Ekstrakcja Lumikanu z błony owodniowej i określenie jej temperatury przechowywania
14 października 2022
Obecny protokół opisuje ekstrakcję lumikanu z błony owodniowej (AM) i warunki ich przechowywania jako ekstraktu AM (AME) w temperaturze -20 °C, 4 °C i temperaturze pokojowej (RT) przez 6, 12, 20 i 32 dni w celu ilościowego określenia jego białek i stężenia lumikanu.
Metoda ta ma na celu zademonstrowanie prostej techniki ekstrakcji białek, przydatnej do uzyskiwania obfitych białek i innych czynników. Technika ta może być wykorzystana do ekstrakcji innych czynników i białek obecnych w błonie owodniowej, a także do uzyskania białek z innych źródeł, takich jak zwierzęta i tkanki roślinne. Zacznij od rozmrożenia 100 miligramów błony owodniowej uzyskanej z banku owodni.
Po rozmrożeniu dodaj 10 mililitrów sterylnego zbilansowanego roztworu soli do szalki Petriego i myj membranę przez dwie minuty. Następnie wyjąć zużyty zbilansowany roztwór soli do zlewki i powtarzać proces, aż na szalce Petriego nie będzie widoczny ślad podłoża glicerolowego. Następnie dodaj 10 mililitrów dypazy II do membrany i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.
Pod koniec inkubacji przeprowadzić mechaniczną deepitelializację za pomocą gumowego skrobaka do komórek policjanta. Następnie zwizualizuj błonę pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić denabłonializację. Następnie przemyj pozbawioną nabłonka błonę owodniową sterylnym zrównoważonym roztworem soli, jak pokazano wcześniej, i umieść ją w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej.
Następnie zanurz probówkę zawierającą membranę w ciekłym azocie na 40 minut. Po zamrożeniu ciekłym azotem należy ręcznie zmielić membranę przez dwie do trzech minut w moździerzu, wstępnie schłodzonym w temperaturze minus 85 stopni Celsjusza, aż do uzyskania drobnego proszku. Następnie dodaj 2,5 mililitra roztworu inhibitora proteazy i rozpuścij drobno sproszkowaną błonę.
Oczyść ścianki zaprawy za pomocą noża do skalpela i przenieś mieszaninę do pięciomililitrowej tuby. Obracaj rurkę przez 30 sekund. Następnie homogenizować mieszaninę tkankową, najpierw odwirowując w stężeniu 34 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ponownie odwirowując w temperaturze 3,360 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pod koniec wirowania zebrać supernatant, który jest ekstraktem z błony owodniowej, w nowej probówce. Następnie podnieś 0,7 mililitra w innej dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej dla różnych punktów czasowych i temperatur. Na całkowitą ilość białka i stężenie lumikanu w ekstrakcie z błony owodniowej miał wpływ czas i warunki przechowywania.
Stężenie białka podstawowego było podobne wśród wszystkich ekstraktów z błon owodniowych. Jednak znacznie wysokie stężenie białka odnotowano w ekstrakcie przechowywanym przez 32 dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 dni w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Lumikan w ekstrakcie z błony owodniowej był istotnie wyższy w próbce przechowywanej przez okres 12 dni w porównaniu z próbkami przechowywanymi przez 30, 20 i sześć dni w temperaturze 4 i minus 20 stopni Celsjusza.
Wyniki te sugerowały, że odpowiedni czas i temperatura przechowywania do osiągnięcia najwyższego stężenia lumikanu to 12 dni w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Zachowaj najwyższą ostrożność podczas uziemiania zamrożonej błony owodniowej. Uziemienie powinno być delikatne, ponieważ może wypaść z zaprawy.
Potrzebne są dalsze badania w celu określenia roli ekstraktu z błony owodniowej lumikanu w komórkach nabłonka rogówki oraz określenia idealnej dawki lumikanu do reepitelializacji rogówki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę ekstrakcji lumikanu z błony owodniowej (AM) oraz jego przechowywania w różnych warunkach. Badanie określa ilościowo stężenie białka i lumikanu w różnych odstępach czasu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia komórki
Wstęp
- Lumikan jest proteoglikanem uczestniczącym w różnych procesach biologicznych.
