Name: Sterylizacja promieniowaniem gamma przy użyciu niskich dawek dla bezkomórkowych przeszczepów tchawicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj protokół sterylizacji przeszczepów tchawicy przy użyciu niskich dawek promieniowania gamma. Metoda zachowuje właściwości tkanek i może być zastosowana do innych narządów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten artykuł był wspierany przez Hiszpańskie Towarzystwo Chirurgii Klatki Piersiowej 2018 Grant na Narodowe Badanie Multiośrodkowe [Numer 180101 przyznany Néstorowi J.Martínezowi-Hernándezowi] i PI16-01315 [przyznany Manuelowi Mata-Roig] przez Instituto de Salud Carlos III. Projekt CIBERER jest finansowany przez VI Krajowy Plan Badań, Rozwoju i Innowacji na lata 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Program Consolider, CIBER Actions oraz Instituto de Salud Carlos III, przy wsparciu Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego.

Europejska dyrektywa 20170/63/UE dotycząca opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych została przestrzegana, a protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki Uniwersytetu w Walencji (Ustawa 86/609/EWG i 214/1997 oraz Kodeks 2018/VSC/PEA/0122 Typ 2 Rządu Walencji, Hiszpania).
1. Decelularyzacja tchawicy
UWAGA: Metoda decelularyzacji została zgłoszona gdzie indziej20.
<ol>
	<li>Eutanazja dorosłych białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus) o masie ciała 133 mg/kg pentobarbitalu sodu wynosi 133 mg/kg, przy użyciu wstrzyknięcia 200 mg/ml przez żyłę ucha brzeżnego.</li>
	<li>Zapewniając warunki aseptyki, należy wykonać centralną podłużną szyjkę macicy, wypreparować mięśnie szyjki macicy i zbliżyć się do tchawicy. Wypreparuj narząd obwodowo i podłużnie. Na koniec przeciąć pod pierwszym pierścieniem i tuż nad cariną.</li>
	<li>Za pomocą skalpela pokrój tchawice na 2 cm kawałki. Za pomocą nożyczek usuń otaczającą tkankę łączną i wewnętrzną warstwę błony śluzowej6.</li>
	<li>Zanurz próbki w 12 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającego 2% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 5% penicyliny-streptomycyny i 5% amfoterycyny B.</li>
	<li>Tchawice należy poddawać ciągłemu mieszaniu mieszadłem magnetycznym z prędkością 400 obr./min przez 5 tygodni w temperaturze pokojowej. Roztwór decelularyzacyjny należy wymieniać co tydzień po 2-godzinnym wstrząsie osmotycznym poprzez zanurzenie tchawicy w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Kriogeniczność próbek należy przeprowadzić przy użyciu 12 ml mieszaniny 80% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 20% dimetylosulfotlenku (DMSO) w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Gdy tchawice mają być zużyte (po 13-15 dniach), rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i umyć przez zanurzenie w PBS po zakończeniu rozmrażania.</li>
</ol>
2. Sterylizacja
<ol>
	<li>napromieniowanie
	<ol>
		<li>Umieścić partie czterech kawałków tchawicy o wymiarach 2 cm każda w 20 ml metakrylanu w kolbie hodowlanej T25 wypełnionej PBS, aż do osiągnięcia całkowitej objętości 30 ml. Należy uważać, aby nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków, które mogłyby spowodować dyfuzję energii na granicy faz powietrze-ciecz.</li>
		<li>Przewodzić napromieniowanie za pomocą akceleratora liniowego, fotonami o energii nominalnej 10 MV spłaszczających promieni wolnych od filtrów. Zastosować dawkę z szybkością 2400 jednostek monitora na minutę w izocentrum, umieszczając tchawice w odległości 100 cm od powierzchni źródła, która ma być napromieniowana, z głębokością ostrości 2,5 cm dla pola promieniowania 10 cm x 10 cm, tak aby pokryć cały pojemnik, co odpowiada dawce 24 Gy/min.</li>
		<li>Zwiększaj dawki z każdą czteroczęściową partią; cztery kawałki zostaną poddane działaniu 0,5 kGy, cztery do 1 kGy, cztery do 2 kG itd., aż do osiągnięcia sterylizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>kultura
	<ol>
		<li>Wprowadź kawałki do 30 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z inaktywowanym 10% FBS bez antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych.</li>
