Sterylizacja promieniowaniem gamma przy użyciu niskich dawek dla bezkomórkowych przeszczepów tchawicy

Protokół ten zapewnia pełny proces sterylizacji każdego niesterylnego narządu bez wpływu na jego charakterystykę. Głównym celem tej techniki jest możliwość sterylizacji narządu bez wpływu na jego właściwości. Chociaż technika ta skupiła się na tchawicy, wykazano, że niższe dawki promieniowania gamma mogą skutecznie sterylizować materiały biologiczne.

Osoba może stawić czoła problemowi, określając najniższą skuteczną dawkę dla różnych typów narządów. Następnie zaleca się rozpoczęcie od mniejszej dawki i zwiększanie ich aż do uzyskania sterylizacji. Zacznij od pokrojenia tchawicy wyciętej z poddanych eutanazji białych królików nowozelandzkich, czyli Oryctolagus cuniculus, na dwucentymetrowe kawałki.

Za pomocą nożyczek usuń otaczającą tkankę łączną i wewnętrzną warstwę błony śluzowej. Zanurz próbki w 12 mililitrach roztworu PBS zawierającego SDS, 5% penicyliny, streptomycyny i 5% amfoterycyny. Tchawice należy poddawać ciągłemu mieszaniu mieszadłem magnetycznym z prędkością 400 obr./min przez pięć tygodni w temperaturze pokojowej.

Co tydzień dawaj dwie godziny wstrząsu osmotycznego, zanurzając tchawice w wodzie destylowanej przed zmianą pożywki. Po pięciu tygodniach kriogenizuj próbki tchawicy za pomocą 12-mililitrowej mieszaniny 80% FBS i 20% DMSO w pojemniku do zamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po 13 do 15 dniach rozmrozić tchawice w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie umyj je PBS. Aby napromienić próbkę, należy umieścić cztery kawałki tchawicy w 20 mililitrach PBS w kolbach hodowlanych metakrylanu T25, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków. Przeprowadzić napromieniowanie za pomocą akceleratora liniowego z fotonami o energii nominalnej 10 megawoltów, spłaszczającymi wiązki bez filtra.

Zastosuj dawkę z szybkością 2 400 jednostek monitora na minutę i ustaw inne parametry zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po zakończeniu posadź próbkę w 30 mililitrach DMEM uzupełnionej 10% inaktywowanym FBS bez antybiotyków lub środków przeciwgrzybiczych. Inkubuj kulturę w standardowym inkubatorze tkankowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa tygodnie i sprawdzaj ją co 24 godziny pod kątem parametrów zanieczyszczenia, takich jak pH medium, kolor i zmiany zmętnienia.

Przeprowadzaj próby rozciągania na pulpicie trakcyjnym, uniwersalnej maszynie wytrzymałościowej lub kontroli przemieszczeń UTM, wyposażonej w czujniki siły i położenia oraz komputer ze specjalnie zaprojektowanym oprogramowaniem. Rejestruj dane co 0,4 sekundy i eksportuj je do arkusza kalkulacyjnego. Skonstruuj szczęki rozciągliwe dostosowane do średniego kalibru tchawicy królika z czystego jednowarstwowego, nietoksycznego kryształu polichlorku winylu lub pustych rurek z PVC.

Przewody należy podzielić na trzycentymetrowe segmenty. Aby wykonać szew końcowo-końcowy bez odchylenia, wywierć 12 wstępnie uformowanych otworów w odległości dwóch milimetrów od krawędzi szczęk, oddalonych od siebie o 2,5 milimetra. Następnie przymocuj rurki szklane z PVC do tchawicy królika za pomocą zespolenia terminowo-końcowego z ciągłym nylonowym szwem monofilamentowym 6-0 przez naprzemiennie wykonane pięciomilimetrowe otwory znajdujące się w odległości dwóch milimetrów od krawędzi tchawicy.

Rozciągnij wszystkie elementy z prędkością przemieszczenia 5,0 milimetrów na minutę. Następnie zapisz zmienne, takie jak maksymalne naprężenie i odkształcenie, energia zmagazynowana na jednostkę objętości tchawicy oraz moduł Younga. Wykonuj testy ściskania promieniowego na UTM z kompresją wyposażonym w ogniwo obciążnikowe o mocy 15 niutonów, aby uzyskać dane o sile, położeniu i czasie.

Rejestruj dane i eksportuj do arkuszy kalkulacyjnych w odstępach 0,5 sekundy. Umieść tchawicę tak, aby błoniasty obszar spoczywał na dolnej płytce przed stopniowym podnoszeniem się płytki w kierunku górnej płytki ze stałą prędkością pięciu milimetrów na minutę. Oblicz każdą zmienną na jednostkę długości próbki, sztywności i energii na jednostkę powierzchni potrzebnej do całkowitego zamknięcia tchawicy.

Umieść sterylny wewnątrzświetlny stent PVC o rozmiarze 14, zapewniając trzy- do czterech milimetrowych marginesów na każdym końcu. Przymocuj stent pojedynczym nylonowym ściegiem monofilamentowym 6-0 przez przestrzeń międzychrzęstną pierwszej chrząstki. W warunkach aseptycznych i przy użyciu sterylnego materiału należy wykonać podłużne trzycentymetrowe centralne nacięcie klatki piersiowej i pobrać obustronne uszypułowane płaty składające się z powięzi piersiowej i elementu mięśniowego.

Owiń tchawice z klapką w cztery króliki, po jednym tchawicy na każdym połowiku. Po zakończeniu operacji należy odwrócić znieczulenie, przerywając podawanie izofluranu. Spośród ośmiu fragmentów, które zostały wystawione na działanie promieniowania o natężeniu 0,5 kilograma, dwa wykazały zmianę koloru podłoża w ciągu jednego tygodnia.

Jednak żaden z kawałków, które zostały napromieniowane w ilości jednego lub dwóch kilogramów, nie wykazał żadnej zmiany koloru podłoża. W porównaniu z grupą kontrolną nie wykryto zmian w schemacie rozkładu kolagenu lub włókien elastycznych w analizowanych próbkach napromienianych różnymi dawkami promieniowania. Dane uzyskane w próbie rozciągania na napromienionych tchawicach przedstawiono tutaj.

Krzywe naprężeniowo-odkształceniowe dla tchawic pozbawionych komórek i napromieniowanych nie wykazały żadnych zmian w porównaniu z tchawicami niesterylizowanymi. Pokazano testy kompresji przeprowadzone na natywnych tchawicach lub kontrolach oraz tchawicy pozbawionych komórek, krioprezerwowanych i napromieniowanych. Odpowiednie wykresy wykazały, że napromienianie nie zmieniło procentu okluzji w porównaniu z natywną tchawicą.

Napromieniowanie gamma spowodowało klinicznie minimalny, ale statystycznie istotny spadek charakterystyki radiobiomechanicznej i zmiennej siły na jednostkę długości. W badaniu histologicznym stwierdzono obecność silnie zorganizowanej tkanki łącznej w postaci okołochrzęstnej rodzimej tchawicy. Chrząstka była nienaruszona i nie wykazywała oznak martwicy.

Podczas wszczepiania elementu radiologicznego żywej istocie, sterylność implantu i proces sterylny mają kluczowe znaczenie dla uniknięcia infekcji i odrzucenia tkanki. Istnieje szeroka gama narządów, które można wszczepić po wytworzeniu tkanki i powinny one być sterylne. Postępowanie zgodnie z tym procesem może doprowadzić do całkowitej sterylizacji bez wpływu na główne cechy narządu.