Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A

Nasza metoda zapewnia szybki sposób na zrozumienie funkcjonalnego wpływu wariantów w Ube3a, ligazie ubikwityny, która powoduje zespół Angelmana i jest silnie związana z genetyczną formą autyzmu znaną jako zespół Dup15q. Charakterystyka aktywności ligazy ubikwityny jest tradycyjnie pracochłonna i powolna, a takie metody są trudne i nie pozwalają scharakteryzować setek wariantów zidentyfikowanych dla Ube3a. Zespół Angelmana jest spowodowany delecją matczynego genu Ube3a, podczas gdy zespół Dup15q jest spowodowany duplikacją matczynego genu Ube3a, dlatego ważne jest, aby wywnioskować, w jaki sposób warianty missense zmieniły aktywność enzymu Ube3a, a to jest coś, co jest trudne do zrobienia bez empirycznego testowania każdego wariantu.

Procedurę zademonstruje Jalin Stelzer, technik badawczy w moim laboratorium. Rozpocznij od przeprowadzenia testów na HEK293T komórkach, wyhodowanych w zmodyfikowanym podłożu Eagle Medium firmy Dulbecco w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla w nawilżonym pojemniku, zgodnie z opisem w manuskrypcie. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść zawieszone HEK293T komórki na 96-dołkowej płytce płaskodennej poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni.

Drugiego dnia przetransfekować komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego plazmidami reporterowymi lucyferazy Firefly i Renilla oraz plazmidami Ube3a w trzech egzemplarzach. Wykonaj transfekcje w całkowitej objętości 10 mikrolitrów na studzienkę. Stwórz mieszankę wzorcową do transfekcji dla każdego wariantu w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Po inkubacji delikatnie wymieszaj mieszaninę transfekcji, stukając w rurkę, a następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej bezpośrednio do istniejących pożywek wzrostowych w studzienkach. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora i pozwól plazmidom na ekspresję przez 48 godzin. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego monitorować wydajność transfekcji za pomocą fluorescencji GFP.

Ponad 80% komórek powinno wykazywać ekspresję GFP po 48 godzinach. Ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną z transfekowanych komórek HEK293T, a następnie umyć komórki zimnym PBS. Zassać PBS.

Dodaj 25 mikrolitrów niedenaturującego buforu do lizy komórek i inkubuj przez 15 minut na lodzie z delikatnym kołysaniem. Następnie dodaj 20 mikrolitrów powstałego lizatu do nowej 96-dołkowej płytki testowej zawierającej 100 mikrolitrów odczynnika substratu lucyferazy świetlików i delikatnie wymieszaj płytkę, stukając. Załaduj płytkę do czytnika płytek i zmierz luminescencję za pomocą górnego detektora o wysokości odczytu jednego milimetra i czasie integracji wynoszącym jedną sekundę.

Natychmiast po odczytaniu luminescencji lucyferazy świetlika dodaj 100 mikrolitrów substratu lucyferazy Renilla do studzienek, co wygasza aktywność lucyferazy świetlika, jednocześnie oceniając aktywność lucyferazy Renilla. Wymieszać próbki przez delikatne mieszanie płytki i ponownie zmierzyć luminescencję, aby ocenić aktywność lucyferazy Renilla. Porównaj względną aktywność białek wariantowych, określając ilościowo odpowiedzi reporterowe i normalizując wartość Firefly i Renilla dla każdego wariantu w stosunku do dzikiego typu Ube3a.

HEK293T komórki transfekowane coraz większą ilością plazmidu kodującego Ube3a typu dzikiego wykazują liniowy wzrost odpowiedzi BAR. Test BAR identyfikuje warianty plazmidów związane z chorobą, wykazując dokładność i ogólność tej metody. Badanie przesiewowe BAR dla 152 wariantów Ube3a wykazuje łagodną utratę funkcji i wzmocnienie mutacji funkcji w stosunku do Ube3a typu dzikiego.

Wzrost funkcji substytucji glutaminianu, utrata funkcji substytucji proliny i kolejna utrata funkcji substytucji argininy w pozycji 588 Ube3a wywołały drastycznie różne efekty, podkreślając w ten sposób znaczenie empirycznej oceny wariantu. Wykres cieplny pokazuje znormalizowane wyniki BAR dla kompleksowej analizy mutacji w pozycji 588 w Ube3a. Białe cieniowanie reprezentuje poziomy aktywności Ube3a typu dzikiego, niebieskie cieniowanie wskazuje na utratę funkcji, a czerwone cieniowanie wskazuje na wzmocnienie mutacji funkcji.

Poza implikacjami klinicznymi naszej pracy, Ube3a należy do rodziny ligazów ubikwityny w domenie HECT, z których wszystkie posiadają konserwatywną domenę katalityczną HECT. Myślę, że jednym z fascynujących aspektów naszej pracy jest to, że dostarcza ona bogatych danych o funkcjach strukturalnych Ube3a, które mogą być wykorzystane do uzyskania głębszego zrozumienia mechanistycznego dla tej klasy enzymów.