		<li>Hodować je w standardowym inkubatorze tkankowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 tygodnie i sprawdzać co 24 godziny 
		UWAGA: Parametrami zanieczyszczenia są zmiany pH pożywki hodowlanej, a tym samym zmiany koloru i zmętnienia pożywki. Tchawice zostały pobrane od wolnych od zarazków zajęczaków, które nie były chore, a zatem spodziewano się, że będą pozbawione bakterii beztlenowych w tchawicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza histologiczna
UWAGA: Zabarwić kawałki za pomocą hematoksyliny i eozyny21, trichromu Massona i orcein22.
<ol>
	<li>Barwienie DAPI
	<ol>
		<li>Określ żywotność tkanek za pomocą DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindolu). To niebiesko-fluorescencyjne barwienie silnie wiąże się z regionami bogatymi w adeninę i tyminę w sekwencjach DNA, a zatem umożliwia oglądanie DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
		<li>Osadź próbki tkanek w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).</li>
		<li>Przeciąć próbki za pomocą kriostatu.</li>
		<li>Próbkę przeznaczoną do barwienia przemyć trzykrotnie w wodzie destylowanej w celu usunięcia OCT. Umieścić w podłożu montażowym, które zawiera roztwór DAPI o stężeniu 30 nM.</li>
		<li>Wizualizacja fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza zawartości DNA
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela odciąć segmenty tchawicy o długości około 3 mm.</li>
		<li>Inkubować przez 2 godziny w proteinazie K (tabela materiałów).</li>
		<li>Wyodrębnij DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Za pomocą spektrofotometrii oznaczyć stężenie DNA, mierząc absorbancję w temperaturze 260/280 za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Zmierz wielkość wyekstrahowanych próbek DNA za pomocą chromatografii kapilarnej z bioanalizatorem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badanie biomechaniczne
UWAGA: Odporność tchawicy na siły wzdłużne i poprzeczne jest mierzona za pomocą testów rozciągania osiowego i promieniowego ściskania23.
<ol>
	<li>Pomiar tchawicy
	<ol>
		<li>Zmierz długość tchawicy, grubość ścianki i średnicę zewnętrzną za pomocą suwmiarki.</li>
		<li>Oblicz średnie wartości z trzech losowych pomiarów każdej ze zmiennych.</li>
		<li>W testach ściskania promieniowego należy obliczyć średnicę przednio-tylną, wykrywając punkt, w którym płytka styka się z próbką.</li>
		<li>Wszystkie testy należy wykonywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próby rozciągania
	<ol>
		<li>Przeprowadzić próby rozciągania na uniwersalnej maszynie wytrzymałościowej (UTM) do sterowania przemieszczeniem pulpitu trakcyjnego, wyposażonej w obciążenie 100 N (rozdzielczość siły 0,1 N, położenie 0,001 mm i 0,1 s). Maszyna wytrzymałościowa wyposażona jest w czujniki siły i położenia, a także jest podłączona do komputera z oprogramowaniem specjalnie zaprojektowanym przez producenta23.</li>
		<li>Rejestruj dane co 0,4 s i eksportuj do arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Skonstruowanie szczęk rozciągliwych dostosowanych do średniego kalibru tchawicy królika z czystych, nietoksycznych, krystalicznych rurek z polichlorku winylu (PVC) o średnicy zewnętrznej 1 cm i grubości ścianki 1,5 mm.</li>
		<li>Przewody należy podzielić na segmenty o długości 3 cm.</li>
		<li>Wywierć 12 wstępnie uformowanych otworów na szew końcowo-końcowy, 2 mm od krawędzi szczęk i oddalonych od siebie o 2,5 mm, aby zapobiec odchyleniu spowodowanemu szwami.</li>
		<li>Przymocuj rurki szklane z PVC do tchawicy królika za pomocą zespolenia terminowo-końcowego z ciągłym szwem przez naprzemiennie uformowane otwory (co 5 mm), w odległości 2 mm od krawędzi tchawicy i nylonowym szwem monofilamentowym 6-0.</li>
		<li>Rozciągnij wszystkie elementy z prędkością przemieszczenia 5,0 mm/min.</li>
		<li>Zapisz zmienne maksymalne naprężenie (σmax, w N/mm2) i odkształcenie (εmax, bez jednostek), wraz z energią zmagazynowaną na jednostkę objętości tchawicy (W/Vol, w mJ/mm) i modułem Younga (E, w MPa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próby ściskania promieniowego
	<ol>
		<li>Wykonaj testy ściskania promieniowego na biurkowym UTM kompresyjnym, wyposażonym w ogniwo obciążnikowe 15 N (rozdzielczość siły 0,001 N, pozycja 0,001 mm i czas 0,1 s), aby uzyskać dane dotyczące siły (N), pozycji (mm) i czasu (s). Rejestruj dane i eksportuj do arkusza kalkulacyjnego w odstępach 0,5 s.</li>
