Name: Ekstrakcja Lumikanu z błony owodniowej i określenie jej temperatury przechowywania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji lumikanu z błony owodniowej i określenia optymalnej temperatury przechowywania. Protokół obejmuje mielenie w ciekłym azocie i analizę stabilności białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Przeglądową (projekt nr CEI-2020/06/04). Błona pozapłodowa (AM) została pobrana z banku błon pozapłodowych Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana (od zanonimizowanych dawców ludzkich) i przygotowana zgodnie z opisem Chávez-García i wsp.17.
1. Przygotowanie ekstraktu z błony płodowej
<ol>
	<li>Pobrać 100 mg AM z banku błony owocowej. 
	UWAGA: Zgodnie z poprzednim raportem, 50 mg AM wydziela łącznie 10 ng/ml lumikanu14Aby uzyskać wyższe stężenie lumikanu, należy użyć 100 mg AM, co odpowiada całkowitej powierzchni 32 cm²2.</li>
	<li>Jeśli AM jest zamrożone, należy go rozmrozić w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Poniższe procedury należy przeprowadzać w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza klasy II B.</li>
	<li>Wypłucz błonę przezroczystą (AM) w naczyniu Petriego za pomocą 10 ml sterylnego zrównoważonego roztworu soli (BSS, patrz Tabela materiałów) przez 2 min.
	<ol>
		<li>Nalać BSS do zlewki.</li>
		<li>Powtórz krok 3 i potwierdź wizualnie, że w szalce Petriego BSS nie ma pożywki glicerynowej. 
		UWAGA: Powtarzać krok 3. w razie potrzeby, aż do momentu, gdy w szalce Petriego BSS nie będzie obecne medium glicerolowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować AM z 10 ml dyspazy II (1,7 IU/ml, patrz Tabela materiałów) w 37 °C, 5% CO22 przez 30 min. 
	UWAGA: Dispase II jest neutralną proteazą o łagodnym działaniu na komórki nabłonkowe. Enzym ten skutecznie oddziela nienaruszoną warstwę naskórka od skóry właściwej i pozwala na wyizolowanie nieuszkodzonych płatów nabłonka.18.</li>
	<li>Po inkubacji z dispazą należy przeprowadzić mechaniczną deepitelizację.14 za pomocą gumowego korka typu „policeman” (patrz Tabela materiałów). Potwierdzić odepitelizację za pomocą wizualizacji mikroskopowej. 
	UWAGA: Proces usuwania nabłonka (deepitelizacji) potwierdza się przy użyciu mikroskopu odwróconego z obiektywami 4x i 20x. Należy zwizualizować tkankę, aby wykluczyć obecność jakiejkolwiek warstwy komórkowej.</li>
	<li>Przemyj AM w szalce Petriego, używając 10 ml BSS przez 2 min. Przelej BSS do zlewki.</li>
	<li>Umieść odepitelializowaną błonę pławy płodowej (dAM) w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml. Zanurz dAM w ciekłym azocie na 40 min.</li>
	<li>Ręcznie utrzeć zamrożone dAM przez 2-3 min w schłodzonym wcześniej moździerzu w temperaturze -85 °C aż do uzyskania drobnego proszku.</li>
	<li>W moździerzu rozpuścić proszek dAM w 2,5 ml roztworu inhibitorów proteaz (BSS z inhibitorami proteaz). 
	UWAGA: Każda tabletka inhibitora proteaz składa się z następującej mieszaniny enzymów: ekstraktu z trzustki (0,02 mg/ml), termolizyny (metaloproteazy) (0,0005 mg/ml), chymotrypsyny (0,002 mg/ml), trypsyny (0,02 mg/ml) oraz papainy (0,33 mg/ml) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pobrać mieszaninę za pomocą mikropipety, a ściany moździerza oczyścić przy użyciu skalpela. Umieścić mieszaninę w probówce o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Wymieszać dokładnie za pomocą wibratora laboratoryjnego przez 30 s.</li>
	<li>Zhomogenizować mieszaninę tkanek, wirując z prędkością 34 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C i niezwłocznie odwiruj przy 3360 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrany supernatant stanowi AME (Rycina 1). Przechowywać 0,7 ml każdego AME w oddzielnych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml przez 6, 12, 20 i 33 dni w różnych warunkach temperatury -20 °C, 4 °Coraz temperatura pokojowa (RT).</li>
</ol>
<img alt="Metoda enzymatycznej dezepitelializacji; schemat przygotowania błony płodowej; oznaczanie ilości białka metodą ELISA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64460/64460fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Proces przygotowania AME i pomiar stężenia lumikanu. 100 mg AM inkubowano z dyspazą II w temperaturze 37 °C przez 30 min, a następnie poddano mechanicznej dezepitelializacji. Dezepitelializowaną AM przemyto i zanurzono w ciekłym azocie na 40 min, a następnie rozkruszono do uzyskania drobnego proszku, który rozpuszczono w 2,5 mL buforu solnego z inhibitorami proteaz i odwirowano. Nadpływ zebrano i przechowywano w temperaturach -20 °C, 4 °C oraz RT przez odpowiednio 6, 12, 20 i 32 dni do czasu ilościowego oznaczenia całkowitego białka i lumikanu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64460/64460fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Oznaczanie ilości białka AME
