Name: Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj cyfrowy PCR kropelkowy do kwantyfikacji kolistych RNA w komórkach mięśniowych C2C12. Ta metoda zapewnia wysoką czułość i dokładność bez konieczności stosowania genów kontrolnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Instytutu Nauk Przyrodniczych, grant badawczy DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) oraz stypendium Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017] przyznane Amareshowi C. Pandzie. Dziękujemy pozostałym członkom laboratorium za korektę artykułu.

RNA jest wrażliwe na RNazy; dlatego wszystkie odczynniki, instrumenty i miejsca pracy powinny być wolne od RNaz i traktowane ostrożnie.
1. Rozbieżny projekt startera dla circRNA (zobacz Rysunek 1)
<ol>
	<li>Pobierz dojrzałą sekwencję z danych adnotacji circRNA za pomocą BEDTools lub z przeglądarki genomu UCSC, łącząc sekwencję eksonu/intronu obecną między współrzędnymi złącza splicingu wstecznego18,19.</li>
	<li>Przygotuj sekwencję matrycy PCR o długości 200 nukleotydów, łącząc ostatnie 100 nukleotydów o całkowitej długości sekwencji circRNA z pierwszymi 100 nukleotydami sekwencji circRNA10. 
	UWAGA: Jeśli długość circRNA jest mniejsza niż 200 nukleotydów, podziel ją na dwie równe połowy i połącz nukleotydy od ostatniej połowy do początku pierwszej połowy.</li>
	<li>Użyj powyższej sekwencji szablonów do projektowania starterów, korzystając z narzędzia internetowego Primer3 i ustawiając długość produktu PCR w zakresie od 120 do 180 nukleotydów na długość20.</li>
	<li>Użyj domyślnych ustawień Primer3 dla innych parametrów, takich jak Tm i długość podkładu. Sekwencje starterów dla circBnc2 są wymienione w tabeli 1.</li>
	<li>Zamów rozbieżne sekwencje starterów do syntezy w dowolnej firmie zajmującej się syntezą oligonukleoty</li>.
</ol>
2. Izolacja RNA
UWAGA: Wyizoluj całkowite RNA z mysich komórek C2C12 za pomocą dowolnych dostępnych na rynku zestawów lub własnej metody izolacji RNA. Zastosowana tutaj metoda izolacji RNA została opisana wcześniej21. Magnetyczne kulki krzemionkowe są przygotowywane w laboratorium przy użyciu wcześniej opublikowanego protokołu22. Te koraliki magnetyczne można również nabyć u różnych dostawców.
<ol>
	<li>Weź jedno 10-centymetrowe naczynie zawierające około 5 x 106 proliferujących komórek mioblastów C2C12 i jedną 4-dniową różnicowaną miorurkę C2C12 do izolacji RNA.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie 10 ml 1x PBS i wyrzuć PBS za pomocą pipety.</li>
	<li>Zeskrobać komórki w 1 ml 1x PBS za pomocą skrobaka do komórek, odwirować je w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 750 x g i wyrzucić PBS za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika do izolacji RNA (RIR) i poddać komórki lizie przez energiczne pipetowanie21.</li>
	<li>Dodać 200 μl (1/5 objętości RIR) chloroformu i wirować przez 15 s. Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 12 000 x g.</li>
	<li>Weź 400 μl górnej warstwy wodnej, załaduj ją na kolumnę krzemionkową i odwiruj przez 1 minutę przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Przenieś przepływ do nowej rurki i dodaj 600 μl 100% etanolu.</li>
	<li>Dodać 20 μl magnetycznych kulek krzemionkowych i umieścić probówkę na termomikserze ustawionym na 25 °C i 1 200 obr./min na 5 min. 