		<li>Umieść tchawice tak, aby błoniasty obszar spoczywał na dolnej płytce. Płyta stopniowo unosi się w kierunku płyty górnej ze stałą prędkością 5 mm/min.</li>
		<li>Oblicz każdą jednostkę na jednostkę długości próbki (f w N / mm), sztywność (R w Mpa·mm) i energię na jednostkę powierzchni (W / S w mJ / mm2) potrzebną do całkowitego zamknięcia tchawicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Technika chirurgiczna
UWAGA: Technika chirurgiczna była szeroko opisywana gdzie indziej20.
<ol>
	<li>Umieścić sterylny wewnątrzświetlny stent PVC o rozmiarze 14 Fr (który pozwala mu swobodnie przesuwać się bez ściskania ścianek), z marginesem 3-4 mm na każdym końcu.</li>
	<li>Przymocuj stent pojedynczym nylonowym ściegiem monofilamentowym 6-0 przez przestrzeń międzychrzęstną pierwszej chrząstki.</li>
	<li>Przystąp do znieczulenia królików.
	<ol>
		<li>Wstępne medykowanie pacjentów (3,65-4,05 kg samców białych królików nowozelandzkich) za pomocą domięśniowych leków przeciwbólowych (35 mg / kg ketaminy) ze środkiem uspokajającym, zwiotczającym mięśnie i przeciwbólowym (2,5 mg / kg ksylazyny).</li>
		<li>Ogol strefę nacięcia ze strefy operacyjnej i oczyść obszar chirurgiczny, aby usunąć włosy.</li>
		<li>Podawać leki przeciwbólowe i profilaktykę antybiotykową: 0,05 mg/kg domięśniowo buprenorfinę i 10 mg/kg enrofloksacynę.</li>
		<li>Umieść cewnik żylny w żyle brzeżnej ucha każdego królika.</li>
		<li>Znieczulenie indukcyjne za pomocą dożylnego podania w bolusie 10 mg/kg propofolu.</li>
		<li>Monitoruj parametry życiowe zwierzęcia za pomocą trójodprowadzeniowego elektrokardiogramu, pulsoksymetrii i nieinwazyjnego pomiaru ciśnienia. Co 30 minut nakładaj serum fizjologiczne na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.</li>
		<li>Sprawdź płaszczyznę znieczulenia za pomocą metody szczypania palców u stóp.</li>
		<li>Utrzymuj znieczulenie wziewnym izofluranem na poziomie 1,5%-2% minimalnego stężenia pęcherzykowego bez utraty spontanicznej wentylacji i zapewnij królikowi wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdezynfekuj strefę nacięcia kilka razy okrężnymi ruchami za pomocą peelingu na bazie jodu. W warunkach aseptycznych, przez cały czas i przy użyciu sterylnego materiału, należy wykonać podłużne 3 cm centralne nacięcie klatki piersiowej i zebrać obustronne uszypułowane płaty składające się z powięzi piersiowej i elementu mięśniowego.</li>
	<li>Owiń tchawice z klapką w cztery króliki, po jednym na każdym półprzewodniku (w sumie osiem tchawic).</li>
	<li>Po zakończeniu operacji należy odwrócić znieczulenie, przerywając podawanie izofluranu.</li>
	<li>Okres pooperacyjny
	<ol>
		<li>Trzymaj zwierzęta na sali operacyjnej do czasu, aż całkowicie wyzdrowieją ze znieczulenia. Kiedy całkowicie wyzdrowieją, przywróć je do środowiska z innymi królikami.</li>
		<li>Króliki należy leczyć antybiotykami (0,5 ml/kg 2,5% enrofloksacyny) i lekami przeciwbólowymi (5 mg/ml meloksykamu; 0,05 ml/kg metacamu) co 24 godziny przez 5 dni.</li>
		<li>Pozostaw implanty in situ na żądany czas.</li>
		<li>Przed eutanazją należy poddać króliki premedykacji domięśniowymi lekami przeciwbólowymi (35 mg/kg ketaminy) oraz środkiem uspokajającym, zwiotczającym mięśnie i przeciwbólowym (2,5 mg/kg ksylazyny). Następnie poddać króliki eutanazji 133 mg/kg pentobarbitalu sodu za pomocą wstrzyknięcia 200 mg/ml przez żyłę brzeżną ucha i pobrać tchawicę.</li>
		<li>Wykonaj badania biomechaniczne i histologiczne tchawicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Dostosuj wszystkie modele metodą Bayesa w oprogramowaniu R, wersja 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).</li>
	<li>Przeanalizuj zmienne badania, z wyjątkiem f i R, przy użyciu wielu modeli regresji liniowej.</li>
	<li>W przypadku zmiennych f i R zastosuj mieszane modele regresji liniowej. W tych modelach, oprócz interesujących zmiennych związanych z leczeniem i stanem każdej tchawicy, wprowadź procent okluzji jako efekt monotoniczny i niezależny termin na tchawicę jako czynnik losowy.</li>
</ol>

