Name: Elastyczna komora do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią wymuszonego rozpraszania Ramana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj elastyczną komorę do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią SRS. Technika umożliwia obserwację dynamiki kropel lipidowych w komórkach SKOV3 przez 24 godziny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować Starszemu Zespołowi Projektowemu 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza i James Walsh) na Uniwersytecie Binghamton za zaprojektowanie, wykonanie i przetestowanie obudowy mikroskopu. Dziękujemy Scottowi Hancockowi, Oldze Petrovej i Fabioli Moreno Olivas z Uniwersytetu Binghamton za pomocne dyskusje. Badania te były wspierane przez National Institutes of Health w ramach nagrody numer R15GM140444.

1. Zbuduj obudowę środowiskową mikroskopu
UWAGA: Ta duża obudowa środowiskowa mikroskopu służy do kontrolowania temperatury korpusu mikroskopu i środowiska obrazowania, które ma być ustabilizowane na poziomie 37 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
<ol>
	<li>Zaznacz położenie nóżek ramy mikroskopu SRS i stolika z napędem za pomocą markera na stole optycznym. Zamontuj dwie membrany tęczówki przed skanerem galwanometrycznym mikroskopu i dostosuj tak, aby pompa i wiązki laserowe Stokesa przechodziły przez środek przysłon irysowej.</li>
	<li>Zdejmij ramkę mikroskopu i stolik ze stołu optycznego.</li>
	<li>Połóż arkusz gumy silikonowej (rozmiar: 31 x 29 cali, grubość: 1/8 cala) na stole optycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Przetnij gumę silikonową wzdłuż śladów za pomocą noża, usuń małe kawałki gumy i umieść kwadratowe arkusze ceramiczne MICA (rozmiar: 6 x 6 cali, grubość: 1/4 cala) w tych samych miejscach. 
	UWAGA: Ceramika MICA jest materiałem łatwym w obróbce15. Jest twardy jak aluminium, ale jest doskonałym izolatorem termicznym. Arkusze ceramiczne MICA zostały użyte do zatrzymania przenoszenia ciepła z metalowej ramy mikroskopu i stolika do stołu optycznego ze stali nierdzewnej. W arkuszach MICA należy wywiercić kilka otworów przelotowych, aby umożliwić użycie 1/4-20 do montażu nóżek ramy i sceny.</li>
	<li>Przesuń ramę mikroskopu i stolik z powrotem na stół optyczny i ostrożnie wyrównaj nóżki na arkuszach ceramicznych MICA wzdłuż linii znaczników. Użyj 1/4-20, aby zamontować ramę i stolik na stole.</li>
	<li>Wyrównaj ścieżkę optyczną SRS. Wyreguluj mocowania lusterek Lustro 1 i Lustro 2 tak, aby wiązka lasera przechodziła przez środek dwóch wstępnie zamontowanych przysłon Iris (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Szczegóły techniczne laboratoryjnego mikroskopu SRS używanego do obecnych prac nad obrazowaniem żywych komórek są opisane wcześniej16. Szerokość impulsu pompy i belek Stokesa wynosi ~3-4 ps z dyspersją pręta szklanego. Sterowanie systemem odbywa się za pomocą oprogramowania ScanImage17.</li>
	<li>Na tym fundamencie izolacji termicznej zmontuj obudowę środowiskową, aby pokryć całą ramę mikroskopu za pomocą pięciu kawałków dużych arkuszy poliwęglanu (rozmiar: 31 x 29 x 28 cali, grubość: 0,25 cala). 
	UWAGA: Rozmiar obudowy jest określany na podstawie wymiarów ramy mikroskopu i stage. Przedni panel obudowy mikroskopu będzie musiał zostać tymczasowo usunięty, aby zainstalować elastyczną komorę i załadować miskę do hodowli komórkowych.
	<ol>
		<li>Aby zmontować obudowę, należy wykonać proste prace obróbcze, w tym wycinanie, wiercenie i gwintowanie otworów na na każdej krawędzi arkuszy poliwęglanu. Wytnij dwa duże otwory o średnicy 2.6 cala po prawej i lewej stronie obudowy, aby dopasować odpowiednio rurkę dolotową i wylotową. Wytnij mały otwór o średnicy 5 mm na tylnym arkuszu, aby umożliwić wiązkom laserowym wejście do obudowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczelnij krawędzie i interfejsy pudełka za pomocą taśmy z folii aluminiowej.</li>
	<li>Podłącz elastyczny wąż kanałowy do otworów wlotowych i wylotowych skrzynki obudowy, aby umożliwić cyrkulacyjny przepływ ciepłego powietrza pompowany i kontrolowany przez moduł nagrzewnicy. Umieść czujnik termiczny modułu grzałki w elastycznej komorze, w której komórki są hodowane i obrazowane. Ustaw temperaturę docelową na 37 °C. 
	UWAGA: Dyfuzor może być użyty w celu uzyskania bardziej równomiernego rozkładu przepływu powietrza w obudowie środowiskowej.</li>
</ol>
2. Zmontuj elastyczną komorę
<ol>
	<li>Zamontuj obrabiany maszynowo pusty cylindryczny element aluminiowy 1 (materiał: aluminium 6061) do końcówki obiektywu za pomocą trzech dociskowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Zamontuj obrabiany maszynowo pusty cylindryczny aluminiowy element 2 do uchwytu próbki za pomocą czterech 1/4-20 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). 
	UWAGA: Uchwyt próbki musi być zmodyfikowany tak, aby zawierał naczynie do hodowli komórek ze szklanym dnem o średnicy 50 mm. Wywierć otwór przelotowy w środku uchwytu na próbki za pomocą otwornicy 1-7/8 cala. Pogłębić otwór za pomocą otwornicy 50 mm i zachować głębokość otworu przelotowego ~1 mm.</li>
	<li>Zamontuj uchwyt próbki z aluminiowym elementem 2 na zmotoryzowanym stage i zamontuj go za pomocą.</li>
	<li>Umieść tuleję z folii z kauczuku naturalnego (grubość: 0,01 cala; przyklejoną klejem cyjanoakrylowym) między dwoma obrabianymi elementami aluminiowymi i zamontuj ją za pomocą gumek na każdym końcu.</li>