UWAGA: Oznaczenie całkowitej zawartości białka w AME musi zostać przeprowadzone niezwłocznie po jego uzyskaniu. Ilość białka należy oznaczyć za pomocą metody Lowry, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Zaleca się, aby wszystkie standardy i próbki analizować w trzech powtórzeniach.
<ol>
	<li>Do mikro płytki 96-dołkowej nanieś pipetą 40 µL każdej próbki AME.
	<ol>
		<li>Przygotuj krzywą wzorcową w tej samej mikro płytce, używając standardu albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby uzyskać końcowe stężenia BSA w zakresie 0-1 500 µg/mL (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1 000 i 1 500 µg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do każdego dołka nanieś pipetą 200 µL zmodyfikowanego odczynnika Lowry’ego. Natychmiast wymieszaj na mieszalniku do płytek przez 30 s.</li>
	<li>Przykryj mikro płytkę folią aluminiową i inkubuj w RT przez 10 min.</li>
	<li>Do każdego dołka nanieś pipetą 20 µL 1x odczynnika Folina-Ciocalteu. Natychmiast wymieszaj na mieszalniku do płytek przez 30 s. 
	UWAGA: Aby przygotować 1x odczynnik Folina-Ciocalteu, rozcieńcz odczynnik 2x (2N) w stosunku 1:1 wodą ultrapure. Przygotuj 1x odczynnik Folina-Ciocalteu w dniu użycia, ponieważ rozcieńczony odczynnik jest niestabilny.</li>
	<li>Przykryj mikro płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, i inkubuj w RT przez 30 min.</li>
	<li>Zmierz absorbancję próbek przy 660 nm za pomocą spektrometru do płytek ELISA (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Barwę można mierzyć przy długościach fal od 650 nm do 750 nm.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość absorbancji przy 660 nm dla próbek kontrolnych (blank) i odejmij ją od pozostałych wartości absorbancji przy 660 nm dla standardów oraz próbek nieznanych.
	<ol>
		<li>Zmierz absorbancję spektrometrem do płytek ELISA w trybie końcowym (endpoint) z lekkim wstrząsaniem przez 10 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystaj krzywą wzorcową do wyznaczenia stężenia białka w każdej nieznanej próbce.</li>
	<li>W celu obliczenia ilości białka wyznacz stężenie z wykresu regresji liniowej, nanosząc wartości absorbancji na oś Y i stężenia w mg/mL na oś X dla każdej krzywej wzorcowej BSA.
	<ol>
		<li>Wyznacz równanie regresji liniowej oraz wartość r, aby obliczyć stężenie białka. 
		UWAGA: Wyniki są wyrażone jako znormalizowane względne wartości stężenia całkowitego białka w stosunku do mg AM (µg/mL białka/mg tkanki AM).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie lumikanu w AME
UWAGA: Stężenie lumikanu musi zostać zmierzone w AME przechowywanym w różnych warunkach i przez różne okresy czasu. Ilość lumikanu należy określić za pomocą metody sandwich ELISA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zaleca się, aby wszystkie wzorce i próbki analizować w dubletach.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć ludzkie przeciwciało wychwytujące lumican (patrz Tabela materiałów) do stężenia roboczego w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). 
	UWAGA: Fiolka z przeciwciałem wychwytującym zawiera 120 µg przeciwciała. Po rekonstytucji w 0,5 mL PBS należy rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące do stężenia roboczego 2 µg/mL.
	<ol>
		<li>Bezzwłocznie nanieść pipetą 100 µL rozcieńczonego przeciwciała wychwytującego do każdego dołka mikropłytki 96-dołkowej. Przykryć płytkę i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odssać zawartość każdego dołka i przemyć go, naniosając pipetą 300 µL buforu do mycia: 0,05% polyoxyethylene sorbitan monolaurate 20 w PBS, pH 7,2-7,4 (patrz Tabela materiałów) za pomocą pipety wielokanałowej. Powtórzyć trzy razy. 
	UWAGA: Po ostatnim myciu usunąć resztki buforu do mycia, odwracając płytkę i delikatnie uderzając nią o ręczniki papierowe.</li>
	<li>Zablokować płytki, dodając 300 µL rozcieńczalnika odczynników: 1% BSA w PBS, pH 7,2-7,4, filtrowanego przez membranę 0,2 µm (patrz Tabela materiałów) do każdego dołka. Inkubować w RT przez 1 h.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.</li>
	<li>Przygotować krzywą wzorcową na mikropłytce 96-dołkowej, stosując dwukrotne rozcieńczenia seryjne w zakresie 0-8 000 pg/mL, aby uzyskać stężenia końcowe: 125, 250, 500, 1 000, 2 000, 4 000 i 8 000 pg/mL. Zestaw ELISA do oznaczania lumicanu zawiera rekombinowany standard lumicanu o masie 75 ng (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Nanieść 100 µL próbek oraz serii rozcieńczeń krzywej wzorcowej na mikropłytkę 96-dołkową pokrytą przeciwciałem wychwytującym.</li>
	<li>Przykryć mikropłytkę i inkubować przez 2 h w RT przy słabym mieszaniu na kompaktowym wytrząsarce (rocker) przy prędkości 2-3 rpm.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.</li>
	<li>Dodać 100 µL biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego (patrz Tabela materiałów) do każdego dołka. Chronić przed światłem i inkubować przez 2 h w RT przy słabym mieszaniu na kompaktowej wytrząsarce przy prędkości 2-3 rpm. 