<ol><li>Ch'ng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+%28Crico%29trachea+for+malignancy+in+the+virgin+and+irradiated+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).</li>
<li>Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+feasibility+of+gamma+radiation+sterilization+for+decellularized+tracheal+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts.</a> Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).</li>
<li>de Donato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthesis+infection%3A+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prosthesis infection: prevention and treatment.</a> The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).</li>
<li>Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+safety+sterilization+and+tissue+banking+issues+for+soft+tissue+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts.</a> Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).</li>
<li>Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+of+experience+with+the+rabbit+model%2C+a+versatile+model+for+tracheal+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Aesthetic+Research%22%5BJournal%5D)">Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research.</a> Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).</li>
<li>Hysi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+orthotopic+transplantation+of+short+tracheal+segments+without+immunosuppressive+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy.</a> European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).</li>
<li>Wurtz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+with+a+composite+graft%3A+Fascial+flap-wrapped+allogenic+aorta+with+external+cartilage-ring+support%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+Cardiovascular+and+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).</li>
<li>White, A., Burns, D., Christensen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+terminal+sterilization+using+supercritical+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide.</a> Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).</li>
<li>Qiu, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+bacterial+spores+and+viruses+in+biological+material+using+supercritical+carbon+dioxide+with+sterilant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).</li>
<li>Lange, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+a+novel+vacuum-assisted+method+for+decellularization+of+tracheae+for+clinical+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).</li>
<li>Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+sterilization+in+microbiological+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories.</a> Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).</li>
<li>Hennessy, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+carbon+dioxide-based+sterilization+of+decellularized+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22JACC.+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves.</a> JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+lung+matrices+by+supercritical+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).</li>
<li>AENOR. UNE-EN. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISO+11737-1%3A2006.+Esterilizaci%C3%B3n+de+productos+sanitarios.+M%C3%A9todos+biol%C3%B3gicos.+Parte+1%3A+Determinaci%C3%B3n+de+la+poblaci%C3%B3n+de+microorganismos+en+los+productos%5BTitle%5D)+AND+%22AENOR.+UNE-EN%22%5BJournal%5D)">ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos.</a> AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).</li>
<li>Uriarte, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+acellular+mouse+lungs+after+sterilization+by+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).</li>
<li>Sun, W. Q., Leung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+study+of+extracellular+tissue+matrix+degradation+and+instability+after+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation.</a> Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).</li>
<li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+radiation+sterilization+dose+improves+mechanical+and+biological+quality+while+retaining+sterility+assurance+levels+of+bone+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts.</a> Bone. 57 (1), 194-200 (2013).</li>
<li>Helder, M. R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+gamma+irradiation+of+decellularized+heart+valves+results+in+tissue+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).</li>
<li>Martínez-Hernández, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tracheal+prelamination+implant%3A+A+proposed+bilateral+double+organ+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique.</a> Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coloraciones+para+fibras+col%C3%A1genas+y+el%C3%A1sticas+del+tejido+conjuntivo.+Coloraciones+para+sustancia+amiloidea%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratorio+de+Anatom%C3%ADa+Patologica%22%5BJournal%5D)">Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea.</a> Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).</li>
<li>Martínez-Hernández, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardised+approach+to+the+biomechanical+evaluation+of+tracheal+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts.</a> Biomolecules. 11 (10), 1461(2021).</li>
<li>Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+decellularization+and+sterilization+protocol+for+preparing+a+tissue+scaffold+of+a+human-sized+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).</li>
<li>Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sterile+amniotic+membrane+tissue+graft+using+supercritical+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+stem+cells+seeded+into+decellularized+rat+kidney+scaffolds+endothelialize+and+remodel+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes.</a> Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów.

