Name: Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj skalowalną metodę oceny funkcjonalnej wariantów Ube3a w komórkach HEK293T przy użyciu testów lucyferazowych. To podejście umożliwia szybką identyfikację mutacji typu gain-of-function i loss-of-function związanych z zespołem Angelmana i autyzmem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Nagrodę Fundacji Simons Bridge to Independence (SFARI Award #387972; J.J.Y.), nagrodę NARSAD Young Investigator Award przyznawaną przez Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), stypendium badawcze Fundacji Alfreda P. Sloana (J.J.Y.) oraz granty badawcze przyznawane przez Fundację Zespołu Angelmana (J.J.Y.), Whitehall Foundation (J.J.Y.) i NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).

1. Klonowanie mutagenezy w celu wygenerowania wariantów Ube3a
<ol>
	<li>Sklonuj wszystkie warianty Ube3a do plazmidu pCIG2 (<silna klasa = "xfig" >Figura 1A), wektora bicystronicznego, który zawiera promotor β aktyny kurczaka i wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) dla wyrażenia EGFP19. Pełnowymiarowe konstrukcje Ube3a zawierają N-końcową sekwencję znacznika Myc i są klonowane do pCIG2 przy użyciu 5' miejsca SacI i 3' XmaI. Ponadto do subklonowania fragmentów wykorzystuje się również naturalnie występujące miejsca EcoRI, EcoRV i PstI w sekwencji kodującej Ube3a. 
	UWAGA: Zanonimizowane warianty Ube3a można uzyskać w literaturze oraz w publicznie dostępnych repozytoriach, takich jak baza danych ClinVar1. Dodatkowe niezgłoszone warianty można uzyskać poprzez osobistą komunikację z ośrodkami medycznymi.</li>
	<li>Użyj dostosowanej dwuetapowej metody mutagenezy megaprimerów20, aby wprowadzić mutacje do ramki odczytu Ube3a. W pierwszym kroku zaprojektuj mutagenny oligonukleotyd, który zawiera pożądaną mutację (przykładem pokazanym w tym protokole jest wygenerowanie wariantu UBE3A Q588E) otoczonego przez co najmniej 30 par zasad (bp) o homologii 5′ i 3′ do mutacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B i Tabela 1).</li>
	<li>Użyj mutagennego oligonukleotydu wraz z komplementarnym oligonukleotydem do pierwszej rundy PCR, aby wygenerować megaprimer o masie 200-400 pz zawierający mutację (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C; Tabela 2 i Tabela 3). Wykorzystać całe 50 μl objętości reakcji PCR do elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu 1% żelu, a następnie oczyszczenia żelem (tabela materiałów). Eluować produkt PCR w 30 μl dejonizowanegoH2O(diH2O) do użycia w drugiej rundzie PCR etap poniżej.</li>
	<li>Skonfiguruj drugą rundę PCR zgodnie z opisem (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C; Tabela 2 i Tabela 3). Ten krok wygeneruje większe fragmenty DNA (zwykle o długości ~1-1,5 kb) zawierające mutację i końcowe miejsca restrykcyjne odpowiednie do podklonowania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji PCR należy oczyścić otrzymany produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (tabela materiałów). Eluować w 30 μl i trawić cały oczyszczony produkt i konstrukt pCIG2 Ube3a WT z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (przykład pokazuje trawienie za pomocą EcoRI i XmaI).</li>
	<li>Po 2 godzinach trawienia w temperaturze 37 °C rozpuścić produkty trawienia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (1% żelu) i oczyścić odpowiednie produkty żelem. Ustaw ligacje zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów), przekształć produkty ligacji w szczep bakteryjny DH10B (Tabela materiałów), a następnie płytkę z wyborem ampicyliny (100 μg/ml).</li>
	<li>Następnego dnia wybierz od dwóch do czterech kolonii, aby zaszczepić 3 ml kultur zawierających bulion Luria (LB) i 100 μg/ml ampicyliny. Pozostawić kultury do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze orbitalnym z wytrząsaniem (225 obr./min).</li>
	<li>Następnego dnia użyj 1-1,5 ml kultury bakteryjnej do miniprzygotowania plazmidowego DNA (tabela materiałów). Zachowaj pozostałą kulturę, umieszczając ją w temperaturze 4 °C. Przesiej minipreparowane plazmidy za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu oligonukleotydu, który wiąże ~ 200 pz od pożądanej mutacji.</li>
	<li>Użyć kultur bakteryjnych zapisanych w temperaturze 4 °C do ponownego zaszczepienia 50 ml kultur w celu przygotowania odpowiedniego plazmidu (tabela materiałów). W pełni zsekwencjonuj sekwencję kodującą Ube3a, aby potwierdzić poprawną sekwencję DNA.</li>