	UWAGA: Fiolka z biotynilowanym przeciwciałem detekcyjnym zawiera 24 µg przeciwciała. Po rekonstytucji w 1,0 mL rozcieńczalnika odczynników należy rozcieńczyć biotynilowane przeciwciało detekcyjne do stężenia roboczego 400 ng/mL.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.</li>
	<li>Dodać 100 µL roboczego rozcieńczenia streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP, patrz Tabela materiałów) do każdego dołka. Chronić mikropłytkę przed światłem i inkubować przez 20 min w RT. 
	UWAGA: Aktywna streptawidyna-HRP była stężona 40-krotnie. Roztwór roboczy 1x streptawidyny-HRP przygotowano w rozcieńczalniku odczynników. 
	UWAGA: Unikać wystawiania płytki na bezpośrednie działanie światła.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.</li>
	<li>Na koniec dodać 100 µL roztworu substratu tetrametylobenzydyny (TMB, patrz Tabela materiałów) do każdego dołka. 
	UWAGA: Roztwór TMB należy przygotować z taką samą objętością stabilizowanego 30% roztworu nadtlenku wodoru dostarczonego w zestawie. 
	UWAGA: Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować przez 30 min w RT w ciemnym miejscu. 
	UWAGA: Unikać wystawiania płytki na bezpośrednie działanie światła. Nie odsysać roztworu TMB, ponieważ dalsze mycie nie jest wymagane.</li>
	<li>Dodać 50 µL 1N roztworu stopującego H2SO4, aby zatrzymać reakcję kolorymetryczną. Delikatnie uderzyć płytką, aby zapewnić dokładne wymieszanie.</li>
	<li>Niezwłocznie zmierzyć absorbancję każdego dołka za pomocą czytnika mikropłytek ustawionego na 450 nm w spektrometrze do płytek ELISA.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję spektrometrem do płytek ELISA w trybie punktu końcowego (endpoint) przy słabym wstrząsaniu przez 10 s.</li>
	<li>Obliczyć średnią wartość absorbancji przy 450 nm dla próbek ślepych wzorca i odjąć ją od pozostałych wartości przy 450 nm dla próbek wzorców i próbek nieznanych.</li>
	<li>Wykorzystać krzywą wzorcową do wyznaczenia stężenia lumicanu w każdej nieznanej próbce.</li>
	<li>W celu obliczenia stężenia lumicanu sporządzić wykres regresji liniowej, nanosząc wartości absorbancji na oś Y oraz stężenia w pg/mL na oś X dla każdej krzywej wzorcowej lumicanu.
	<ol>
		<li>Wyznaczyć równanie regresji liniowej oraz wartość r w celu obliczenia stężenia lumicanu. 
		UWAGA: Stężenie lumicanu znormalizowano względem masy wyekstrahowanej tkanki w mg. Wyniki wyrażono jako znormalizowane względne wartości stężenia lumicanu na mg AM (ng/mL lumicanu/mg tkanki AM).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jirsova, K., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+in+ophthalmology%3A+properties%2C+preparation%2C+storage+and+indications+for+grafting-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).</li>
<li>Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+human+cryopreserved+viable+amniotic+membrane+in+a+pro-inflammatory+environment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).</li>
<li>Ruiz-Cañada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+stimulates+cell+migration+by+modulating+transforming+growth+factor-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).</li>
<li>Yeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+lumican+glycoprotein+purified+from+human+amniotic+membrane+promotes+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479(2005).</li>
<li>Navas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Inflammatory+and+anti-fibrotic+effects+of+human+amniotic+membrane+mesenchymal+stem+cells+and+their+potential+in+corneal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).</li>
<li>Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+membrane+mesenchymal+stem+cells+inhibit+neutrophil+extracellular+traps+through+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6.</a> Scientific Reports. 7, 12426(2017).</li>
<li>Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+is+an+immunosuppressor+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Investigations%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells.</a> Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).</li>
<li>Koob, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+dehydrated+human+amnion%2Fchorion+composite+graft%3A+implications+for+chronic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing.</a> International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).</li>
<li>Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hepatocyte+growth+factor+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).</li>
<li>Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+corneal+stroma+extracellular+matrix+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly.</a> Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).</li>
