Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Ta metoda pozwala nam zaprojektować hydrożele kolagenowe 3D z kontrolowanymi poziomami wyrównania włókien do modelowania środowisk występujących w zdrowych i chorych tkankach w organizmie. Technika ta zapewnia proste podejście mikroprzepływowe do inżynierii wyrównanych hydrożeli kolagenowych, wprowadzania komórek i ilościowego określania, jak komórki zachowują się w topograficznie zdefiniowanych środowiskach 3D. Procedurę zademonstrują Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly i Justin Vidas z mojego laboratorium.

Na początek zamontuj arkusz PDMS o grubości 250 mikrometrów na plastikowym nośniku i przetnij brzytwą konstrukcję mikroprzepływową za pomocą noża rzemieślniczego o głębokości ostrza 0,5 milimetra, prędkości jednego centymetra na sekundę i dużej siły. Za pomocą kąpieli ultradźwiękowej czyść wycięcia kanałów mikroprzepływowych przez pięć minut. Opłucz sonikowane kanały w wodzie dejonizowanej i wysusz je na gorącej płycie w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Przechowuj kanały na czystej, przykrytej szalce Petriego do czasu użycia. Aby wytworzyć warstwę wierzchnią PDMS i funkcjonalizować powierzchnię do przyszłej modyfikacji, przygotuj 2% roztwór 2% aminopropylotrietoksysilanu w szklanej zlewce, dodając jeden mililitr aminopropylotrietoksysilanu do 49 mililitrów acetonu. Następnie rozcieńczyć 25% roztwór aldehydu glutarowego do 5% w wodzie dejonizowanej.

Przygotuj dwa mililitry roztworu na każde 24 milimetry na 50 milimetrów szkiełka nakrywkowego. Wyczyść szkiełka nakrywkowe w sonografie kąpielowym przez pięć minut za pomocą IPA. Spłucz IPA ze szkiełek nakrywkowych wodą dejonizowaną.

Gładka warstwa wody na szkiełku nakrywkowym wskazuje, że IPA jest dokładnie wypłukany. Suszyć szkiełka nakrywkowe na gorącej płycie przez pięć minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Umieść wysuszone szkiełka przykrywkowe na czystych szalkach Petriego, upewniając się, że nie zachodzą na siebie.

Za pomocą różdżki do wyładowań koronowych wystawij szkiełka nakrywkowe na działanie wyładowania koronowego przez jedną minutę każda. Usuń szkiełka nakrywkowe w ciągu pięciu minut od ekspozycji na koronę i zanurz każde szkiełko nakrywkowe w roztworze aminopropylotrietoksysilanu na 10 sekund, upewniając się, że szkiełko nakrywkowe jest zanurzone Następnie usuń szkiełka nakrywkowe z roztworu aminopropylotrietoksysilanu, zanurz je w acetonie na 10 sekund i wysusz sprężonym powietrzem. Umieść suchą szkiełko pokrywy z powrotem na szalce Petriego, stroną poddaną działaniu środka skierowaną do góry.

Odpipetować jeden mililitr roztworu aldehydu glutarowego na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego. Przykryj jak największą powierzchnię, nie dopuszczając do rozlania się roztworu poza krawędź szkiełka nakrywkowego. Pozostaw szkiełka nakrywkowe w kontakcie z roztworem przez 30 minut, a następnie spłucz wodą dejonizowaną przez 20 sekund.

Wysuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą sprężonego powietrza i umieścić je z powrotem na szalkach Petriego, stroną poddaną obróbce plazmowej do góry W przypadku cięcia laserowego modułowej podstawy magnetycznej należy wyciąć wzory z warstwy PMMA za pomocą odpowiednich ustawień lasera, takich jak liczba przejść i moc. Ustawienia lasera należy dostosować tak, aby magnesy mogły być wciskane w warstwę PMMA. Umyj wyciętą laserowo część wodą z mydłem, aby usunąć zanieczyszczenia z procesu cięcia laserowego.