	UWAGA: Objętość kulek można zwiększać lub zmniejszać w zależności od początkowej liczby komórek pobranych do lizy. Magnetyczne kulki krzemionkowe można nabyć u komercyjnych dostawców.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 30 s lub do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Zawiesić magnetyczne kulki krzemionkowe w 500 μl buforu płuczącego zawierającego 90% etanolu. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym na 30 sekund. Obróć rurkę dwukrotnie na stojaku magnetycznym, aby umyć koraliki. Pozwól kulkom osiąść w kierunku magnesu i wyrzuć bufor za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 2.9 dwa razy. Po umyciu krótko zakręć rurką i umieść ją z powrotem na stojaku magnetycznym na 30 sekund. Wyrzuć pozostały bufor do mycia. Suszyć probówkę na powietrzu w temperaturze 50 °C przez 3 minuty na termomikserze, trzymając pokrywę otwartą.</li>
	<li>Dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić kulki. 
	UWAGA: Objętość elucji RNA można zmniejszyć do 10 μl, aby zwiększyć stężenie RNA.</li>
	<li>Umieść probówki na 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym i pozostaw ją na 30 sekund. Zebrać rozpuszczone RNA w nowej probówce w celu oceny ilości i jakości za pomocą spektrofotometru. 
	UWAGA: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Aby uzyskać optymalny wynik, zaleca się przystąpienie do etapu syntezy cDNA następnego dnia.</li>
</ol>
3. synteza cDNA
<ol>
	<li>Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i weź 1 μg RNA do syntezy cDNA.</li>
	<li>Zmieszać 1 μg całkowitego RNA z 1 μl mieszanki dNTP (po 10 mM dATP, dTTP, dGTP i dCTP), 4 μL 5x buforu odwrotnej transkryptazy (RT), 2 μL 10x startera losowego RT, 0,25 μL enzymu odwrotnej transkryptazy (200 U/μL) i 0,5 μL inhibitora RNazy (40 U/μL), i uzupełnić objętość do 20 μl wodą wolną od nukleaz. 
	UWAGA: Objętość enzymu odwrotnej transkryptazy może być zmieniona w zależności od początkowego stężenia RNA pobranego do syntezy cDNA.</li>
	<li>Postukaj w probówkę, aby wymieszać reakcję i krótko zawirować. Umieścić probówkę w temperaturze 25 °C na 10 minut, a następnie w temperaturze 50 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Aby dezaktywować enzym, umieść probówkę w temperaturze 85 °C na 5 minut.</li>
	<li>Schłodź probówkę lodem przez 2 minuty i dodaj do niej 480 μl wody wolnej od nukleaz, aby stężenie cDNA wynosiło 2 ng/μL. 
	UWAGA: cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C lub natychmiast wykorzystane do analizy dd-PCR.</li>
</ol>
4. Przepływ pracy Digital droplet PCR (dd-PCR)
UWAGA: Przebieg pracy dd-PCR składa się z wielu etapów, począwszy od przygotowania próbki, następnie generowania kropel, amplifikacji PCR, liczenia kropel i analizy danych. Każdy krok ma kluczowe znaczenie dla dokładnego generowania danych, ponieważ dd-PCR obejmuje bezwzględną kwantyfikację produktów i nie wymaga żadnej krzywej wzorcowej. W związku z tym każdy z różnych etapów dd-PCR został opisany poniżej.
<ol>
	<li>Przygotowanie reakcji dd-PCR.
	<ol>
		<li>Ustawić reakcję PCR 22 μl w 0,2 ml probówkach lub paskach PCR wraz z probówką kontroli ujemnej i probówkami NTC (kontrola bez matrycy). 
		UWAGA: Każda inna rozbieżna para starterów do wykrywania różnych circRNA musi mieć reakcję NTC wraz z próbkami testowymi.</li>
		<li>Dodać 11 μl głównej mieszanki dd-PCR (np. EvaGreen Supermix) i 11 μl wody wolnej od nukleaz, aby ustawić probówkę z reakcją kontroli ujemnej. 