<li>Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumican+as+a+multivalent+effector+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Lumican as a multivalent effector in wound healing.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).</li>
<li>Theocharis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+interactions%3A+focus+on+proteoglycan-proteinase+interplay+and+pharmacological+targeting+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer.</a> FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).</li>
<li>Saika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lumican+in+the+corneal+epithelium+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).</li>
<li>Domínguez-López, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+conditioned+medium+%28AMCM%29+reduces+inflammatory+response+on+human+limbal+myofibroblast%2C+and+the+potential+role+of+lumican%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican.</a> Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).</li>
<li>Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumican+regulates+corneal+inflammatory+responses+by+modulating+Fas-Fas+Ligand+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88(2005).</li>
<li>Mahbod, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+extract+preparation%3A+What+is+the+best+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmic+and+Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane extract preparation: What is the best method.</a> Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).</li>
<li>Chávez-García, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ophthalmic+indications+of+amniotic+membrane+transplantation+in+Mexico%3A+an+eight+years+Amniotic+Membrane+Bank+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience.</a> Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+during+freezing%3A+separation+of+stresses+and+mechanisms+of+protein+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Development+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).</li>
<li>McClain, A. K., McCarrel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+four+different+freezing+conditions+and+time+in+frozen+storage+on+the+concentration+of+commonly+measured+growth+factors+and+enzymes+in+equine+platelet-rich+plasma+over+six+months%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 292(2019).</li>
<li>Tamhane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+amniotic+membrane+transplantation+as+an+adjunct+to+medical+therapy+as+compared+with+medical+therapy+alone+in+acute+ocular+burns%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns.</a> Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).</li>
<li>Shtein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum-based+eye+drops+for+treatment+of+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease.</a> Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).</li>
<li>Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effect+of+amniotic+membrane+suspension+and+autologous+serum+on+alkaline+corneal+epithelial+wound+healing+in+the+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model.</a> Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).</li>
<li>Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+amniotic+membrane+transplantation+for+the+treatment+of+corneal+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers.</a> Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+transplantation+for+persistent+corneal+ulcers+and+perforations+in+acute+fungal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis.</a> Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+effectiveness+between+amniotic+membrane+homogenate+and+transplanted+amniotic+membrane+in+healing+corneal+damage+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model.</a> Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).</li>
<li>Sabater, A., Perez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+use+for+management+of+corneal+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).</li>
<li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysis+of+bovine+skin%2C+its+endogenous+proteases%2C+protease+inhibitors+and+their+effects+on+quality+characteristics+of+extracted+gelatin%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin.</a> Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).</li>
<li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+extraction+from+human+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid extraction from human biological samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li>
<li>Skog, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzymatic+digestion+on+cultured+epithelial+autografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts.</a> Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).</li>
</ol>