	<li>Utwórz zapasy robocze plazmidów wariantu Ube3a, a także reportera aktywowanego β-kateniną (BAR)21, lucyferazy TK-Renilla, martwego ligazy Ube3a (mutacja UBE3A C820A) i pustego wektora pCIG2 o stężeniu 100 ng / μL przy użyciu sterylnego H2O dla kolejnych etapów transfekcji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i transfekcja ludzkich embrionalnych komórek nerki 293T (HEK293T)
<ol>
	<li>Wykonaj testy na HEK293T komórkach wyhodowanych w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, wstępnie uzupełnionej glutaminą, 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykiem przeciwgrzybiczym, jak opisano wcześniej17. Hodować komórki w sterylnym, wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego, najpierw umieść zawieszone HEK293T komórki na 96-dołkowych płytkach płaskodennych poddanych działaniu kultur tkankowych o gęstości 2,2 × 104 komórek na basenik w 100 μl pożywki hodowlanej i pozwól im rosnąć przez noc.</li>
	<li>Drugiego dnia należy przetransfekować komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą plazmidów reporterowych lucyferazy świetlików i Renilla (Tabela 4) oraz plazmidów Ube3a w trzech egzemplarzach. Przeprowadzić transfekcję w 10 μl całkowitej objętości na studzienkę, stosując plazmidy w stosunku 10:1:8 (odpowiednio 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla i 40 ng plazmidu Ube3a na studzienkę), jak opisano wcześniej18, i 0,4 μl odczynnika do transfekcji (Tabela 4). 
	UWAGA: W każdym eksperymencie pusty wektor (tylko GFP) i plazmid kodujący martwy w ligazie Ube3a są również transfekowane, aby służyły jako kontrole negatywne.</li>
	<li>W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (Tabela 4) należy utworzyć mieszankę wzorcową do transfekcji dla każdego wariantu (Tabela 4) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut. Po inkubacji delikatnie wymieszać mieszaninę transfekcji, stukając w probówkę, a następnie dodać 10 μl mieszaniny transfekcyjnej bezpośrednio do istniejących pożywek wzrostowych w studzienkach.</li>
	<li>Następnie należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze i pozwolić plazmidom na ekspresję przez 48 godzin. Wymiana pożywki wzrostowej nie jest konieczna.</li>
	<li>Monitorować wydajność transfekcji za pomocą fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. HEK293T komórki są skutecznie transfekowane tą metodą, a >80% komórek powinno wykazywać ekspresję GFP po 48 godzinach.</li>
</ol>
3. Pomiar aktywności lucyferazy
UWAGA: Aktywność lucyferazy jest oceniana za pomocą komercyjnie dostępnego systemu, który testuje zarówno lucyferazy Firefly, jak i Renilla (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
<ol>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną z transfekowanych komórek HEK293T, a następnie przemyć komórki zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Odessać PBS i poddać lizie komórki, dodając 25 μl niedenaturującego buforu do lizy i inkubować przez 15 minut, delikatnie kołysząc na lodzie.</li>
	<li>Następnie dodać 20 μl powstałego lizatu (nie jest konieczne wirowanie) do nowej 96-dołkowej płytki testowej zawierającej 100 μl odczynnika substratowego lucyferazy świetlika. Delikatnie wymieszaj płytkę, stukając.</li>
	<li>Załaduj płytkę do czytnika płytek i zmierz luminescencję za pomocą górnego detektora o wysokości odczytu 1 mm i czasie integracji 1 s. 
	UWAGA: Wzmocnienie detektora może wymagać regulacji w zależności od siły sygnału.</li>
	<li>Natychmiast po odczytaniu luminescencji lucyferazy świetlika dodaj 100 μl substratu lucyferazy Renilla do studzienek. Ten krok jednocześnie wygasza aktywność lucyferazy świetlika, jednocześnie oceniając aktywność lucyferazy Renilla. Wymieszać próbki przez delikatne poruszenie płytki i ponownie zmierzyć luminescencję, aby ocenić aktywność lucyferazy Renilla. 
	UWAGA: Podczas gdy inne płytki mogą być używane do tego testu, użycie płytek z czarnymi ramkami i białymi dołkami zapewni najbardziej czułe wyniki, ponieważ wzmacnia to sygnał lucyferazy przy jednoczesnej minimalizacji szumów.</li>
	<li>Określ ilościowo odpowiedzi reportera jako stosunek lucyferazy świetlika do lucyferazy Renilla (świetlik/Renilla) i uśrednij wartości potrójnych pomiarów. Następnie znormalizuj wartość Firefly/Renilla dla każdego wariantu w stosunku do wartości dla komórek eksprymujących Ube3a typu dzikiego (WT), aby porównać względną aktywność białek wariantowych.</li>
</ol>

