. Na podstawie wszystkich wyników stwierdzono, że AirID jest nowym i idealnym enzymem do analizy interakcji białko-białko w roślinach.Podczas eksperymentu z oznaczaniem zbliżeniowym należy pamiętać, że pięć mikromolowych biotyn i czas trwania HR są idealne. Protokół przedstawia krok po kroku konfigurację etykietowania zbliżeniowego opartego na AirID w roślinie, w tym przygotowanie próbki liści, usunięcie prebiotyny, ilościowe określenie białka ekstraktu i wzbogacenie biotynylowanych białek. Przewiduje się, że AirID poprawi dokładność biotynylacji niezależnej od PPI w połączeniu.Stwierdzono, że AirID idealnie nadaje się do analizy PPI w zakładach.

airid-based-proximity-labeling-for-protein-protein-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

W tym badaniu ustalamy szczegółowy protokół znakowania zbliżeniowego (PL) opartego na TurboID w jajniku D. melanogaster, obejmujący etapy od suplementacji biotyną i rozwarstwienia jajników do walidacji ekspresji transgenu i wzbogacenia biotynylowanych peptydów do spektrometrii mas.

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę etykietowania zbliżeniowego opartą na AirID do badania interakcji białko-białko w roślinach z użyciem ogórka Cucumis sativus. Protokół obejmuje agroinfiltrację, biotynowanie i oczyszczanie białek.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Przeglądaj więcej filmów