		UWAGA: Rozmrozić główną mieszankę dd-PCR w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać krótki wir, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Użyj tej samej wody wolnej od nukleaz do ustawienia probówki z reakcją kontroli ujemnej i probówek NTC, które były używane do rozcieńczania cDNA.</li>
		<li>Dodać 11 μl master-mixu dd-PCR, 5,5 μl mieszaniny starterów do przodu i do tyłu specyficznej dla circRNA o stężeniu 1 μM i 5,5 μl wody wolnej od nukleaz, aby ustawić probówki reakcyjne NTC. 
		UWAGA: Rozcieńczyć rozbieżne startery rozbieżne specyficzne dla RNA do przodu i do tyłu o skrytości 100 μM i wymieszać, aby przygotować 1 μM stężenie robocze mieszanki starterów cyrkulacji do przodu i do tyłu; zatem końcowe stężenie startera wynosi 250 nM w reakcji 22 μl.</li>
		<li>Dodać 11 μl master-mixu dd-PCR, 5,5 μl mieszaniny starterów specyficznych dla circRNA do przodu i do tyłu o stężeniu 1 μM i 5,5 μl cDNA (2 ng/μl), aby ustawić probówki reakcyjne.</li>
		<li>Dokładnie wymieszać, a następnie krótko odwirować wszystkie probówki reakcyjne, aby uzyskać jednorodną mieszaninę reakcyjną na dnie probówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie kropelk.
	<ol>
		<li>Przenieść 20 μl mieszaniny PCR z probówek PCR o pojemności 0,2 ml do dołków na próbki we wkładzie z generatorem kropel.</li>
		<li>Ostrożnie dodać 70 μl oleju wytwarzającego kropelki do studzienek olejowych wkładu generatora kropel za pomocą pipety wielokanałowej. 
		UWAGA: Przed użyciem inkubować olej do wytwarzania kropelek w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Przykryj wkład generatora kropel gumową uszczelką i umieść go w maszynie generatora kropel, aby uzyskać mieszaninę kropelek próbki i oleju, wytworzoną w studzienkach kropelkowych wkładu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR.
	<ol>
		<li>Przenieść 40 μl mieszaniny kropli próbki i oleju z dołków kropelkowych wkładu generatora kropel na 96-dołkową płytkę PCR za pomocą pipety wielokanałowej. 
		UWAGA: Ostrożnie przenieś mieszaninę kropelek próbki i oleju, robiąc kąt do studzienek przez końcówki pipety wielokanałowej, aby uniknąć rozbijania kropelek podczas przenoszenia ich na 96-dołkową płytkę dd-PCR.</li>
		<li>Uszczelnij 96-dołkową płytkę PCR za pomocą zgrzewarki z folii aluminiowej, umieść ją w bloku maszyny do zgrzewania płyt podgrzanym do 80 °C i zatrzaskaj w celu uszczelnienia płytki PCR.</li>
		<li>Teraz umieść płytkę w termocyklerze dd-PCR i ustaw program zgodnie z tabelą 2 z temperaturą pokrywy ustawioną na 105 °C i szybkością narastania 2 °C/s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie kropel.
	<ol>
		<li>Po zakończeniu PCR umieść płytkę na maszynie do liczenia kropel dd-PCR z uchwytem płytki we właściwej pozycji do liczenia kropel.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do analizy kropel i skonfiguruj przebieg, podając dane wejściowe dla informacji o próbce.</li>
		<li>Kliknij opcję konfiguracji. Następnie kliknij opcję szablonu, aby otworzyć nowy szablon.</li>
		<li>Zdefiniuj każdą studzienkę, podając szczegóły eksperymentu, takie jak nazwa próbki (użyte cDNA lub kontrola ujemna lub NTC), nazwa docelowa (nazwa startera circRNA) i typ (nieznany) oraz typ eksperymentu, taki jak ABS (kwantyfikacja bezwzględna) i Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) itp.</li>
		<li>Na koniec zapisz szablon i rozpocznij uruchamianie, klikając opcję uruchamiania i wybierz liczenie według wierszy lub kolumn. Pozwól maszynie zakończyć liczenie kropel, co zajmuje około 1 minuty/studzienkę.</li>
		<li>Kliknij przycisk Analizuj, aby przeanalizować dane po zakończeniu odczytu kropli.</li>
		<li>Kliknij przycisk Amplituda 1D, aby zobaczyć dodatnie i ujemne krople</li>
		<li>Aby oddzielić krople dodatnie od kropel ujemnych, należy wyznaczyć wspólną linię progową dla wszystkich próbek o tym samym celu. 