	<li>Podłączyć sprężoną butlę CO2 do modułu mieszalnika gazów za pomocą odpowiednich przewodów i złączy. Ustaw ciśnienie wejściowe CO2 na 20-25 psi. Użyj wbudowanego czujnika CO2 i sterownika, aby upewnić się, że moduł mieszacza powietrza może regulować i mieszać 5% CO2 z przepływem powietrza. Użyj wbudowanych filtrów, aby oczyścić przepływ powietrza.</li>
	<li>Za pomocą odpowiednich wężyków i złączy skieruj zmieszane powietrze (z 5% CO2) do wstępnie wysterylizowanej butelki na wodę umieszczonej na płycie grzejnej, a następnie skieruj nawilżone powietrze do elastycznej komory. Ustaw płytę grzejną na 37 °C. Rozpal strumień powietrza w ciepłej wodzie, aby zwiększyć wilgotność przepływu powietrza.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym SRS na żywych komórkach
<ol>
	<li>Przetrzyj wszystkie części elastycznej komory 70% etanolem, w tym końcówkę, obiektyw do zanurzania w wodzie i uchwyt na próbkę.</li>
	<li>Odkazić cały system szafy sterowniczej za pomocą lampy UV umieszczonej w obudowie na 20 do 30 min. 
	UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa nie należy przebywać w pomieszczeniu laboratoryjnym podczas procesu dezynfekcji UV.</li>
	<li>Hodowla komórek SKOV3 na 50-milimetrowej szalce Petriego ze szklanym dnem przez 12 godzin w normalnych warunkach fizjologicznych w zwykłym inkubatorze. 
	UWAGA: Uruchom hodowlę komórkową SKOV3 18 w standardowej komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Odłącz obrabiany aluminiowy element 2 od uchwytu próbki, odkręcając. 
	UWAGA: Jest to sposób na otwarcie elastycznej komory w celu załadowania naczynia do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Załaduj naczynie do hodowli komórkowych. Pamiętaj, aby dodać olejek immersyjny na wierzch kondensatora przed umieszczeniem naczynia do hodowli komórkowych. Zdejmij pokrywę naczynia i unieruchom naczynie za pomocą clamps. 
	UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, wszystkie czynności należy wykonywać w rękawiczkach.</li>
	<li>Opuść obiektyw do pożywki do hodowli komórkowej, aby uzyskać zgrubne ogniskowanie. Opuść aluminiowy element 2, aby zamknąć elastyczną komorę i zamontuj ją do uchwytu próbki za pomocą. 
	UWAGA: Podkładka z gumy silikonowej o grubości 2 mm jest przymocowana do dolnej części aluminiowego elementu 2, aby szczelnie uszczelnić szczelinę.</li>
	<li>Ustaw dopływ powietrza z 5% CO2 i 19% O2 dla normalnej hodowli komórkowej o natężeniu przepływu powietrza 200 cc/min. 
	UWAGA: Można zastosować niższe natężenie przepływu powietrza. Zależy to od tego, jak dobrze uszczelniona jest elastyczna komora.</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym SRS na żywych komórkach
<ol>
	<li>Dostosuj długość fali lasera do 805 nm, aby celować w przesunięcie Ramana o 2854 cm-1, które przypisuje się wibracjom wiązań chemicznychCH2. Użyj niskiej mocy lasera, aby zmniejszyć fotouszkodzenia komórek. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj średniej mocy ~15 mW lasera pompującego i ~7,5 mW lasera Stokesa (ustalonego na 1,045 nm) do długoterminowego obrazowania żywych komórek. 
	UWAGA: Wyższa moc lasera zapewni lepszą jakość obrazowania SRS. Jednak zbyt duża moc lasera wywoła fotouszkodzenie żywych komórek. Istnieje kompromis między jakością obrazu a fotouszkodzeniami.</li>
	<li>Dostosuj i ustaw ostrość obiektywu, aby uzyskać dobre obrazowanie SRS komórek za pomocą przycisku FOCUS na panelu GŁÓWNE STEROWANIE oprogramowania. Aby wykonać szybkie ustawianie ostrości, ustaw numer piksela na 512 × 512 pikseli z czasem skupienia piksela 4,8 μs na panelu KONFIGURACJA.</li>
	<li>Ustaw zakres wejściowy wzmacniacza lock-in (zwykle 5 mV) tak, aby był dwukrotnie większy od maksymalnego napięcia sygnału. Ustaw filtr dolnoprzepustowy tak, aby był taki sam jak czas przebywania pikseli (4,8 μs). 
	UWAGA: Różne systemy SRS zbudowane w laboratorium mogą używać różnych ustawień akwizycji danych.</li>
	<li>Po uzyskaniu dobrej ostrości ustaw rozdzielczość obrazowania na 2 048 × 2 048 pikseli dla pola widzenia 175 μm2 w celu uzyskania obrazów wysokiej jakości. Sprawdź funkcję SAVE na panelu GŁÓWNE STEROWANIE i sprawdź kanał SRS na panelu KANAŁY. Ustaw czas interwału między dwiema klatkami na 180 s (3 min) na kanale MAIN CONTROLS. Ustaw numer akwizycji na 480 dla obrazowania poklatkowego przez 24 godziny 
	UWAGA: W zależności od celu eksperymentów można zastosować niższą rozdzielczość obrazowania.</li>
	<li>Rozpocznij automatyczną akwizycję obrazowania za pomocą funkcji LOOP na panelu GŁÓWNE STEROWANIE. 
	UWAGA: Sprawdź, czy w pierwszej godzinie obrazowania występuje dryft ogniskowej spowodowany niestabilnością temperatury. Obrazowanie w pierwszej godzinie może nie być stabilne. Sprawdzaj ostrość co 2-3 godziny podczas sesji obrazowania poklatkowego.</li>
	<li>Przetwarzaj zebrane obrazy za pomocą klasy ImageJ<sup="xref">19. Do kwantyfikacji LD należy zastosować następujące dwie metody: (i) stosunek LD do powierzchni ciała komórki oraz (ii) średnią intensywność SRS całkowitej liczby LD. Zmierz obszar ciała komórki, progując i zerując piksele niekomórkowe na obrazach SRS na 2,854 cm-1. Zmierz obszar i intensywność LD, progując i zerując piksele inne niż LD na obrazach SRS. 
	UWAGA: Więcej szczegółów na temat przetwarzania obrazu SRS zostało zgłoszonych wcześniej16.</li>
</ol>