Istnieje kilka strategii sterylizacji. Nadkrytyczny CO2w pełni przenika do tkanek, zakwaszając podłoże i dekonstrukcję dwuwarstwy fosfolipidowej z prostą eliminacją za pomocą obniżenia ciśnienia implantu 8,14,25. Zastosowano również promieniowanie ultrafioletowe, a jego skuteczność w tchawicy gryzoni została opublikowana, chociaż w literaturze jest tylko kilka doniesień10. Inne stosowane metody...

Sterylizacja implantu jest podstawowym warunkiem jego żywotności; w rzeczywistości protezy, które okazały się skuteczne, to te wszczepione w sterylne obszary (naczynia krwionośne, serce, kości, itp.)1. Tchawica ma dwie powierzchnie: powierzchnię stykającą się ze środowiskiem zewnętrznym, która nie jest sterylna, oraz powierzchnię skierowaną w stronę śródpiersia, która jest sterylna. Dlatego od momentu ekstrakcji tchawicy nie jest to narząd sterylny. Pomimo tego, że późniejszy proces decelularyzacji odbywa się w maksymalnie sterylnych warunkach, nie jest to etap sterylizacji2. Implantacja obcego materiału sama w sobie pociąga za sobą ryzyko infekcji ze względu na wytwarzane przez niego mikrośrodowisko probakteryjne3i do 0,014% ryzyko przeniesienia choroby z dawcy na biorcę, nawet jeśli materiał został wysterylizowany4. Aby zapewnić prawidłowe unaczynienie tchawicy, w prawie wszystkich eksperymentalnych protokołach transplantacji najpierw przechodzi ona implant heterotopowy5,6,7 do sterylnego obszaru (mięśnia, powięzi, sieci komórkowej, podskórnie itp.); Dzieje się tak dlatego, że wszczepienie niesterylnego elementu do tego podłoża doprowadziłoby do zakażenia obszaru3.
Istnieje szereg możliwych strategii uzyskania sterylnego implantu. Użycie nadkrytycznego CO2osiągnęło końcową sterylizację8,9. Inne metody, takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub leczenie substancjami takimi jak kwas nadoctowy, etanol, nadtlenek tlenu i elektrolizowana woda, uzyskały różne wskaźniki sukcesu w sterylizacji, prawie zawsze w zależności od ich dawek, ale wykazano, że wpływają one na właściwości biomechaniczne implantów. Rzeczywiście, niektóre substancje, takie jak tlenek etylenu, mogą znacznie zmienić strukturę wszczepionej matrycy, a nawet mogą powodować niepożądane efekty immunogenne. Z tego powodu wielu z tych strategii nie można zastosować do modeli biologicznych2,10,11,12,13.
Najbardziej rozpowszechnioną i akceptowaną strategią sterylizacji jest ta ustanowiona przez normę ISO 11737-1:2006 dotyczącą sterylizacji urządzeń medycznych wszczepionych ludziom, z dawką promieniowania gamma 25 kGy. Jednak ta regulacja skupia się tylko na sterylizacji obojętnych, niebiologicznych pierwiastków14,15. Dodatkowo, dawki radioterapii w radykalnym leczeniu raka są o trzy rzędy wielkości niższe niż te stosowane do sterylizacji wyrobów medycznych1. Mając to na uwadze, możemy stwierdzić, że wspomniana dawka nie tylko zabiłaby mikrobiotę, ale także zniszczyłaby i radykalnie zmieniła strukturę biologiczną implantu. Istnieje również możliwość, że po degradacji wygeneruje resztkowe lipidy, które mogą być potencjalnie cytotoksyczne i przyspieszyć enzymatyczną degradację rusztowania13,14,15,16,17, nawet przy użyciu dawek tak niskich jak 1,9 kGy i z uszkodzeniami wprost proporcjonalnymi do otrzymanej dawki promieniowania17.
Tak więc, celem tego artykułu jest próba zidentyfikowania dawki promieniowania, która pozwala na uzyskanie sterylnego implantu przy minimalnych szkodliwych skutkach spowodowanych napromieniowaniem2,18,19. Zastosowana przez nas strategia polegała na napromienianiu tchawic pozbawionych komórek i napromienianych dawkami o różnej eskalacji w zakresie kilogrejów (0,5, 1, 2, 3 kGy itd.), aż do uzyskania ujemnego posiewu. Przeprowadzono dodatkowe testy dla tych dawek, które osiągnęły ujemne posiewy, w celu potwierdzenia sterylizacji. Po ustaleniu minimalnej dawki potrzebnej do uzyskania sterylizacji sprawdzono strukturalny i biomechaniczny wpływ napromieniowania na tchawicę. Wszystkie wskaźniki porównano z kontrolną natywną tchawicą królika. Sterylizacja konstruktu została następnie przetestowana in vivo poprzez wszczepienie tchawicy białym królikom nowozelandzkim.

<table><tbody><tr><td>6-0 Nylonowy szew monofilamentowy&nbsp;</td><td>Monomiękki. Covidien; Mansfield, MA, Stany Zjednoczone</td><td>SN-5698G</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B 5%</td> <td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachusetts Stany Zjednoczone</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent, Santa Clara, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfiny</td><td>Buprex. Reckitt Benckiser Opieka zdrowotna; Hull, Reino Unido</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>Pulpit kompresyjny UTM</td><td>Microtest, Madryt, Hiszpania</td><td>EM1/10/FR</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania</td><td>CM3059</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, Stany Zjednoczone</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy; Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>Zestaw do</td> ekstrakcji DNA 11965084 <td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNeasy Quiagen, Hilden, Niemcy</td><td>4368814</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enrofloksacyna, 2,5%</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Niemcy</td><td>0035-0002</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>GE Healthcare Hyclon; Madryt, Hiszpania</td><td>SH20898.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Niemcy)</td><td>DM2500??</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania&nbsp;</td><td>Panie Mroźny. Rybak termiczny; Madryt, Hiszpania</td><td>&nbsp; 5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Izofluoran</td><td>Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Hiszpania&nbsp;</td><td>8.43603E+12</td><td></td></tr><tr><td>Imlangen ketaminy</td><td>. Merial; Tuluza, Francja</td><td>BOE127823</td><td></td></tr><tr><td>Akcelerator liniowy&nbsp;</td><td>"Prawdziwa wiązka". Varian, Palo Alto, Kalifornia, USA</td><td>H191001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Wytrząsarka orbitalna PSU-10i. Biosan; Ryga, Letonia</td><td>BS-010144-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Meloksykam 5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Niemcy</td><td>6283-MV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA Stany</td><td>Zjednoczone 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Dolethal. Wetochinol; Madryt, Espa&ntilde; </td><td>3.60587E+12</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich; MO, Stany Zjednoczone</td><td>P2272</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania</td><td>G 151030</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, Stany Zjednoczone</td><td>S3020</td><td></td></tr><tr><td>Rury drążone z PVC</td><td>Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Włochy</td><td>hhdddyyZ</td><td></td></tr><tr><td>stent PVC&nbsp;</td><td>ArgyleTM Medtronic; Stambuł, Turcja</td><td>019 5305 1</td><td></td></tr><tr><td>R oprogramowanie, wersja 3.5.3 R Core</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>R 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarcan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, USA</td><td>8,17,034</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Nanodrop, Life Technologies; Isogen Nauki przyrodnicze. Utrech, Holandia</td> Arkusz kalkulacyjny <td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microsoft Excel dla komputerów Mac, wersja 16.23, Redmond, WA, USA</td><td>2864993241</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna maszyna testująca trakcję&nbsp;</td><td>Maszyny testujące, Veenendaal, Holandia</td><td>84-01</td><td></td></tr><tr><td>UTM Software</td><td>TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA&nbsp;</td><td>100-093-627 F</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Średni montażowy&nbsp;</td><td>Laboratoria wektorowe, Burlingame; CA; USA</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Xilagesic. Calier; Barcelona, Hiszpania&ntilde; Nr kat</td>. <td>20102-003</td><td></td></tr></tbody></table>