		UWAGA: Całkowita liczba kropel w każdej próbce powinna przekraczać 10 000, aby można ją było uwzględnić przy bezwzględnym oznaczaniu ilościowym. NTC nie powinien pokazywać dodatniej liczby kropel. Obecność dodatnich kropelek w NTC wskazuje na zanieczyszczenie odczynników lub amplifikację dimerów starterów. Trudno jest dowiedzieć się, czy dodatnie kropelki mają dimery starterów, czy produkty niespecyficzne w NTC. Zaleca się sprawdzenie starterów i unikanie jakiegokolwiek zanieczyszczenia odczynników, co jest ogólną praktyką w przypadku każdego PCR, w tym dd-PCR.</li>
		<li>Kliknij przycisk Eksportuj, aby wyeksportować dane dotyczące zliczania circRNA jako plik .csv. Wyeksportowane dane pokazują liczbę circRNA obecnych w każdej próbce.</li>
		<li>Ręcznie oblicz liczbę circRNA w każdej próbce na nanogram RNA, biorąc pod uwagę całkowitą ilość cDNA użytego w każdej reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733(2012).</li>
<li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li>
<li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis%2C+biology+and+characterization+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li>
<li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+in+disease%3A+Basic+properties+and+biomedical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li>
<li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+translation%2C+a+path+to+hidden+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).</li>
<li>Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPanda%2C+AC+%22Circular+RNAs%3A+Biogenesis+and+Functions%22">Circular RNAs: Biogenesis and Functions</a>. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).</li>
<li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Non-Coding+RNA%22%5BJournal%5D)">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).</li>
<li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircRNAs%3A+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).</li>
<li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+analysis+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).</li>
<li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDas%2C+A+%22PCR+Primer+Design.+Methods+in+Molecular+Biology%22">PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology</a>. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic%2C+prognostic%2C+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+in+COVID-19+patients%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li>
<li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+database%3A+2022+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).</li>
<li>Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant%2C+soil+and+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42(2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR%3A+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badania nad CircRNA rozwinęły się w ciągu ostatniej dekady wraz z odkryciem technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. W rezultacie została uznana za potencjalną cząsteczkę dla przyszłych terapii RNA. Ponadto wiadomo, że działa jako biomarker w wielu chorobach, w tym w nowotworach i chorobach układu krążenia 4,8. Jednak identyfikacja circRNA jest trudna ze względu na jego niską liczebność i posiadanie tylko jednej specyficznej sekwencji złącza backsp...