Badanie zostało sfinansowane ze środków Programu Wsparcia Projektów Badawczych i Innowacji Technologicznych Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Grant No. PAPIIT IN203821) oraz Ministerstwa Edukacji, Nauki, Technologii i Innowacji (grant nr SECTEI 250/2019).

W niniejszej pracy analizowano obecność lumikanu w AME i jego bezpośrednią korelację z jego stabilnością w różnych warunkach przechowywania. Co ciekawe, gdy określono ilościowo całkowite stężenie białka w AME, stężenie białka wzrosło po przechowywaniu. Dowody wskazują na trzy mechanizmy, które mogą zmieniać stężenie białka w zamrożonym przechowywaniu: denaturacja na zimno, zamrożone stężenie substancji rozpuszczonych i częściowe rozwijanie struktury białka wywołane lodem19. Proces zamrażania może ...

Jednym z najczęściej stosowanych metod leczenia schorzeń rogówki jest przeszczep błony owodniowej; jednak w ostatnich latach pojawiły się nowe propozycje wykorzystania różnych składników tkanki owodniowej jako alternatywnych i uzupełniających metod leczenia. Do najczęściej badanych składników AM należą te uzyskane z ekstraktu AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM zawiera wiele rozpuszczalnych czynników, takich jak białka antyangiogenne, interleukiny (IL), tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP), białka przeciwzapalne, w których pośredniczy TSG-6, które hamują zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilów, czynniki wzrostu: naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), transformujący czynnik wzrostu (TGF) (alfa i beta), czynnik wzrostu keratynocytów (KGF), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) i lumikan, który utrzymuje przezroczystość rogówki poprzez regulację fibrylogenezy kolagenu1,2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican to mały proteoglikan bogaty w leucynę (SLRP), jeden z głównych zewnątrzkomórkowych składników kolagenazy śródmiąższowej w macierzy zrębu rogówki, odpowiedzialny za organizację włókien kolagenowych i utrzymanie przezroczystości rogówki4,10,11. Proteoglikany to cząsteczki w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które są głównymi cząsteczkami w przeprowadzaniu sygnalizacji komórkowej i utrzymywaniu homeostazy wewnątrzkomórkowej12. Doniesiono, że białka ECM napędzają komórkowe procesy proliferacji, różnicowania i migracji podczas gojenia się ran11.
Dowody wskazują na możliwy udział lumikanu w procesie reepitelializacji rogówki. Saika i wsp. w badaniu wykazali, że po uszkodzeniu rogówki lumican można wykryć w keratocytach rogówki między pierwszymi 8 godzinami a do 3 dni po urazie. Prezentując najwyższe stężenie lumikanu w drugim i trzecim dniu, ten proteoglikan jest następnie niewykrywalny w siódmym dniu13. Dane te sugerują udział lumikanu w aktywacji procesu reepitelializacji rogówki. Z drugiej strony, w innym badaniu stwierdzono, że brak lumikanu opóźnia reepitelializację; Co ciekawe, dodanie Lumican może przyspieszyć proces reepitelializacji4,11,13. Podobnie, niedawne badanie wykazało, że lumican może modulować funkcje zapalne fibroblastów rąbka rogówki14, co sugeruje rolę lumikanu jako modulatora odpowiedzi zapalnej, przeciwzwłóknieniowej i reepitelializującej. Podobnie, lumican może modulować odpowiedź rogówki poprzez interakcję z cząsteczkami sygnałowymi, takimi jak Fas-FasL. Również brak lumikanu w nokautującym modelu myszy Lum-/- wykazał, że brak sygnalizacji lumikanu uniemożliwia odpowiednią naprawę rogówki15.
Przede wszystkim ta metoda ma na celu zademonstrowanie wykonalnego i przystępnego sposobu ekstrakcji lumikanu. Dzięki tej korzystnej metodzie ekstrakcji lumikanu możliwe jest uzyskanie podobnych stężeń białek, co skraca czas przetwarzania i czyni go wygodniejszym dla badaczy w porównaniu z poprzednimi badaniami16. Co więcej, ten lumican AME może być stosowany jako adiuwant w procesach naprawy rogówki i ponownego nabłonkowania.