<ol><li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMertz%2C+J+%22Introduction+to+Optical+Microscopy%22">Introduction to Optical Microscopy</a>. , Cambridge University Press. (2019).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li>
<li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004(2020).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems%3A+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870(2015).</li>
<li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li>
<li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li>
<li>Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBu%C4%91a%2C+R+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. (139), Elsevier. 81-101 (2017).</li>
<li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365(2020).</li>
<li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li>
<li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li>
<li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+%28L5178Y%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li>
<li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLac%2C+A+%22Fluorescent+Microscopy%22">Fluorescent Microscopy</a>. , Springer. 57-73 (2022).</li>
<li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Ceramic+Society%22%5BJournal%5D)">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li>
<li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li>
<li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416(2021).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Physics%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li>
<li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li>
<li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li>
<li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development%2C+innovation%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003(2022).</li>
<li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li>
<li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353(2022).</li>
<li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li>
<li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li>
<li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging%3A+the+cell%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li>
<li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li>
<li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoreciprocity+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li>
<li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-multiplex+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Mikroskopia poklatkowa SRS na żywych komórkach jest alternatywną techniką obrazowania do śledzenia cząsteczek w sposób bezznacznikowy. W porównaniu do znakowania fluorescencyjnego, obrazowanie SRS jest wolne od fotowybielania, co umożliwia długoterminowe monitorowanie cząsteczek. Jednak do tej pory system obrazowania żywych komórek w pionowej mikroskopii SRS nie jest dostępny na rynku. W ramach tej pracy opracowano system obrazowania żywych komórek ze stabilną, izolowaną termicznie obudową mikroskopu i elastyczną wewnętr...