Ostatnie postępy w technologiach sekwencjonowania RNA i nowatorskie algorytmy obliczeniowe odkryły nowego członka rosnącej rodziny niekodujących RNA, zwanych okrągłymi RNA (circRNA)1. Jak sama nazwa wskazuje, circRNA to rodzina jednoniciowych cząsteczek RNA bez wolnych końców. Są one tworzone przez niekanoniczne splicing head-to-tail zwany splatingiem wstecznym, w którym miejsce akceptora splicingu w górę łączy się kowalencyjnie z miejscem donora splicingu w dół, tworząc stabilny krąg RNA1,2. W procesie tym może pośredniczyć kilka czynników, w tym odwrócone powtarzalne elementy Alu obecne w górnych i dolnych egzonach kolistych, lub może być pośredniczony przez niektóre czynniki splicingowe lub białka wiążące RNA (RBP)2,3. Koliste RNA generowane wyłącznie z sekwencji egzonicznej lub intronowej są klasyfikowane jako egzoniczne circRNA i koliste intronowe RNA lub ci-RNA, podczas gdy niektóre egzoniczne circRNA zachowują intron i nazywane są ekson-intronami circRNA (EIcircRNAs)3,4. Funkcje circRNA są wieloaspektowe, w tym gąbczaste miRNA i/lub RBP, regulacja transkrypcji i regulacja funkcji komórkowych poprzez translację na peptydy3,5,6,7. Kilka doniesień podkreśliło znaczenie circRNA w różnych chorobach i procesach fizjologicznych8. Co więcej, specyficzne dla tkanek wzorce ekspresji i oporność na trawienie egzonukleazą sprawiają, że jest to funkcjonalny biomarker do diagnozowania chorób i może być również stosowany jako odpowiedni cel terapeutyczny8. Biorąc pod uwagę jego znaczenie w regulacji zdrowia i chorób, dokładna kwantyfikacja ekspresji circRNA jest potrzebą chwili.
Opracowano kilka metod biochemicznych do ilościowego oznaczania circRNA w próbkach biologicznych9. Jedną z najwygodniejszych i najszerzej akceptowanych metod oznaczania ilościowego circRNA jest odwrotna transkrypcja, a następnie ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-qPCR) przy użyciu rozbieżnych par starterów10. Jednak większość circRNA występuje w niskiej obfitości w porównaniu z liniowymi mRNA, co sprawia, że ich ilościowe określenie jest trudne11. Aby przezwyciężyć ten problem, staraliśmy się użyć cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do dokładnego określenia ilościowego liczby circRNA w danej próbce. dd-PCR to zaawansowana technologia PCR, która jest zgodna z zasadą mikrofluidyki; generuje wiele kropelek wody wodnej w oleju, a PCR zachodzi w każdej kropli jako indywidualna reakcja12. Reakcja zachodzi w pojedynczych kropelkach i jest analizowana za pomocą czytnika kropelk, który podaje liczbę dodatnich lub ujemnych kropel dla interesującego genu12. Jest to najbardziej czuła technika pozwalająca na dokładne określenie ilościowe genu będącego przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli w danej próbce znajduje się tylko jedna kopia. Zmniejszona czułość na inhibitory, lepsza precyzja i pominięcie genu referencyjnego do oznaczania ilościowego sprawiają, że jest on bardziej korzystny niż konwencjonalny qPCR13,14,15. Jest szeroko stosowany jako narzędzie badawcze i diagnostyczne do bezwzględnej kwantyfikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania16,17. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół dd-PCR do kwantyfikacji circRNA w różnicowaniu mysich miotub C2C12 i proliferacji mysich mioblastów C2C12 przy użyciu rozbieżnych starterów.