<table><tbody><tr><td>1 N H2SO4 roztwór zatrzymujący</td><td>R& D Systems</td><td>DY994</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L mikropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L Mikropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm szalka Petriego</td><td>Symlaboratorios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G Igła (1,2 mm x 40 mm)</td><td>BD Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>305211</tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>20 ml plastikowa strzykawka&nbsp;</td><td>BD Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>302562</tr><tr><td>20 &mu; L mikropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L mikropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka</td><td>SARSTEDT</td><td>821581</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>nie</td> dotyczy Nie <td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Membrana owodniowa</td><td>Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank</td><td></td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli</td><td>Bausch + Lomb</td><td>BSS-403802</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BioRender&nbsp;</td>Projektowanie figurek <td>BioRender</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compact Rocker</td><td>BioRad</td><td>970822DD</td><td>Mod. 5202SD-BIO</td></tr><tr><td>kompletny, wolny od EDTA, inhibitor proteazy tabletki koktajlowe</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Daiggner vortex Genie 2</td><td>A.Daigger & Co. , INC</td><td>22220A</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr płytkowy ELISA</td><td>Thermo Labsystems& nbsp;</td><td>35401106</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr> Multiscan <tr><td>GraphPad Prism&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>wersja 9</td><td>analiza statystyczna i program graficzny&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzki lumican DuoSet Zestaw ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY2846-05</td><td>zawiera inkubator przeciwciał wychwytujących Lumican dla ludzi</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>3326 S/N 36481-7002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop ze światłem odwróconym</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>6A13921</td><td>w celu potwierdzenia denabłonkowania&nbsp; Mod.CK2</td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>14753-567</td><td>Mod.1184</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Zaprawa N/A N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik azotu</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Mod. Biocan 20</td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td></td></tr><tr><td>Sola fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>R& D Systems</td><td>DY006</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Lowry'ego modyfikowany przez Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>23240</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacze do płyt</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik odczynnika</td><td>R& D Systems</td><td>DY995</td><td>1% BSA w PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 i mu; m filtrowana</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>centurion scientific Ltd&nbsp;</td><td>15877</td><td>Mod. K2015R</td></tr><tr><td>Gumowy skrobak do komórek policyjnych</td><td>NEST</td><td>710001</td><td>do mechanicznej denabłonkalizacji</td></tr><tr><td>Nóż skalpelowy</td><td>Braun</td><td>BB521</td><td>Nr 10 lub 21</td></tr><tr><td>Streptawidyna-HRP 40-krotnie skoncentrowany&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>część 893975</td><td></td></tr><tr><td>Substrate roztwór tetrametylobenzydyny (TMB)</td><td>R& D Systems</td><td>DY999</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zębata</td><td>Invent Germany</td><td>6b</td><td>inox&nbsp;</td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>PISA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania</td><td>R& D Systems</td><td>WA126</td><td>0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,2-7,4</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja lumikanu z błony owodniowej i określenie jej temperatury przechowywania

