Elastyczna komora do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią wymuszonego rozpraszania Ramana

Elastyczna technika komory środowiskowej umożliwia obrazowanie poklatkowe jako SRS z detekcją przesyłanego sygnału na ramie mikroskopu operacyjnego. W mikroskopii SRS wykorzystano obiektyw o dużej aperturze numerycznej i kondensator o wysokim końcu, pozostawiając tylko kilka milimetrów przerwy, w której nie zmieściłaby się konwencjonalna komora. Elastyczna komora rozwiązuje ten problem.

Naukowcy korzystający z mikroskopii SRS mogą z łatwością zastosować tę technikę. Elastyczna komora może być również używana w mikroskopie preparacyjnym lub sterylnym w celu utrzymania próbki w optymalnych warunkach fizjologicznych. Aby rozpocząć, zaznacz położenie nóżek ramy mikroskopu SRS i zmotoryzowanego stolika za pomocą markera na stole optycznym.

Po wyjęciu ramy mikroskopu i stolika ze stołu optycznego połóż arkusz gumy silikonowej na stole. Przetnij gumę silikonową wzdłuż śladów za pomocą noża. Usuń małe gumowe kawałki i umieść kwadratowe arkusze ceramiczne z miki w tych samych miejscach.

Następnie przesuń ramę mikroskopu i stolik z powrotem na stół optyczny i ostrożnie wyrównaj nóżki na arkuszach ceramicznych z miki wzdłuż linii znacznika. Po wyrównaniu ścieżki optycznej SRS należy zamontować obudowę środowiskową na fundamencie izolacji termicznej, aby pokryć całą ramę mikroskopu, używając pięciu kawałków dużych arkuszy poliwęglanu. Uszczelnij krawędzie i interfejsy pudełka za pomocą taśmy z folii aluminiowej.

Podłącz elastyczny wąż kanałowy do otworów wlotowych i wylotowych skrzynki obudowy, aby umożliwić cyrkulacyjny, ciepły przepływ powietrza pompowany i kontrolowany przez moduł nagrzewnicy. Zamontuj obrabiany maszynowo pusty cylindryczny element aluminiowy 1 do końcówki obiektywu za pomocą trzech dociskowych. Następnie zamontuj obrobiony maszynowo pusty cylindryczny element aluminiowy 2 do uchwytu próbki za pomocą czterech.

Zamontuj uchwyt próbki z aluminiowym elementem 2 na zmotoryzowanym stage i zamontuj go za pomocą. Umieść tuleję z folii z kauczuku naturalnego między dwoma obrabianymi maszynowo elementami aluminiowymi i zamontuj ją za pomocą gumek na każdym końcu. Podłącz butlę ze sprężonym CO2 do modułu mieszalnika gazów za pomocą odpowiednich przewodów i złączy.

Ustaw ciśnienie wejściowe CO2 na 20 do 25 psi. Użyj wbudowanego czujnika CO2 i sterownika, aby upewnić się, że moduł mieszacza powietrza może regulować i mieszać 5% CO2 z przepływem powietrza. Użyj wbudowanych filtrów, aby oczyścić przepływ powietrza.

Za pomocą odpowiednich wężyków i złączy skieruj zmieszane powietrze do wstępnie wysterylizowanej butelki na wodę umieszczonej na płycie grzejnej, a następnie skieruj nawilżone powietrze do elastycznej komory. Ustaw płytę grzejną na 37 stopni Celsjusza. Zwiększ przepływ powietrza w ciepłej wodzie, aby zwiększyć wilgotność przepływu powietrza.

Odłącz aluminiowy element maszyny 2 od uchwytu próbki, odkręcając. Przetrzyj wszystkie części elastycznej komory 70% etanolem, w tym końcówkę nosową, uchwyt próbki i obiektyw do zanurzania w wodzie. Odkaź cały system obudowy za pomocą lampy UV umieszczonej w obudowie na 20 do 30 minut.