sterylizacja promieniowaniem gamma przy użyciu niskich dawek dla bezkomórkowych przeszczepów tchawicy

Low-Dose Gamma Radiation Sterilization for Decellularized Tracheal Grafts

Jednym z głównych kluczowych aspektów zapewniających prawidłowy przebieg przeszczepu jest sterylność podłoża. Bezkomórkowy przeszczep tchawicy polega na wszczepieniu narządu, który pierwotnie miał kontakt z otoczeniem, a więc nie był od początku sterylny. Chociaż protokół decelularyzacji (poprzez ekspozycję detergentu [2% dodecylosiarczan sodu], ciągłe mieszanie i wstrząsy osmotyczne) jest przeprowadzany zgodnie ze środkami aseptycznymi, nie zapewnia sterylizacji. Dlatego jednym z głównych wyzwań jest zapewnienie sterylności przed implantacją in vivo. Chociaż istnieją ustalone protokoły sterylizacji promieniowaniem gamma dla materiałów nieorganicznych, nie ma takich środków dla materiałów organicznych. Ponadto obowiązujące protokoły dla materiałów nieorganicznych nie mogą być stosowane do materiałów organicznych, ponieważ ustalona dawka promieniowania (25 kGy) całkowicie zniszczyłaby implant. W niniejszej pracy badany jest wpływ zwiększonej dawki promieniowania na pozbawioną komórek tchawicy królika. Utrzymywaliśmy zakres dawek (kGy) i testowaliśmy dawki eskalowane, aż do znalezienia minimalnej dawki, przy której uzyskuje się sterylizację. Po ustaleniu dawki badaliśmy jej wpływ na narząd, zarówno histologicznie, jak i biomechanicznie. Ustaliliśmy, że podczas gdy 0,5 kGy nie osiągało sterylności, dawki zarówno 1 kGy, jak i 2 kGy osiągały go, przy czym 1 kGy jest zatem minimalną dawką niezbędną do osiągnięcia sterylizacji. Badania mikroskopowe nie wykazały istotnych zmian w porównaniu z narządami niesterylizowanymi. Osiowe charakterystyki biomechaniczne nie uległy żadnej zmianie i zaobserwowano jedynie niewielkie zmniejszenie siły na jednostkę długości, którą narząd może promieniowo tolerować. Możemy zatem stwierdzić, że 1 kGy osiąga całkowitą sterylizację pozbawionej komórek tchawicy królika przy minimalnym, jeśli w ogóle, wpływie na narząd.

Decelularyzacja 
Barwienie DAPI wykazuje brak DNA, a w żadnej z tchawic nie wykryto wartości DNA wyższych niż 50 ng za pomocą elektroforezy, przy czym wszystkie fragmenty były mniejsze niż 200 bp20.
Hodowla mikrobiologiczna 
Dwa z ośmiu fragmentów poddanych dawce 0.5 kGy wykazały zmianę barwy w czasie krótszym niż 1 tydzień. Żaden z fragmentów naświetlonych dawkami 1 kGy i 2 kGy nie wykazał żadnej zmiany barwy (<strong class="xfig...

Uzyskanie sterylizacji jest niezbędne do przeszczepu tkanki tchawicy. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół sterylizacji z wykorzystaniem niskodawkowego promieniowania gamma, które jest w pełni tolerowane przez narządy.

Sterylizacja promieniowaniem gamma przy użyciu niskich dawek dla bezkomórkowych przeszczepów tchawicy

One of the main key aspects in ensuring that a transplant evolves correctly is the sterility of the medium. Decellularized tracheal transplantation ...