Lumican Extraction from Amniotic Membrane and Determination of its Storage Temperature

Lumican to mały, bogaty w leucynę proteoglikan w ludzkiej błonie owodniowej (AM), który wspomaga nabłonek rogówki i organizację włókien kolagenowych, utrzymując przezroczystość rogówki. W niniejszej pracy zaproponowano metodę ekstrakcji białka z AM w celu otrzymania lumikanu. Dodatkowo ocenia się stabilność lumikanu w ekstrakcie AM (AME) przechowywanym w różnych temperaturach i okresach czasu. 100 mg AM rozmrożono i mechanicznie zdeepitelializowano. Pozbawioną nabłonka AM zamrożono i rozdrobniono do uzyskania drobnego proszku, który rozpuszczono w 2,5 ml buforu soli fizjologicznej z inhibitorami proteazy i odwirowano w celu ekstrakcji białka. Supernatant pobrano i przechowywano w temperaturze -20 °C, 4 °C i temperaturze pokojowej (RT) przez 6, 12, 20 i 32 dni. Następnie lumikan oznaczono ilościowo w każdym AME. Technika ta umożliwia dostępny i możliwy do nabycia protokół ekstrakcji lumikanu z AM. Na stężenie lumikanu miał wpływ czas przechowywania i warunki temperaturowe. Produkt leczniczy Lumican w AME przechowywany przez 12 dni w temperaturze -20 °C i 4 °C był znacznie wyższy niż w przypadku innych lekarzy oświatomierzy. Ta ekstrakcja lumikanu może być przydatna do opracowywania metod leczenia i rozwiązań farmaceutycznych. Potrzebne są dalsze badania w celu określenia zastosowań AME lumican w procesie reepitelializacji i gojenia się ran.

Wyniki przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie standardowe (SD). Wykonano testy t Studenta oraz analizę wariancji (ANOVA). Wartości P &lt; 0,05 uznano za istotne statystycznie. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego (patrz Tabela materiałów).
Całkowita ilość białka w AME była zależna od czasu i warunków przechowywania. Bazowe stężenie białka było podobne dla wszystkich AME; zakres całkowitego białka wynosił 2,7 ±...

Obecny protokół opisuje ekstrakcję lumikanu z błony owodniowej (AM) i warunki ich przechowywania jako ekstraktu AM (AME) w temperaturze -20 °C, 4 °C i temperaturze pokojowej (RT) przez 6, 12, 20 i 32 dni w celu ilościowego określenia jego białek i stężenia lumikanu.

Ekstrakcja Lumikanu z błony owodniowej i określenie jej temperatury przechowywania

Lumican is a small leucine-rich proteoglycan in the human amniotic membrane (AM) that promotes corneal epithelialization and the organization of collagen ...