<ol><li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+relationships+among+sequence+variation+and+human+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.</a> Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).</li>
<li>Lek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-coding+genetic+variation+in+60%2C706+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans.</a> Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).</li>
<li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+interpretation%3A+Functional+assays+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant interpretation: Functional assays to the rescue.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).</li>
<li>Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HPV-16+E6+and+E6-AP+complex+functions+as+a+ubiquitin-protein+ligase+in+the+ubiquitination+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53.</a> Cell. 75 (3), 495-505 (1993).</li>
<li>Albrecht, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+expression+of+the+murine+Angelman+syndrome+gene%2C+Ube3a%2C+in+hippocampal+and+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons.</a> Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).</li>
<li>Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Angelman+syndrome+candidate+gene%2C+UBE3A%2FE6-AP%2C+is+imprinted+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).</li>
<li>Vu, T. H., Hoffman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+Angelman+syndrome+gene%2C+UBE3A%2C+is+restricted+to+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain.</a> Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).</li>
<li>Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE3A%2FE6-AP+mutations+cause+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome.</a> Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).</li>
<li>Jiang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Angelman+ubiquitin+ligase+in+mice+causes+increased+cytoplasmic+p53+and+deficits+of+contextual+learning+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation.</a> Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).</li>
<li>Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome%3A+Insights+into+genomic+imprinting+and+neurodevelopmental+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes.</a> Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).</li>
<li>Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comorbidity+of+autism+with+the+genomic+disorders+of+chromosome+15q11.2-q13%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13.</a> Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).</li>
<li>Urraca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interstitial+duplication+15q11.2-q13+syndrome+includes+autism%2C+mild+facial+anomalies+and+a+characteristic+EEG+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%22%5BJournal%5D)">The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature.</a> Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).</li>
<li>de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+the+understanding+of+autism+disease+mechanisms+through+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics.</a> Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).</li>
<li>Scheffner, M., Staub, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECT+E3s+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">HECT E3s and human disease.</a> BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).</li>
<li>Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+Angelman+syndrome-associated+mutations+in+the+E3+ubiquitin+ligase+E6-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).</li>
<li>Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+specifies+axons+during+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling specifies axons during brain development.</a> Cell. 142 (1), 144-157 (2010).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autism-linked+UBE3A+T485A+mutant+E3+ubiquitin+ligase+activates+the+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+by+inhibiting+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).</li>
<li>Weston, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-linked+hyperactivating+mutations+in+UBE3A+through+large-scale+functional+variant+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).</li>
<li>Hand, R., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin2+regulates+the+initial+axon+guidance+of+cortical+pyramidal+neurons+projecting+medially+to+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum.</a> Neural Development. 6, 30(2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).</li>
<li>Biechele, T. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+beta-catenin%2FTCF+transcription+with+beta-catenin%2FTCF+transcription-based+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs.</a> Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).</li>
<li>Yi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Autism-linked+mutation+disables+phosphorylation+control+of+UBE3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A.</a> Cell. 162 (4), 795-807 (2015).</li>
<li>Kuhnle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angelman+syndrome-associated+point+mutations+in+the+Zn%282%2B%29-binding+N-terminal+%28AZUL%29+domain+of+UBE3A+ubiquitin+ligase+inhibit+binding+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).</li>
<li>Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+E6-AP+gene+%28UBE3A%29+encodes+three+potential+protein+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing.</a> Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).</li>
<li>Avagliano Trezza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+causes+electrophysiological+and+behavioral+deficits+in+mice+and+is+associated+with+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).</li>
<li>Bossuyt, S. N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nuclear+UBE3A+activity+is+the+predominant+cause+of+Angelman+syndrome+in+individuals+carrying+UBE3A+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations.</a> Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół zapewnia wydajną i skalowalną metodę oceny aktywności enzymatycznej wariantów Ube3a. Istnieje kilka szczegółów technicznych, które wymagają starannego rozważenia podczas korzystania z tego testu. Jedną z kwestii jest wybór plazmidów reporterowych Wnt stosowanych w tym teście. Opisany tutaj protokół wykorzystuje w szczególności reporter aktywowany β-kateniną (BAR)21, reporter, który zawiera konkatener elementów odpowiedzi 12 czynników limfocytów T (TCF) oddzielonych ...