Mikroskopia optyczna służy do obserwacji mikrostruktur próbek. Obrazowanie optyczne jest szybkie, mniej inwazyjne i mniej destrukcyjne niż inne technologie1. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii optycznej zostało opracowane w celu uchwycenia dynamiki hodowanych żywych komórek w długim okresie czasu2. Różne rodzaje kontrastów optycznych dostarczają wyraźnych informacji o próbkach biologicznych. Na przykład optyczna mikroskopia fazowa pokazuje subtelną różnicę we współczynnikach załamania światła w próbce3. Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do obrazowania określonych biomolekuł lub organelli komórkowych. Jednak szerokopasmowe widma wzbudzenia i emisji fluorescencji zwykle powodują nakładanie się widm, gdy wykonywane jest obrazowanie wielokolorowe4. Cząsteczki fluorescencyjne są wrażliwe na światło i mogą być wybielane po długotrwałej, okresowej ekspozycji na światło. Ponadto znakowanie fluorescencyjne może zmienić biodystrybucję cząsteczek w komórkach5. Mikroskopia SRS to bezznacznikowa technologia obrazowania chemicznego6. Kontrast SRS opiera się na przejściu wibracyjnym określonych wiązań chemicznych. Częstotliwość drgań wiązania chemicznego często wykazuje wąską szerokość pasma spektralnego, co umożliwia obrazowanie wielu pasm Ramana w tych samych próbkach7. Mikroskopia SRS to unikalne narzędzie do obrazowania żywych komórek, zapewniające wiele kontrastów chemicznych w sposób bezznacznikowy8.
Podczas gdy obrazowanie SRS niebarwionych komórek było używane w wielu badaniach, długoterminowe obrazowanie poklatkowe SRS żywych komórek nie zostało powszechnie przyjęte. Jednym z powodów jest to, że komercyjne komory otwarte nie mogą być bezpośrednio używane do obrazowania SRS ze względu na ich dużą grubość9,10,11,12. Te komory ze szklaną pokrywą są w większości przeznaczone do obrazowania w jasnym polu lub fluorescencji przy użyciu pojedynczego obiektywu o wysokiej wartości NA ze schematem wykrywania wstecznego. Jednak obrazowanie SRS preferuje transmisję detekcji przy użyciu zarówno obiektywu o wysokim NA, jak i kondensatora o wysokim NA, co pozostawia tylko bardzo krótki odstęp (zwykle kilka milimetrów) między obiektywem a kondensatorem. Aby przezwyciężyć ten problem, zaprojektowaliśmy elastyczną komorę z miękkiego materiału, aby umożliwić poklatkowe obrazowanie SRS żywych komórek przy użyciu pionowej ramy mikroskopu. W tej konstrukcji obiektyw zanurzający się w wodzie został zamknięty w miękkiej komorze i może swobodnie poruszać się w trzech wymiarach w celu ustawiania ostrości i obrazowania.
Optymalna temperatura do hodowli większości komórek ssaków wynosi 37 °C, podczas gdy temperatura w pomieszczeniu jest zawsze o 10° niższa. Temperatura wyższa lub niższa niż 37 °C ma dramatyczny wpływ na tempo wzrostu komórek13. Dlatego w systemie obrazowania żywych komórek wymagana jest kontrola temperatury środowiska hodowli komórkowej. Wiadomo, że niestabilność temperatury prowadzi do problemów z rozmyciem podczas długotrwałego obrazowania14. Aby osiągnąć stabilne środowisko o temperaturze 37 °C, zbudowaliśmy dużą komorę obudowy, która zakrywa całą ramę mikroskopu, w tym warstwę izolacji termicznej pod mikroskopem (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). W dużej komorze do kontroli temperatury, mała elastyczna komora pomaga dokładnie utrzymać fizjologiczną wilgotność i pH poprzez regulowany przepływ powietrza uzupełniony 5% CO2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Temperatura i wilgotność komór zostały zmierzone w celu potwierdzenia, że konstrukcja dwukomorowa zapewnia optymalne warunki do hodowli komórek dla wzrostu komórek w długotrwałym, okresowym obrazowaniu SRS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Następnie zademonstrowaliśmy zastosowanie systemu do obrazowania poklatkowego i śledzenia kropelek lipidów (LD) w komórkach nowotworowych SKOV3 (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 5 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 6).