Protokół ten zapewnia pełny proces sterylizacji każdego niesterylnego narządu bez wpływu na jego charakterystykę. Głównym celem tej techniki jest możliwość sterylizacji narządu bez wpływu na jego właściwości. Chociaż technika ta skupiła się na tchawicy, wykazano, że niższe dawki promieniowania gamma mogą skutecznie sterylizować materiały biologiczne.Osoba może stawić czoła problemowi, określając najniższą skuteczną dawkę dla różnych typów narządów. Następnie zaleca się rozpoczęcie od mniejszej dawki i zwiększanie ich aż do uzyskania sterylizacji. Zacznij od pokrojenia tchawicy wyciętej z poddanych eutanazji białych królików nowozelandzkich, czyli Oryctolagus cuniculus, na dwucentymetrowe kawałki.Za pomocą nożyczek usuń otaczającą tkankę łączną i wewnętrzną warstwę błony śluzowej. Zanurz próbki w 12 mililitrach roztworu PBS zawierającego SDS, 5% penicyliny, streptomycyny i 5% amfoterycyny. Tchawice należy poddawać ciągłemu mieszaniu mieszadłem magnetycznym z prędkością 400 obr./min przez pięć tygodni w temperaturze pokojowej.Co tydzień dawaj dwie godziny wstrząsu osmotycznego, zanurzając tchawice w wodzie destylowanej przed zmianą pożywki. Po pięciu tygodniach kriogenizuj próbki tchawicy za pomocą 12-mililitrowej mieszaniny 80% FBS i 20% DMSO w pojemniku do zamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po 13 do 15 dniach rozmrozić tchawice w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie umyj je PBS. Aby napromienić próbkę, należy umieścić cztery kawałki tchawicy w 20 mililitrach PBS w kolbach hodowlanych metakrylanu T25, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków. Przeprowadzić napromieniowanie za pomocą akceleratora liniowego z fotonami o energii nominalnej 10 megawoltów, spłaszczającymi wiązki bez filtra.Zastosuj dawkę z szybkością 2 400 jednostek monitora na minutę i ustaw inne parametry zgodnie z opisem w manuskrypcie. Po zakończeniu posadź próbkę w 30 mililitrach DMEM uzupełnionej 10% inaktywowanym FBS bez antybiotyków lub środków przeciwgrzybiczych. Inkubuj kulturę w standardowym inkubatorze tkankowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa tygodnie i sprawdzaj ją co 24 godziny pod kątem parametrów zanieczyszczenia, takich jak pH medium, kolor i zmiany zmętnienia.Przeprowadzaj próby rozciągania na pulpicie trakcyjnym, uniwersalnej maszynie wytrzymałościowej lub kontroli przemieszczeń UTM, wyposażonej w czujniki siły i położenia oraz komputer ze specjalnie zaprojektowanym oprogramowaniem. Rejestruj dane co 0,4 sekundy i eksportuj je do arkusza kalkulacyjnego. Skonstruuj szczęki rozciągliwe dostosowane do średniego kalibru tchawicy królika z czystego jednowarstwowego, nietoksycznego kryształu polichlorku winylu lub pustych rurek z PVC.Przewody należy podzielić na trzycentymetrowe segmenty. Aby wykonać szew końcowo-końcowy bez odchylenia, wywierć 12 wstępnie uformowanych otworów w odległości dwóch milimetrów od krawędzi szczęk, oddalonych od siebie o 2,5 milimetra. Następnie przymocuj rurki szklane z PVC do tchawicy królika za pomocą zespolenia terminowo-końcowego z ciągłym nylonowym szwem monofilamentowym 6-0 przez naprzemiennie wykonane pięciomilimetrowe otwory znajdujące się w odległości dwóch milimetrów od krawędzi tchawicy.Rozciągnij wszystkie elementy z prędkością przemieszczenia 5,0 milimetrów na minutę. Następnie zapisz zmienne, takie jak maksymalne naprężenie i odkształcenie, energia zmagazynowana na jednostkę objętości tchawicy oraz moduł Younga. Wykonuj testy ściskania promieniowego na UTM z kompresją wyposażonym w ogniwo obciążnikowe o mocy 15 niutonów, aby uzyskać dane o sile, położeniu i czasie.Rejestruj dane i eksportuj do arkuszy kalkulacyjnych w odstępach 0,5 sekundy. Umieść tchawicę tak, aby błoniasty obszar spoczywał na dolnej płytce przed stopniowym podnoszeniem się płytki w kierunku górnej płytki ze stałą prędkością pięciu milimetrów na minutę. Oblicz każdą zmienną na jednostkę długości próbki, sztywności i energii na jednostkę powierzchni potrzebnej do całkowitego zamknięcia tchawicy.Umieść sterylny wewnątrzświetlny stent PVC o rozmiarze 14, zapewniając trzy- do czterech milimetrowych marginesów na każdym końcu. Przymocuj stent pojedynczym nylonowym ściegiem monofilamentowym 6-0 przez przestrzeń międzychrzęstną pierwszej chrząstki. W warunkach aseptycznych i przy użyciu sterylnego materiału należy wykonać podłużne trzycentymetrowe centralne nacięcie klatki piersiowej i pobrać obustronne uszypułowane płaty składające się z powięzi piersiowej i elementu mięśniowego.Owiń tchawice z klapką w cztery króliki, po jednym tchawicy na każdym połowiku. Po zakończeniu operacji należy odwrócić znieczulenie, przerywając podawanie izofluranu. Spośród ośmiu fragmentów, które zostały wystawione na działanie promieniowania o natężeniu 0,5 kilograma, dwa wykazały zmianę koloru podłoża w ciągu jednego tygodnia.Jednak żaden z kawałków, które zostały napromieniowane w ilości jednego lub dwóch kilogramów, nie wykazał żadnej zmiany koloru podłoża. W porównaniu z grupą kontrolną nie wykryto zmian w schemacie rozkładu kolagenu lub włókien elastycznych w analizowanych próbkach napromienianych różnymi dawkami promieniowania. Dane uzyskane w próbie rozciągania na napromienionych tchawicach przedstawiono tutaj.Krzywe naprężeniowo-odkształceniowe dla tchawic pozbawionych komórek i napromieniowanych nie wykazały żadnych zmian w porównaniu z tchawicami niesterylizowanymi. Pokazano testy kompresji przeprowadzone na natywnych tchawicach lub kontrolach oraz tchawicy pozbawionych komórek, krioprezerwowanych i napromieniowanych. Odpowiednie wykresy wykazały, że napromienianie nie zmieniło procentu okluzji w porównaniu z natywną tchawicą.Napromieniowanie gamma spowodowało klinicznie minimalny, ale statystycznie istotny spadek charakterystyki radiobiomechanicznej i zmiennej siły na jednostkę długości. W badaniu histologicznym stwierdzono obecność silnie zorganizowanej tkanki łącznej w postaci okołochrzęstnej rodzimej tchawicy. Chrząstka była nienaruszona i nie wykazywała oznak martwicy.Podczas wszczepiania elementu radiologicznego żywej istocie, sterylność implantu i proces sterylny mają kluczowe znaczenie dla uniknięcia infekcji i odrzucenia tkanki. Istnieje szeroka gama narządów, które można wszczepić po wytworzeniu tkanki i powinny one być sterylne. Postępowanie zgodnie z tym procesem może doprowadzić do całkowitej sterylizacji bez wpływu na główne cechy narządu.