Ostatnie osiągnięcia technologiczne sprawiły, że sekwencjonowanie egzomu i genomów stało się rutyną w warunkach klinicznych1,2. Doprowadziło to do odkrycia dużej liczby wariantów genetycznych, w tym milionów wariantów missense, które zazwyczaj zmieniają jeden aminokwas w białku. Zrozumienie funkcjonalnego znaczenia tych wariantów pozostaje wyzwaniem, a tylko niewielka część (~2%) znanych wariantów missense ma kliniczną interpretację1,3.
Doskonałym przykładem tego problemu jest Ube3a, gen kodujący ligazę ubikwityny E3, która kieruje się do degradacji białek substratowych4. Ube3a znajduje się w chromosomie 15q11-13 i ulega ekspresji wyłącznie z allelu odziedziczonego po matce5,6,7. Obserwacje z zakresu genetyki chorób silnie sugerują, że niewystarczająca lub nadmierna aktywność enzymu UBE3A powoduje wyraźne zaburzenia neurorozwojowe. Delecja matczynego chromosomu 15q11-13 powoduje zespół Angelmana (AS)8, zaburzenie charakteryzujące się ciężką niepełnosprawnością intelektualną, upośledzeniem motorycznym, drgawkami, radosnym zachowaniem z częstym uśmiechaniem się i dysmorficznymi rysami twarzy8,9,10. Natomiast duplikacja lub potrojenie chromosomu matki 15q11-13 powoduje zespół Dup15q, niejednorodny stan uznawany za jedną z najbardziej rozpowszechnionych syndromicznych form autyzmu11,12,13. Ponadto w Ube3a zidentyfikowano setki wariantów missense, z których większość jest uważana za warianty o niepewnym znaczeniu (VUS), ponieważ ich znaczenie funkcjonalne i kliniczne jest nieznane. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie opracowaniem metod, które mogą empirycznie ocenić warianty Ube3a w celu ustalenia, czy przyczyniają się one do choroby neurorozwojowej.
Enzym UBE3A należy do rodziny domen HECT (homologicznych do E6-AP C-endus) ligaz ubikwityny E3, z których wszystkie posiadają tytułową domenę HECT, która zawiera biochemiczną maszynerię niezbędną do przyjęcia aktywowanej ubikwityny z enzymów E2 i przeniesienia jej do białek substratowych14. Historycznie rzecz biorąc, charakterystyka enzymów E3 opierała się na odtworzonych systemach in vitro, które wymagają zestawu oczyszczonych białek4,15,16. Takie metody są powolne i pracochłonne oraz nie nadają się do oceny aktywności dużej liczby wariantów. W poprzednich pracach zidentyfikowano, że UBE3A aktywuje szlak Wnt w HEK293T komórkach poprzez modulację funkcji proteasomu w celu spowolnienia degradacji β-kateniny17. Ten wgląd pozwala na wykorzystanie reporterów szlaku Wnt jako wydajnej i szybkiej metody identyfikacji wariantów zarówno straty, jak i wzmocnienia funkcji Ube3a18. Poniższy protokół szczegółowo opisuje metodę generowania wariantów Ube3a, a także reporter oparty na lucyferazie do oceny zmian w aktywności wariantów Ube3a.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Drabinka DNA</td><td>Lambda Biotech</td><td>M108-S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp Drabinka DNA</td><td>Lambda Biotech</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor do ligazy DNA T4 z 10 mM ATP</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion HF Bufor reakcyjny</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Corning</td><td>30004CI</td><td></td></tr><tr><td>Czarno-biały Isoplate-96 ramka Biała płytka studzienkowa</td><td>PerkinElmer</td><td>6005030</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Sól disodowa</td><td>Midwest Scientific</td><td>KCC46000-5</td><td></td></tr><tr><td>Komora do liczenia komórek hrabiny&nbsp; Szkiełka</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina II Automatyczny licznik komórek&nbsp;</td><td>technologie</td><td></td> życiowe <td>Maszyna do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Niestandardowe oligonukleotydy DNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoxynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworów</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td>Podłoże podstawowe wspomagające wzrost linii komórkowej</td></tr><tr><td>HEK293T DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>System testowy reporterowy z podwójną lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Fisherbrand Naczynia do hodowli tkankowych poddanych obróbce powierzchniowej</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 Odczynnik do transfekcji</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel Fioletowy (6x)</td><td>New England BioLabs</td><td>Komórki HEK293T B7024A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Wysoka wydajność ig 10B Chemicznie kompetentne komórki</td><td>Nienaruszona genomika</td><td>1011-12</td><td>E. coli Komórki DH10B</td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td>Midi prep</td></tr><tr><td>pCIG2 plazmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pGL3 BAR plazmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF DNA Polimeraza</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>Polimeraza DNA</td></tr><tr><td>ProFlex 3 x 32-dołkowy system PCR</td><td>Stosowane biosystemy przez technologie</td><td></td> życia <td>Termocykler</td></tr><tr><td>pTK Plazmid</td><td></td><td></td><td></td>Renilla</tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Mini prep</td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu (250)</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Oczyszczanie żelu</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Oczyszczanie PCR</td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3156S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Synergy HTX Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>&nbsp; Czytnik płytek uruchamia oprogramowanie Gen5 v3.08 (BioTek)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x roztwór, elektroforeza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13324</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate 96 dołków, płaskie dno</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromek Solution</td><td>Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15585011</tr><tr><td>Enzym restrykcyjny</td> <td>XmaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0180S</td></tr></tbody></table>

skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów ube3a

A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants

Zwiększone wykorzystanie sekwencjonowania w medycynie zidentyfikowało miliony wariantów kodujących w ludzkim genomie. Wiele z tych wariantów występuje w genach związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi, ale znaczenie funkcjonalne zdecydowanej większości wariantów pozostaje nieznane. Niniejszy protokół opisuje badanie wariantów Ube3a, genu kodującego ligazę ubikwityny E3 związaną zarówno z autyzmem, jak i zespołem Angelmana. Duplikacja lub potrojenie genu Ube3a jest silnie związane z autyzmem, podczas gdy jego delecja powoduje zespół Angelmana. W związku z tym zrozumienie walencji zmian w aktywności białka UBE3A jest ważne dla wyników klinicznych. W tym miejscu opisano szybką, opartą na komórkach metodę, która łączy warianty Ube3a z reporterem ścieżki Wnt. Ten prosty test jest skalowalny i może być wykorzystany do określenia wartościowości i wielkości zmian aktywności w dowolnym wariancie Ube3a. Co więcej, łatwość tej metody pozwala na generowanie wielu informacji o strukturze i funkcji, które można wykorzystać do uzyskania głębokiego wglądu w mechanizmy enzymatyczne UBE3A.

Wielkoskalowy screening funkcjonalny wariantów missense Ube3a identyfikuje szerokie spektrum mutacji prowadzących do utraty i nabycia funkcji 
Poprzednie prace z mutantami Ube3a sugerowały, że odpowiedź na sygnały Wnt może służyć jako reporter aktywności białka UBE3A w komórce. Obserwacje te zostały rozszerzone, a dodatkowe eksperymenty walidacyjne przeprowadzono w celu zbadania, czy test BAR nadaje się do raportowania zakresu aktywności UBE3A w komórce. Najpierw komórki HEK293T prze...

Opracowano prostą i skalowalną metodę oceny funkcjonalnego znaczenia wariantów missense w Ube3a, genie, którego utrata i zysk funkcji są związane zarówno z zespołem Angelmana, jak i zaburzeniem ze spektrum autyzmu.

Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A

The increased use of sequencing in medicine has identified millions of coding variants in the human genome. Many of these variants occur in genes ...