- Błona owodniowa jest bogatym źródłem białek i czynników.
- Zrozumienie warunków przechowywania jest kluczowe dla zachowania integralności białek.
- Metodę tę można dostosować do innych tkanek biologicznych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu ekstrakcji lumikanu.
- Ocena wpływu różnych warunków przechowywania na stabilność lumikanu.
- Zapewnienie podstawowej metody ekstrakcji białek z błon biologicznych.
Zastosowane metody
- Rozmrażanie próbek błony płodowej.
- Przemywanie błony sterylnym zrównoważonym roztworem soli.
- Inkubacja z dyspazą II w celu ekstrakcji białek.
- Przechowywanie ekstraktu z AM w różnych temperaturach do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja lumikanu z błony owodniowej.
- Ilościowe oznaczenie stężenia białka w różnych warunkach przechowywania.
- Stabilność lumikanu zmienia się w zależności od temperatury i czasu.
- Protokół może zostać dostosowany do innych białek z różnych źródeł.
Wnioski
- Metoda ekstrakcji jest skuteczna w pozyskiwaniu lumikanu.
- Warunki przechowywania mają istotny wpływ na stabilność białka.
- Niniejszy protokół może ułatwić dalsze badania nad białkami błony owodniowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna ekstrakcja i kwantyfikacja lumikanu z ludzkiej błony owodniowej umożliwia standaryzowany dostęp do bioaktywnego składnika macierzy o potencjalnym znaczeniu dla badań nad regeneracją tkanek i oka. Zrozumienie stabilności lumikanu w określonych warunkach przechowywania wspiera powtarzalność procesów i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji w zakresie bioprocesingu dla zastosowań translacyjnych. Niniejszy protokół ustanawia ekstrakcję lumikanu jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w badaniach i rozwoju w obszarze biofarmacji we wczesnych fazach oraz w opracowywaniu biomateriałów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie biologicznej roli lumikanu w organizacji macierzy zewnątrzkomórkowej i epitelializacji.
- Wspiera walidację funkcjonalną lumikanu jako kandydata do badań w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie zestandaryzowanych preparatów lumikanu do badań in vitro.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne źródło lumicanu do kalibracji testów i przesiewania związków.
- Umożliwia ilościową ocenę stężenia lumicanu w kontrolowanych warunkach przechowywania.
- Wspiera standaryzację testów poprzez zdefiniowanie optymalnych parametrów ekstrakcji i przechowywania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostarcza ekstraktów wzbogaconych w lumikan do oceny przedklinicznej w modelach naprawy rogówki istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie integralności białka w odstępach czasu przechowywania.
- Wspiera decyzje o postępie prac w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnienie profili stabilności lumikanu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół ekstrakcji i kwantyfikacji wpisuje się w kontinuum od wczesnych etapów odkryć do badań przedklinicznych, wspierając zarówno badania oparte na hipotezach, jak i translacyjny rozwój biomateriałów.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania mechanistycznych efektów lumikany na zachowanie komórek i montaż macierzy.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane preparaty lumikany do odtwarzalnego opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar stężenia lumikany w celu porównania warunków przechowywania i optymalizacji przepływów pracy.
- Badania translacyjne: Utrzymuje integralność ekstraktu dla późniejszych badań przedklinicznych w modelach naprawy tkanek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia protokół możliwy do adaptacji do innych ekstrakcji białek z błon biologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w kwestii stabilności i roli funkcjonalnej lumikanu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy ekstrakcji i przechowywania, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów w zakresie biomateriałów i medycyny regeneracyjnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację inicjatyw badawczo-rozwojowych opartych na lumikanie z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu technik ekstrakcji i oznaczania ilości białek.
- Niezbędny jest dostęp do chłodni, wirówek oraz odczynników będących inhibitorami proteaz.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów ekstrakcji i przechowywania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla innych źródeł tkanek po optymalizacji protokołu.
- Zgodnie z protokołem, podczas mielenia niezbędna jest ostrożność w celu zapobieżenia utracie próbki.