<table><tbody><tr><td>Laboratoryjny mikroskop SRS</td><td></td><td></td><td>https://rdcu.be/cP6ve</td></tr><tr><td>HF2LI 50 MHz wzmacniacz blokujący</td><td>Zurich Instruments</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>Przysłona irysowa</td><td>Thorlabs Inc</td><td>SM1D12</td><td></td></tr><tr><td>Kinematyczne mocowanie lustra</td><td>Thorlabs Inc</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>Ramka mikroskopu</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-1</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik mikroskopowy</td><td>Prior Scientific</td><td>Z-Deck</td><td></td></tr><tr><td>Kondensator olejowy (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td><td>Nikon Inc</td><td>MBL71405</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw zanurzeniowy w wodzie (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td><td>Nikon Inc</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiały i części do obudowy mikroskopu (31'' x 29'' x 28'' dł. x szer. x wys.)</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moduł grzewczy Airtherm</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>AIRTHERM-SAT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik nagrzewnicy Airtherm, CO2 i monitor wilgotności</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td>Moduł mieszacza <td>AIRTHERM-SMT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Moduł mieszacza Air/CO2</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>ECU-HOC-W</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczny wąż kanałowy (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>56675K71</td><td></td></tr><tr><td>Wysokotemperaturowa ceramika szklano-mikowa, łatwa w obróbce (6'' x 6'', grubość 1/4'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8489K62</td><td></td></tr><tr><td>Arkusze poliwęglanu (grubość 0.25'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K286</td><td></td></tr><tr><td>Arkusze gumy silikonowej (36'' x 36'', grubość 1/8'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>5827T43</td><td></td></tr><tr><td>Materiały i części do elastycznej komory</mocnej></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płyty grzejnej</td><td>McMaster-Carr</td><td>31745K11</td><td></td></tr><tr><td>Filtr liniowy o wysokiej czystości, 1/4 NPT</td><td>McMaster-Carr</td><td>6645T18</td><td></td></tr><tr><td>Otwornica (średnica cięcia 1-7/8 cal)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4066A34</td><td></td></tr><tr><td>Otwornica (średnica cięcia 50 mm)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4556A19</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z gumy silikonowej wysokotemperaturowej, miękka, 2 mm ID, 5 mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5054K313</td><td></td></tr><tr><td>Filtr liniowy (1/4 NPT, 40 mikronów)</td><td>McMaster-Carr</td><td>98385K843</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna rura okrągła 6061 aluminiowa (grubość ścianki 1/8'', 4' ' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K42</td><td></td></tr><tr><td>Multipurpose 6061 Aluminiowa rura okrągła (grubość ścianki 3/4 '', 3-3/4 '' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K47</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna kierownica aluminiowa 6061 (12'' x 12'', grubość 1/4'')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8975K142</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna kierownica aluminiowa 6061 (8'' x 8'', grubość 3/8'' ')</td> <td>Końcówka obiektywu McMaster-Carr</td><td>9246K21</td><td></td></tr><tr><td>(pojedyncza)</td> <td>Nikon Inc</td><td>FN-MN-H</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbkę (zmodyfikowany)</td> <td>Prior Scientific</td><td>HZ202</td><td></td></tr><tr><td>Ultracienka folia z kauczuku naturalnego (grubość 0,01 '')</td> <td>McMaster-Carr</td><td>8611K13</td><td></td></tr><tr><td>Szklany słoik zamykany próżniowo</td><td>McMaster-Carr</td><td>3231T44</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fidżi)</td><td></td><td>imagej.net</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio Technologies, LLC</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr> <tr><td>SRSMateriały do obrazowania żywych komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pokrywowe sterylne naczynia hodowlane ze szklanym dnem (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td><td>Mikroskopia elektronowa (EMS)</td><td>70674-02</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>DMEM ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>LysoSensor barwnik fluorescencyjny DND-189</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7535 (Invitrogen)</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>MilliporeSigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr></tbody></table>