Nasza metoda zapewnia szybki sposób na zrozumienie funkcjonalnego wpływu wariantów w Ube3a, ligazie ubikwityny, która powoduje zespół Angelmana i jest silnie związana z genetyczną formą autyzmu znaną jako zespół Dup15q. Charakterystyka aktywności ligazy ubikwityny jest tradycyjnie pracochłonna i powolna, a takie metody są trudne i nie pozwalają scharakteryzować setek wariantów zidentyfikowanych dla Ube3a. Zespół Angelmana jest spowodowany delecją matczynego genu Ube3a, podczas gdy zespół Dup15q jest spowodowany duplikacją matczynego genu Ube3a, dlatego ważne jest, aby wywnioskować, w jaki sposób warianty missense zmieniły aktywność enzymu Ube3a, a to jest coś, co jest trudne do zrobienia bez empirycznego testowania każdego wariantu.Procedurę zademonstruje Jalin Stelzer, technik badawczy w moim laboratorium. Rozpocznij od przeprowadzenia testów na HEK293T komórkach, wyhodowanych w zmodyfikowanym podłożu Eagle Medium firmy Dulbecco w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla w nawilżonym pojemniku, zgodnie z opisem w manuskrypcie. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść zawieszone HEK293T komórki na 96-dołkowej płytce płaskodennej poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni.Drugiego dnia przetransfekować komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego plazmidami reporterowymi lucyferazy Firefly i Renilla oraz plazmidami Ube3a w trzech egzemplarzach. Wykonaj transfekcje w całkowitej objętości 10 mikrolitrów na studzienkę. Stwórz mieszankę wzorcową do transfekcji dla każdego wariantu w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Po inkubacji delikatnie wymieszaj mieszaninę transfekcji, stukając w rurkę, a następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej bezpośrednio do istniejących pożywek wzrostowych w studzienkach. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora i pozwól plazmidom na ekspresję przez 48 godzin. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego monitorować wydajność transfekcji za pomocą fluorescencji GFP.Ponad 80% komórek powinno wykazywać ekspresję GFP po 48 godzinach. Ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną z transfekowanych komórek HEK293T, a następnie umyć komórki zimnym PBS. Zassać PBS.Dodaj 25 mikrolitrów niedenaturującego buforu do lizy komórek i inkubuj przez 15 minut na lodzie z delikatnym kołysaniem. Następnie dodaj 20 mikrolitrów powstałego lizatu do nowej 96-dołkowej płytki testowej zawierającej 100 mikrolitrów odczynnika substratu lucyferazy świetlików i delikatnie wymieszaj płytkę, stukając. Załaduj płytkę do czytnika płytek i zmierz luminescencję za pomocą górnego detektora o wysokości odczytu jednego milimetra i czasie integracji wynoszącym jedną sekundę.Natychmiast po odczytaniu luminescencji lucyferazy świetlika dodaj 100 mikrolitrów substratu lucyferazy Renilla do studzienek, co wygasza aktywność lucyferazy świetlika, jednocześnie oceniając aktywność lucyferazy Renilla. Wymieszać próbki przez delikatne mieszanie płytki i ponownie zmierzyć luminescencję, aby ocenić aktywność lucyferazy Renilla. Porównaj względną aktywność białek wariantowych, określając ilościowo odpowiedzi reporterowe i normalizując wartość Firefly i Renilla dla każdego wariantu w stosunku do dzikiego typu Ube3a.HEK293T komórki transfekowane coraz większą ilością plazmidu kodującego Ube3a typu dzikiego wykazują liniowy wzrost odpowiedzi BAR. Test BAR identyfikuje warianty plazmidów związane z chorobą, wykazując dokładność i ogólność tej metody. Badanie przesiewowe BAR dla 152 wariantów Ube3a wykazuje łagodną utratę funkcji i wzmocnienie mutacji funkcji w stosunku do Ube3a typu dzikiego.Wzrost funkcji substytucji glutaminianu, utrata funkcji substytucji proliny i kolejna utrata funkcji substytucji argininy w pozycji 588 Ube3a wywołały drastycznie różne efekty, podkreślając w ten sposób znaczenie empirycznej oceny wariantu. Wykres cieplny pokazuje znormalizowane wyniki BAR dla kompleksowej analizy mutacji w pozycji 588 w Ube3a. Białe cieniowanie reprezentuje poziomy aktywności Ube3a typu dzikiego, niebieskie cieniowanie wskazuje na utratę funkcji, a czerwone cieniowanie wskazuje na wzmocnienie mutacji funkcji.Poza implikacjami klinicznymi naszej pracy, Ube3a należy do rodziny ligazów ubikwityny w domenie HECT, z których wszystkie posiadają konserwatywną domenę katalityczną HECT. Myślę, że jednym z fascynujących aspektów naszej pracy jest to, że dostarcza ona bogatych danych o funkcjach strukturalnych Ube3a, które mogą być wykorzystane do uzyskania głębszego zrozumienia mechanistycznego dla tej klasy enzymów.

a-scalable-cell-based-method-for-functional-assessment-ube3a

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj skalowalną metodę oceny funkcjonalnej wariantów Ube3a w komórkach HEK293T przy użyciu testów lucyferazowych. To podejście umożliwia szybką identyfikację mutacji typu gain-of-function i loss-of-function związanych z zespołem Angelmana i autyzmem.

Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A

Przeglądaj więcej filmów