Następnie załaduj naczynie do hodowli komórkowych. Zdejmij pokrywę naczynia i unieruchom ją za pomocą zacisków. Opuść obiektyw do pożywki do hodowli komórkowej, aby uzyskać zgrubne ogniskowanie.

Opuść aluminiowy element 2, aby zamknąć elastyczną komorę i zamontuj ją do uchwytu próbki za pomocą. Następnie włóż czujnik. Ustaw dopływ powietrza na 5% CO2 i 19% O2 dla normalnej hodowli komórkowej z natężeniem przepływu powietrza 200 centymetrów sześciennych na minutę i temperaturą do 37 stopni Celsjusza.

Dostosuj długość fali lasera do 805 nanometrów, aby celować w odwrotne przesunięcie Ramana o 2 854 centymetry, które przypisuje się wibracjom wiązań chemicznych CH2. Użyj niskiej mocy lasera, aby zmniejszyć fotouszkodzenia komórek. Dostosuj i ustaw ostrość obiektywu, aby uzyskać dobre obrazowanie SRS komórek za pomocą przycisku ostrości na głównym panelu sterowania oprogramowania.

Aby wykonać szybkie ustawianie ostrości, ustaw liczbę pikseli na 512 na 512 pikseli z czasem zatrzymania piksela wynoszącym 4,8 mikrosekundy na panelu konfiguracji. Po uzyskaniu dobrej ostrości ustaw rozdzielczość obrazowania na 2048 na 2048 pikseli dla pola widzenia 175 mikrometrów kwadratowych w celu uzyskania obrazów wysokiej jakości. Sprawdź funkcję zapisywania na głównym panelu sterowania i sprawdź kanał SRS na panelu kanałów.

Ustaw czas interwału między dwiema klatkami na 180 sekund na głównym kanale sterowania. Ustaw numer akwizycji na 480 dla obrazowania poklatkowego w ciągu 24 godzin. Uruchom automatyczną akwizycję obrazu za pomocą funkcji pętli na głównym panelu sterowania.

Oceniono wydajność systemu elastycznych komór do obrazowania poklatkowego SRS. Temperatura wewnątrz obudowy mikroskopu osiągnęła oczekiwane 37 stopni Celsjusza i nie wpłynęła znacząco na temperaturę w pomieszczeniu. Temperatura w elastycznej komorze osiągnęła 37 stopni Celsjusza w ciągu 1,5 godziny i była stabilnie utrzymywana przez co najmniej 24 godziny.

Wilgotność względna w elastycznej komorze osiągnęła 85% w ciągu jednej godziny i mogła być utrzymywana przez co najmniej 24 godziny. Obrazowanie poklatkowe SRS żywych komórek SKOV3 wykazało szybki i aktywny ruch wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów z rozdzielczością czasową wynoszącą trzy minuty. Pod koniec 24-godzinnej sesji obrazowania komórki nadal wykazywały normalną morfologię i gęstość, co wskazuje, że komórki były zdrowe.

Następnie zobrazowano komórki SKOV3 potraktowane kwasem oleinowym, a akumulację kropelek lipidów śledzono przez 10 godzin. Ilości kropelek lipidów określono ilościowo za pomocą stosunku kropelek lipidów do powierzchni ciała komórki i całkowitej intensywności SRS kropelek lipidów. Wyniki wskazują, że ilość kropelek lipidów rosła przez ponad 10 godzin.

Wykazano również równoczesne obrazowanie kropelek lipidów metodą SRS do przodu oraz obrazowanie fluorescencyjne dwufotonowe lizosomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym DND-189. Zaobserwowano bardzo niski stopień kolokalizacji kropelek lipidów i lizosomów. Próbując skorzystać z tego protokołu, należy pamiętać, że dryf ogniskowej jest częstym problemem w obrazowaniu żywych komórek.

Ponowne ustawienie ostrości może być konieczne po około dwóch godzinach obrazowania poklatkowego. Po jego opracowaniu, poklatkowe obrazowanie SRS było wykorzystywane w różnych badaniach do śledzenia cząsteczek bezznacznikowych lub cząsteczek znakowanych tekstem Ramana w żywych komórkach.