Nie używaj rozpuszczalników, ponieważ mogą one powodować powstawanie mikropęknięć na krawędziach wycinanych laserowo. Aby zmontować platformę, należy ręcznie wepchnąć magnesy do wyciętej laserowo podstawy. Grubość magnesów musi być mniejsza niż grubość podstawy PMMA, aby zapewnić, że magnesy są równo z powierzchnią podstawy.

Oderwij podkład od kleju samoprzylepnego lub arkusza PSA i przymocuj podstawę do szkiełka nakrywkowego nasączonego aldehydem glutarowym funkcjonalizowaną stroną skierowaną do góry. Delikatnie umieść wycięcie kanału PDMS we wnęce zdefiniowanej przez ramkę. Dociśnij pęsetą z szeroką końcówką, aby usunąć pęcherzyki powietrza i zapewnić konforemny kontakt.

Umieść albuminę surowicy bydlęcej lub osłonę kanału poddaną działaniu BSA na górze wycięcia kanału stroną BSA skierowaną w dół. Upewnij się, że porty wlotowe i wylotowe płynu są wyrównane z kanałem. Urządzenie jest gotowe do iniekcji kolagenu I.

Umieść pompę strzykawkową, schłodzoną sterylną strzykawkę, schłodzony zneutralizowany roztwór kolagenu I i sterylną igłę Luer Lock o rozmiarze 20 stopni i kącie 90 stopni w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Załaduj roztwór kolagenu I do strzykawki, unikając pęcherzyków. Przymocować końcówkę igły do strzykawki, załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej igłą skierowaną w dół i zalać igłę roztworem kolagenu I.

Ustawić pompę strzykawkową na wymagane natężenie przepływu w zakresie od 50 do 2 000 mikrolitrów na minutę. Umieść przygotowane kanały PDMS na podnośniku laboratoryjnym i wyrównaj z igłą. Włóż igłę do portu wlotowego kanału PDMS.

Wstrzykuj kanał, aż 30-mikrolitrowa kropla kolagenu I zbierze się po stronie wylotu. Opuść podnośnik laboratoryjny i delikatnie oddziel igłę od nowo napełnionego kanału. Powtarzaj, aż wszystkie kanały zostaną wypełnione roztworem kolagenu I.

Załaduj wypełnione kanały do szalek Petriego wraz z czystą, niestrzępiącą się chusteczką nasączoną wodą dejonizowaną, aby zapobiec odwodnieniu nowo powstałego żelu kolagenowego I. Przykryj szalkę Petriego i umieść załadowane kanały w inkubatorze na dwie godziny przed etapem odklejania. W celu zrównoważenia odklejania i podłoża zacznij od zdjęcia pokrywy PDMS za pomocą pęsety, aby odsłonić spolimeryzowany żel kolagenowy I.

Dodaj 650 mikrolitrów pożywki do wzrostu śródbłonka do studzienki. Alternatywnie podłącz inny moduł, aby wprowadzić dodatkową warstwę kolagenu lub zapewnić możliwości perfuzji mediów. Pozostawić urządzenia w inkubatorze na co najmniej cztery godziny w celu zrównoważenia żelu i pożywki.

Zastąp pożywkę przed wysiewem komórkami. Funkcjonalizacja szklanej pokrywy umożliwiła podniesienie kanału i funkcjonalizacja pokrywy PDMS za pomocą BSA zapobiegła przyczepianiu się kolagenu I. Wyrównanie włókien kolagenu I pozostało nienaruszone po zdjęciu pokrowca.

Obrazy HUVEC hodowanych na wyrównanym segmencie matrycy wykazały zwiększone wyrównanie włókien aktynowych w porównaniu z HUVEC na segmencie z losowymi włóknami. Nasze podejście pozwala nam modelować mikrośrodowisko guza i ilościowo określać, jak reagują różne typy komórek. Możemy również wprowadzić kanały przepływowe, które będą wspierać długoterminowe eksperymenty.