Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

AirID jest cennym enzymem do interakcji białko-białko i powoduje mniejszą toksyczność i mniej błędów w procesach zachodzących w czasie niż inne enzymy znakujące bliskość. Przedstawiono protokół krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentu znakowania zbliżeniowego na ogórku lub Cucumis sativus przy użyciu białka APRR2-AirID AT4G18020 jako modelu. Procedurę zademonstrują Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng i Min Zhang z mojego laboratorium.

Zacznij od przeniesienia nasion Cucumis sativus lub ogórka do wody, inkubacji w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut, a następnie umieszczenia nasion na bibule filtracyjnej na szalce Petriego na 12 do 16 godzin. Później przenieś nasiona do doniczek z ziemią i hoduj je w komorze klimatycznej w temperaturze 23 stopni Celsjusza w 16 godzinach światła i 18 godzin ciemności przez trzy do czterech tygodni. Przenieś 2,5 mikrolitra plazmidu EarleyGate 100 do właściwych komórek szczepu agrobacterium tumefaciens GV3101.

Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut, a następnie przenieść ją do ciekłego azotu na trzy minuty. Aby wywołać szok cieplny, przenieś probówkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie umieść probówkę na lodzie na dwie minuty.

Dodaj 1 000 mikrolitrów pożywki Luria Bertani lub LB do komórek agrobacterium poddanych szokowi cieplnemu. Po inkubacji komórek w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 118 obr./min przez godzinę, odwirować je w temperaturze 3000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant o pojemności 800 mikrolitrów i wymieszaj pozostały roztwór.

Umieść go na podłożu LB uzupełnionym 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i gentamycyny oraz 25 mikrogramami na mililitr ryfampicyny. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zbierz kilka kolonii bakterii z talerzy.

Umieść je w płynnym podłożu LB, uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami i inkubuj płynny LB w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 218 obr./min przez 36 do 48 godzin. Po dwóch minutach wirowania w temperaturze 3 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ponownie zawieś osad w buforze do agroinfiltracji, aby dostosować gęstość optyczną do jednej przy długości fali 600 nanometrów. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki bezigłowej naciekaj cały naskórek powierzchni abakcjalnej 1,5 mililitra zawieszonego inokulum agrobakteryjnego.

Utrzymuj rośliny w komorze klimatycznej w temperaturze 23 stopni Celsjusza przy świetle 75 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę przez 16 godzin w ciemności przez osiem godzin Po 36 godzinach naciekaj jeden mililitr z pięciu mikrogramów biotyny do już przefiltrowanych liści. Po czterech do 12 godzinach infiltracji biotyny odetnij liście i szybko przenieś je do ciekłego azotu, aby uniknąć degradacji białka. Zmiel liście za pomocą tłuczka i moździerza i szybko dodaj dwa mililitry PBS BSA o pH 7,4, a następnie powoli miel.

Przenieś mieszaninę próbek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów przez filtr z materiału filtracyjnego do szybkiej filtracji umieszczony na niej i utrzymuj probówkę na lodzie. Przenieś próbki do dwumililitrowej probówki. Dodaj 1% koktajl inhibitorów białka i wymieszaj zawartość, obracając probówkę w górę i w dół siedem do ośmiu razy przed odwirowaniem.

Po zakończeniu przenieś supernatant do nowej dwumililitrowej probówki i dodaj 10% beta-D-maltozydu. Umieść probówkę na lodzie na pięć minut, a następnie odwiruj w temperaturze 20 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zrównoważyć kolumnę odsalającą, zaznacz jedną stronę kolumny i odwiruj ją zaznaczoną stroną skierowaną na zewnątrz.

Zdjąć górną i dolną pokrywę kolumny i ponownie odwirować w temperaturze 1 000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wylać płynny roztwór z probówki zbiorczej kolumny i przemyć probówkę pięcioma mililitrami buforu PBS z odwirowaniem, jak poprzednio wykazano, co najmniej pięć razy. Dodaj jeden mililitr PBS BSA do 50 mikrolitrów kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1 w 1,5 mililitrowej probówce i dokładnie wymieszaj.

Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na trzy minuty, aby wchłonąć koraliki w kierunku jednej strony tuby. Wyrzucić supernatant z drugiej strony i powtórzyć trzykrotne płukanie PBS BSA. Aby wzbogacić biotynylowane białko, dodaj dwa mililitry próbek do kolumny.

Po odwirowaniu kolumny w sile 1000 G przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodać jeden mililitr odsolonego ekstraktu białkowego do 50 mikrolitrów kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną C1. Dokładnie wymieszaj roztwór, umieszczając rurkę zawierającą kulki magnetyczne na rotatorze z normalną prędkością i temperaturą pokojową na 30 minut. Następnie umieść koraliki na stojaku magnetycznym na trzy minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy zbiorą się po jednej stronie tuby.

Delikatnie usunąć supernatant i dodać jeden mililitr buforu do płukania. Obracaj rurkę przez dwie minuty na rotatorze i powtórz krok wykonany na stojaku magnetycznym, aby usunąć supernatant. Podobnie wykonaj mycie jednym mililitrem do płukania dwa i trzy, jak pokazano wcześniej.

Następnie usuń detergent z do mycia, dodając 1,7 mililitra 50-milimolowego chlorowodorku tris i powtarzając krok wykonany na stojaku magnetycznym. Wykonać sześć dwuminutowych płukań każdym, używając jednego mililitra 50-milimolowego buforu wodorowęglanu amonu. Po zakończeniu dodaj 50 mikrolitrów ekstraktu białkowego zawierającego 50 milimolowy chlorowodorek tris, 12% sacharozy, 2% laurylosiarczanu litu i 1,5% ditiotreitolu do kulek i umieść probówkę w inkubatorze w temperaturze 100 stopni Celsjusza na pięć minut, aby wywołać szok cieplny.

Po powtórzeniu kroku na stojaku magnetycznym, przechowuj supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy LCMS/MS. Analiza western blot wyekstrahowanych białek wykazała udaną ekspresję białek i biotynylację w infiltrowanych liściach ogórka. Wyższy poziom ekspresji znakowanych białek i dodatkowych prążków w porównaniu z grupą kontrolną potwierdził pomyślne znakowanie docelowych białek genu będącego przedmiotem zainteresowania przez AirID.

Wyniki potwierdzono przy użyciu przeciwciał Anti-Flag i Anti-Mass, pokazując pasmo docelowe z przeciwciałem Anti-Flag we wszystkich przekształconych próbkach. Po wzbogaceniu biotynylowanych białek w kulki magnetyczne sprzężone ze streptawidyną C1 zaobserwowano wiele białek o różnych rozmiarach. Na podstawie wszystkich wyników stwierdzono, że AirID jest nowym i idealnym enzymem do analizy interakcji białko-białko w roślinach.

Podczas eksperymentu z oznaczaniem zbliżeniowym należy pamiętać, że pięć mikromolowych biotyn i czas trwania HR są idealne. Protokół przedstawia krok po kroku konfigurację etykietowania zbliżeniowego opartego na AirID w roślinie, w tym przygotowanie próbki liści, usunięcie prebiotyny, ilościowe określenie białka ekstraktu i wzbogacenie biotynylowanych białek. Przewiduje się, że AirID poprawi dokładność biotynylacji niezależnej od PPI w połączeniu.

Stwierdzono, że AirID idealnie nadaje się do analizy PPI w zakładach.