Metoda ta ma na celu zademonstrowanie prostej techniki ekstrakcji białek, przydatnej do uzyskiwania obfitych białek i innych czynników. Technika ta może być wykorzystana do ekstrakcji innych czynników i białek obecnych w błonie owodniowej, a także do uzyskania białek z innych źródeł, takich jak zwierzęta i tkanki roślinne. Zacznij od rozmrożenia 100 miligramów błony owodniowej uzyskanej z banku owodni.Po rozmrożeniu dodaj 10 mililitrów sterylnego zbilansowanego roztworu soli do szalki Petriego i myj membranę przez dwie minuty. Następnie wyjąć zużyty zbilansowany roztwór soli do zlewki i powtarzać proces, aż na szalce Petriego nie będzie widoczny ślad podłoża glicerolowego. Następnie dodaj 10 mililitrów dypazy II do membrany i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.Pod koniec inkubacji przeprowadzić mechaniczną deepitelializację za pomocą gumowego skrobaka do komórek policjanta. Następnie zwizualizuj błonę pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić denabłonializację. Następnie przemyj pozbawioną nabłonka błonę owodniową sterylnym zrównoważonym roztworem soli, jak pokazano wcześniej, i umieść ją w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej.Następnie zanurz probówkę zawierającą membranę w ciekłym azocie na 40 minut. Po zamrożeniu ciekłym azotem należy ręcznie zmielić membranę przez dwie do trzech minut w moździerzu, wstępnie schłodzonym w temperaturze minus 85 stopni Celsjusza, aż do uzyskania drobnego proszku. Następnie dodaj 2,5 mililitra roztworu inhibitora proteazy i rozpuścij drobno sproszkowaną błonę.Oczyść ścianki zaprawy za pomocą noża do skalpela i przenieś mieszaninę do pięciomililitrowej tuby. Obracaj rurkę przez 30 sekund. Następnie homogenizować mieszaninę tkankową, najpierw odwirowując w stężeniu 34 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ponownie odwirowując w temperaturze 3,360 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec wirowania zebrać supernatant, który jest ekstraktem z błony owodniowej, w nowej probówce. Następnie podnieś 0,7 mililitra w innej dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej dla różnych punktów czasowych i temperatur. Na całkowitą ilość białka i stężenie lumikanu w ekstrakcie z błony owodniowej miał wpływ czas i warunki przechowywania.Stężenie białka podstawowego było podobne wśród wszystkich ekstraktów z błon owodniowych. Jednak znacznie wysokie stężenie białka odnotowano w ekstrakcie przechowywanym przez 32 dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 dni w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Lumikan w ekstrakcie z błony owodniowej był istotnie wyższy w próbce przechowywanej przez okres 12 dni w porównaniu z próbkami przechowywanymi przez 30, 20 i sześć dni w temperaturze 4 i minus 20 stopni Celsjusza.Wyniki te sugerowały, że odpowiedni czas i temperatura przechowywania do osiągnięcia najwyższego stężenia lumikanu to 12 dni w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Zachowaj najwyższą ostrożność podczas uziemiania zamrożonej błony owodniowej. Uziemienie powinno być delikatne, ponieważ może wypaść z zaprawy.Potrzebne są dalsze badania w celu określenia roli ekstraktu z błony owodniowej lumikanu w komórkach nabłonka rogówki oraz określenia idealnej dawki lumikanu do reepitelializacji rogówki.

lumican-extraction-from-amniotic-membrane-determination-its-storage

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodni (hAEC) przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych, zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP).

Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje izolację komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych błony owodniowej człowieka w celu określenia ich heterogeniczności i właściwości funkcjonalnych do ewentualnego zastosowania w modelach klinicznych i fizjopatologicznych.

Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Przedstawiono protokół powtarzalny do przygotowania, wzbogacania i zastosowania in situ żelu żelatynowo-ryboflawinowego krzyżowalnego światłem niebieskim do naprawy ran stromalnych rogówki u królików, w tym kroki proceduralne dotyczące postępowania chirurgicznego, częściowej tarzoraphii i opieki pooperacyjnej.

Produkcja i chirurgiczne zastosowanie wzbogaconych żeli żelatynowych przekształconych światłem i riboflawiny do naprawy ran rogówki u królików

Poznaj metodę ekstrakcji lumikanu z błony owodniowej i określenia optymalnej temperatury przechowywania. Protokół obejmuje mielenie w ciekłym azocie i analizę stabilności białka.

Ekstrakcja Lumikanu z błony owodniowej i określenie jej temperatury przechowywania

Przeglądaj więcej filmów