elastyczna komora do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią wymuszonego rozpraszania ramana

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) to technologia obrazowania chemicznego bez znaczników. Obrazowanie żywych komórek za pomocą SRS zostało zademonstrowane w wielu zastosowaniach biologicznych i biomedycznych. Jednak długoterminowe poklatkowe obrazowanie SRS żywych komórek nie zostało powszechnie przyjęte. Mikroskopia SRS często wykorzystuje obiektyw zanurzeniowy w wodzie o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i kondensor zanurzeniowy w oleju o wysokiej wartości NA, aby uzyskać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku odstęp między obiektywem a kondensatorem wynosi tylko kilka milimetrów. W związku z tym większość komercyjnych komór środowiskowych typu stage top nie może być używana do obrazowania SRS ze względu na ich dużą grubość ze sztywną szklaną pokrywą. W artykule opisano projekt i wykonanie elastycznej komory, która może być używana do poklatkowego obrazowania żywych komórek z detekcją przesyłanego sygnału SRS na pionowej ramie mikroskopu. Elastyczność komory uzyskano dzięki zastosowaniu miękkiego materiału - cienkiej folii z kauczuku naturalnego. Nową konstrukcję obudowy i komory można łatwo dodać do istniejącej konfiguracji obrazowania SRS. Testy i wstępne wyniki pokazują, że elastyczny system komór umożliwia stabilne, długotrwałe, poklatkowe obrazowanie SRS żywych komórek, które w przyszłości może być wykorzystywane do różnych zastosowań bioobrazowania.

Wykonaliśmy i zmontowaliśmy system elastycznej komory do obrazowania SRS w trybie poklatkowym (Rycina 1 oraz Rycina 2), a następnie oceniliśmy wydajność tego systemu. Temperatura wewnątrz obudowy środowiskowej mikroskopu osiągnęła oczekiwane 37 °C w ciągu 1 h, co nie wpłynęło znacząco na temperaturę w pomieszczeniu (Rycina 3A). Temperatura w elastycznej komorze osiągnęła 37 °C w ciągu 1,5 h i była stabilnie utrzymywana na poziomie 3...

Informujemy o zastosowaniu wysokiej jakości, elastycznej komory środowiskowej do obrazowania poklatkowego żywych komórek za pomocą pionowej, stymulowanej mikroskopii rozpraszania Ramana z detekcją przesyłanego sygnału. Kropelki lipidów obrazowano w komórkach SKOV3 traktowanych kwasem oleinowym przez okres do 24 godzin w odstępie 3 minut.