low-dose-gamma-radiation-sterilization-for-decellularized-tracheal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Stale dokonuje się znaczących przełomów w identyfikacji komórek macierzystych. Aby jednak przełożyć te odkrycia na praktykę, konieczne jest opracowanie nowych metod dostarczania komórek. W niniejszej pracy wykazuję, że drogi oddechowe stanowią bezpieczną drogę transplantacji komórek macierzystych do płuc.

Tracheotomia: Metoda transplantacji komórek macierzystych do płuc

Ten film demonstruje metodę wytwarzania decelularnych rusztowań z matrycy zewnątrzkomórkowej lub ECM poprzez zastosowanie perfuzji detergentów przez układ krwionośny. Strukturalne rusztowania ECM mogą być następnie wykorzystane do analizy przebudowy ECM związanej z chorobą krążeniowo-oddechową.

Decelularyzacja kompleksu krążeniowo-oddechowego: technika decelularyzacji serca i płuc na podstawie modelu mysiego

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Zwężenie przeszczepu stanowi krytyczną przeszkodę w wymianie dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej. Aby zbadać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw zwężenia, wykorzystujemy mysi model wymiany tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej z wysiewanymi komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego (BM-MNC). Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół, w tym produkcję rusztowań, izolację BM-MNC, siew przeszczepu i implantację.

Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Zwężenie krtani i tchawicy wynika z patologicznego osadzania się blizn, które krytycznie zwężają drogi oddechowe tchawicy i nie mają skutecznych terapii medycznych. Stosując stent PLLA-PCL (70% poli-L-laktydu i 30% polikaprolaktonu) jako miejscowy system dostarczania leków, można badać potencjalne terapie mające na celu zmniejszenie proliferacji blizn w tchawicy.

Projekt biokompatybilnego stentu tchawicy uwalniającego leki u myszy ze zwężeniem krtani i tchawicy

Ten protokół wprowadza metodę tworzenia rusztowania przy użyciu pozbawionych komórek nerek szczurów. Protokół obejmuje procesy decelularyzacji i recelularyzacji w celu potwierdzenia biodostępności. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu Triton X-100 i dodecylosiarczanu sodu.

Przygotowanie bezkomórkowych rusztowań nerkowych u szczurów

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Model mysiego przeszczepu wewnątrzpłucnego tchawicy (IPTT) jest cenny do badania choroby zarostowej dróg oddechowych (OAD) po przeszczepie płuc. Oferuje wgląd w specyficzne dla płuc zachowania immunologiczne i angiogenne w znoszeniu dróg oddechowych po allotransplantacji z wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu opisujemy procedurę IPTT i jej oczekiwane efekty.

Mysi przeszczep wewnątrzpłucnej tchawicy: model do badania choroby zarostowej dróg oddechowych po przeszczepie płuc

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Poznaj protokół sterylizacji przeszczepów tchawicy przy użyciu niskich dawek promieniowania gamma. Metoda zachowuje właściwości tkanek i może być zastosowana do innych narządów.

Sterylizacja promieniowaniem gamma przy użyciu niskich dawek dla bezkomórkowych przeszczepów tchawicy

Przeglądaj więcej filmów