Elastyczna komora do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią wymuszonego rozpraszania Ramana

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Elastyczna technika komory środowiskowej umożliwia obrazowanie poklatkowe jako SRS z detekcją przesyłanego sygnału na ramie mikroskopu operacyjnego. W mikroskopii SRS wykorzystano obiektyw o dużej aperturze numerycznej i kondensator o wysokim końcu, pozostawiając tylko kilka milimetrów przerwy, w której nie zmieściłaby się konwencjonalna komora. Elastyczna komora rozwiązuje ten problem.Naukowcy korzystający z mikroskopii SRS mogą z łatwością zastosować tę technikę. Elastyczna komora może być również używana w mikroskopie preparacyjnym lub sterylnym w celu utrzymania próbki w optymalnych warunkach fizjologicznych. Aby rozpocząć, zaznacz położenie nóżek ramy mikroskopu SRS i zmotoryzowanego stolika za pomocą markera na stole optycznym.Po wyjęciu ramy mikroskopu i stolika ze stołu optycznego połóż arkusz gumy silikonowej na stole. Przetnij gumę silikonową wzdłuż śladów za pomocą noża. Usuń małe gumowe kawałki i umieść kwadratowe arkusze ceramiczne z miki w tych samych miejscach.Następnie przesuń ramę mikroskopu i stolik z powrotem na stół optyczny i ostrożnie wyrównaj nóżki na arkuszach ceramicznych z miki wzdłuż linii znacznika. Po wyrównaniu ścieżki optycznej SRS należy zamontować obudowę środowiskową na fundamencie izolacji termicznej, aby pokryć całą ramę mikroskopu, używając pięciu kawałków dużych arkuszy poliwęglanu. Uszczelnij krawędzie i interfejsy pudełka za pomocą taśmy z folii aluminiowej.Podłącz elastyczny wąż kanałowy do otworów wlotowych i wylotowych skrzynki obudowy, aby umożliwić cyrkulacyjny, ciepły przepływ powietrza pompowany i kontrolowany przez moduł nagrzewnicy. Zamontuj obrabiany maszynowo pusty cylindryczny element aluminiowy 1 do końcówki obiektywu za pomocą trzech dociskowych. Następnie zamontuj obrobiony maszynowo pusty cylindryczny element aluminiowy 2 do uchwytu próbki za pomocą czterech.Zamontuj uchwyt próbki z aluminiowym elementem 2 na zmotoryzowanym stage i zamontuj go za pomocą. Umieść tuleję z folii z kauczuku naturalnego między dwoma obrabianymi maszynowo elementami aluminiowymi i zamontuj ją za pomocą gumek na każdym końcu. Podłącz butlę ze sprężonym CO2 do modułu mieszalnika gazów za pomocą odpowiednich przewodów i złączy.Ustaw ciśnienie wejściowe CO2 na 20 do 25 psi. Użyj wbudowanego czujnika CO2 i sterownika, aby upewnić się, że moduł mieszacza powietrza może regulować i mieszać 5% CO2 z przepływem powietrza. Użyj wbudowanych filtrów, aby oczyścić przepływ powietrza.Za pomocą odpowiednich wężyków i złączy skieruj zmieszane powietrze do wstępnie wysterylizowanej butelki na wodę umieszczonej na płycie grzejnej, a następnie skieruj nawilżone powietrze do elastycznej komory. Ustaw płytę grzejną na 37 stopni Celsjusza. Zwiększ przepływ powietrza w ciepłej wodzie, aby zwiększyć wilgotność przepływu powietrza.Odłącz aluminiowy element maszyny 2 od uchwytu próbki, odkręcając. Przetrzyj wszystkie części elastycznej komory 70% etanolem, w tym końcówkę nosową, uchwyt próbki i obiektyw do zanurzania w wodzie. Odkaź cały system obudowy za pomocą lampy UV umieszczonej w obudowie na 20 do 30 minut.Następnie załaduj naczynie do hodowli komórkowych. Zdejmij pokrywę naczynia i unieruchom ją za pomocą zacisków. Opuść obiektyw do pożywki do hodowli komórkowej, aby uzyskać zgrubne ogniskowanie.Opuść aluminiowy element 2, aby zamknąć elastyczną komorę i zamontuj ją do uchwytu próbki za pomocą. Następnie włóż czujnik. Ustaw dopływ powietrza na 5% CO2 i 19% O2 dla normalnej hodowli komórkowej z natężeniem przepływu powietrza 200 centymetrów sześciennych na minutę i temperaturą do 37 stopni Celsjusza.Dostosuj długość fali lasera do 805 nanometrów, aby celować w odwrotne przesunięcie Ramana o 2 854 centymetry, które przypisuje się wibracjom wiązań chemicznych CH2. Użyj niskiej mocy lasera, aby zmniejszyć fotouszkodzenia komórek. Dostosuj i ustaw ostrość obiektywu, aby uzyskać dobre obrazowanie SRS komórek za pomocą przycisku ostrości na głównym panelu sterowania oprogramowania.Aby wykonać szybkie ustawianie ostrości, ustaw liczbę pikseli na 512 na 512 pikseli z czasem zatrzymania piksela wynoszącym 4,8 mikrosekundy na panelu konfiguracji. Po uzyskaniu dobrej ostrości ustaw rozdzielczość obrazowania na 2048 na 2048 pikseli dla pola widzenia 175 mikrometrów kwadratowych w celu uzyskania obrazów wysokiej jakości. Sprawdź funkcję zapisywania na głównym panelu sterowania i sprawdź kanał SRS na panelu kanałów.Ustaw czas interwału między dwiema klatkami na 180 sekund na głównym kanale sterowania. Ustaw numer akwizycji na 480 dla obrazowania poklatkowego w ciągu 24 godzin. Uruchom automatyczną akwizycję obrazu za pomocą funkcji pętli na głównym panelu sterowania.Oceniono wydajność systemu elastycznych komór do obrazowania poklatkowego SRS. Temperatura wewnątrz obudowy mikroskopu osiągnęła oczekiwane 37 stopni Celsjusza i nie wpłynęła znacząco na temperaturę w pomieszczeniu. Temperatura w elastycznej komorze osiągnęła 37 stopni Celsjusza w ciągu 1,5 godziny i była stabilnie utrzymywana przez co najmniej 24 godziny.Wilgotność względna w elastycznej komorze osiągnęła 85% w ciągu jednej godziny i mogła być utrzymywana przez co najmniej 24 godziny. Obrazowanie poklatkowe SRS żywych komórek SKOV3 wykazało szybki i aktywny ruch wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów z rozdzielczością czasową wynoszącą trzy minuty. Pod koniec 24-godzinnej sesji obrazowania komórki nadal wykazywały normalną morfologię i gęstość, co wskazuje, że komórki były zdrowe.Następnie zobrazowano komórki SKOV3 potraktowane kwasem oleinowym, a akumulację kropelek lipidów śledzono przez 10 godzin. Ilości kropelek lipidów określono ilościowo za pomocą stosunku kropelek lipidów do powierzchni ciała komórki i całkowitej intensywności SRS kropelek lipidów. Wyniki wskazują, że ilość kropelek lipidów rosła przez ponad 10 godzin.Wykazano również równoczesne obrazowanie kropelek lipidów metodą SRS do przodu oraz obrazowanie fluorescencyjne dwufotonowe lizosomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym DND-189. Zaobserwowano bardzo niski stopień kolokalizacji kropelek lipidów i lizosomów. Próbując skorzystać z tego protokołu, należy pamiętać, że dryf ogniskowej jest częstym problemem w obrazowaniu żywych komórek.Ponowne ustawienie ostrości może być konieczne po około dwóch godzinach obrazowania poklatkowego. Po jego opracowaniu, poklatkowe obrazowanie SRS było wykorzystywane w różnych badaniach do śledzenia cząsteczek bezznacznikowych lub cząsteczek znakowanych tekstem Ramana w żywych komórkach.

a-flexible-chamber-for-time-lapse-live-cell-imaging-with-stimulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Zhang, M. i in., Szybkie testy podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana inkorporacji deuteru w pojedynczej bakterii. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje zastosowanie stymulowanej mikroskopii rozpraszającej Ramana do oceny podatności na antybiotyki poprzez śledzenie aktywności metabolycznej oznaczanej deuterem. Poprzez monitorowanie sygnałów węgla–deuteru metoda umożliwia szybkie wykrywanie populacji bakterii odpornych i podatnych.

Wykrywanie podatności na antybiotyki bakteryjne za pomocą stymulowanego mikroskopu rozpraszającego Ramana

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Ten artykuł zawiera szczegółowy przewodnik po montażu i obsłudze mikroskopu z oświetleniem strukturalnym działającym z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF-SIM) do obrazowania dynamicznych procesów biologicznych z optyczną superrozdzielczością w wielu kolorach.

Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Poznaj elastyczną komorę do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią SRS. Technika umożliwia obserwację dynamiki kropel lipidowych w komórkach SKOV3 przez 24 godziny.

Elastyczna komora do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią wymuszonego rozpraszania Ramana

Przeglądaj więcej filmów