<table><tbody><tr><td>Probówka mikrocentyfugowa 1,5 ml</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Paski probówki z nakrętką</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana bez DNaz/RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Komórka scrapper</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik DNA</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>Losowe startery</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>zestaw dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Mysi inhibitor RNazy</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima odwrotny transkryptaza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>Olej do wytwarzania kropelek do Evagreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>PCR Płytka zgrzewana, folia, przebijalna</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Wkłady i uszczelki</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridge uchwyt</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Generator kropel</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-dołkowe płytki</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Uszczelniacz płytek PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dotykowy termocykler z 96&ndash; Moduł Deep Well Reaction</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Czytnik kropel</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Quantasoft</td><td>Kolumna krzemionkowa Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parasol Nauki przyrodnicze</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Przeglądarka</td><td></td> genomu <td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td></td>https://primer3.ut.ee/</tr></tbody></table>

kwantyfikacja kolistych rna za pomocą cyfrowego pcr kropelkowego

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Cyfrowa kropelkowa reakcja łańcuchowa polimerazy (dd-PCR) jest jedną z najbardziej czułych metod kwantyfikacji; frakcjonuje reakcję na prawie 20 000 kropelek wody w oleju, a PCR zachodzi w pojedynczych kropelkach. dd-PCR ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym qPCR w czasie rzeczywistym, w tym zwiększoną dokładność w wykrywaniu celów o niskiej liczebności, pomijanie genów referencyjnych do oznaczania ilościowego, eliminowanie kontrprób technicznych dla próbek i wykazywanie wysokiej odporności na inhibitory w próbkach. Ostatnio dd-PCR stał się jedną z najpopularniejszych metod dokładnego ilościowego oznaczania docelowego DNA lub RNA do analizy i diagnostyki ekspresji genów. Koliste RNA (circRNA) to duża rodzina niedawno odkrytych kowalencyjnie zamkniętych cząsteczek RNA pozbawionych końców 5' i 3'. Wykazano, że regulują one ekspresję genów, działając jak gąbki dla białek wiążących RNA i mikroRNA. Ponadto circRNA są wydzielane do płynów ustrojowych, a ich odporność na egzonukleazy sprawia, że służą jako biomarkery w diagnostyce chorób. Ten artykuł ma na celu pokazanie, jak przeprowadzić rozbieżne projektowanie starterów, ekstrakcję RNA, syntezę cDNA i analizę dd-PCR w celu dokładnego ilościowego określenia określonych kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach. Podsumowując, demonstrujemy dokładną kwantyfikację circRNA za pomocą dd-PCR.

Bezwzględna liczba circRNA w każdej próbce może zostać wyznaczona z wyeksportowanych danych dd-PCR. Analiza ilościowa PCR w czasie rzeczywistym zasugerowała różnicową ekspresję circBnc2 w zróżnicowanych miotubach C2C12 (dane nie przedstawiono). W niniejszym badaniu chcieliśmy sprawdzić bezwzględną liczbę kopii circBnc2 w proliferujących mioblastach i miotubach C2C12. Ponieważ porównywana jest ekspresja circBnc2 w dwóch warunkach, bardzo ważne jest, aby wszystkie próbki poddać izolacji RNA, synt...

Ten protokół opisuje szczegółową metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do precyzyjnej kwantyfikacji kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach przy użyciu rozbieżnych starterów.

Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR jest bardzo czułą i dokładną metodą bezwzględnej kwantyfikacji docelowego DNA lub RNA. Jest stosowany do diagnozowania chorób, w przypadku gdy inne konwencjonalne metody nie dają dokładnych wyników. dd-PCR jest najbardziej czułą techniką wykrywania bardzo niskich ilości cząsteczek kwasu nukleinowego.W przeciwieństwie do ilościowego PCR, dd-PCR nie wymaga żadnej kontroli genów w celu oceny ilościowej. Ze względu na swoją czułość i dokładność, dd-PCR może być używany jako narzędzie do diagnostyki molekularnej i badań z udziałem cząsteczek RNA o niskiej liczebności, takich jak mikro RNA i koliste RNA. Przed użyciem dd-PCR należy wykonać RT-PCR lub RT-qPCR, aby potwierdzić, że startery amplifikują swoje docelowe geny bez niespecyficznej amplifikacji PCR.Na początek przygotuj sekwencję matrycy PCR o długości 200 nukleotydów, łącząc ostatnie 100 nukleotydów o całkowitej długości kolistej sekwencji RNA z pierwszymi 100 nukleotydami kolistej sekwencji RNA. Użyj sekwencji szablonów dla podkładu, zaprojektowanej przez narzędzie internetowe Primer 3. Weź jedną 10-centymetrową szalkę zawierającą około 5 milionów proliferujących komórek mioblastów C2C12 i jedną czterodniową różnicowaną miotubę C2C12 do izolacji RNA.Umyj komórki 10 mililitrami 1X PBS trzy razy i wyrzuć PBS za pomocą pipety. Dodać jeden mililitr odczynnika do izolacji RNA i poddać komórki lizie przez energiczne pipetowanie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i wiruj przez 15 sekund.Odwirować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 12 000 G. Pobrać 400 mikrolitrów górnej warstwy wodnej, załadować ją na kolumnę krzemionkową i wirować przez jedną minutę w temperaturze 12 000 G w temperaturze pokojowej. Przeprowadź przepływ do nowej rurki i dodaj 600 mikrolitrów 100% etanolu. Dodaj 20 mikrolitrów magnetycznych kulek krzemionkowych i umieść rurkę na termomikserze, ustawionym na 25 stopni Celsjusza i 1 200 obr./min na pięć minut.Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 30 sekund lub do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny. Zawiesić magnetyczne kulki krzemionkowe w 500 mikrolitrach buforu do płukania zawierającego 90% etanolu. Po umieszczeniu probówki na stojaku magnetycznym na 30 sekund, pozwól kulkom osiąść w kierunku magnesu i wyrzuć bufor za pomocą pipety.Suszyć rurkę na powietrzu w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez trzy minuty na termomikserze, trzymając pokrywę otwartą. Dodaj 20 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i ponownie zawieś kulki. Zebrać rozpuszczony RNA w nowej probówce w celu oceny ilości i jakości za pomocą spektrofotometru.Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i weź jeden mikrogram RNA do syntezy cDNA. Wymieszaj jeden mikrogram całkowitego RNA z jednym mikrolitrem mieszanki dNTP, czterema mikrolitrami 5-krotnego buforu odwrotnej transkryptazy, dwoma mikrolitrami 10-krotnego losowego startera odwrotnej transkryptazy, 0,25 mikrolitra enzymu odwrotnej transkryptazy i 0,5 mikrolitra inhibitora RNazy. Uzupełnić objętość do 20 mikrolitrów za pomocą wody wolnej od nukleaz.Umieść probówkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie w temperaturze 50 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie umieść probówkę w temperaturze 85 stopni Celsjusza na pięć minut, aby dezaktywować enzym. Ustaw reakcję PCR 22 mikrolitrów w 0,2 mililitrowych probówkach lub paskach PCR, wraz z probówką kontroli ujemnej i probówkami kontrolnymi bez matrycy.Dodaj 11 mikrolitrów głównej mieszanki dd-PCR, 5,5 mikrolitra okrągłej mieszanki starterów do przodu i do tyłu specyficznej dla RNA o stężeniu jednym mikromolowym i 5,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz, aby ustawić probówki reakcyjne NTC. Podobnie, aby ustawić probówki reakcyjne, dodaj 11 mikrolitrów głównej mieszanki dd-PCR, 5,5 mikrolitra okrągłej mieszanki starterów specyficznych dla RNA do przodu i do tyłu o stężeniu jednym mikromolowym i 5,5 mikrolitra cDNA. W celu wytworzenia kropelek przenieś 20 mikrolitrów mieszaniny PCR z 0,2 mililitrowych probówek PCR do dołków na próbki wkładu z generatorem kropel.Ostrożnie dodaj 70 mikrolitrów oleju do wytwarzania kropel do studzienek olejowych wkładu generatora kropel za pomocą pipety. Przykryj wkład generatora kropel gumową uszczelką i umieść go w maszynie generatora kropel, aby uzyskać próbkę mieszanki kropel oleju, generowaną w studzienkach kropelkowych wkładu. W celu amplifikacji PCR przenieś 40 mikrolitrów mieszanki kropelek oleju z dołków kropelkowych wkładu generatora kropel na 96-dołkową płytkę PCR za pomocą pipety.Uszczelnij 96-dołkową płytkę PCR za pomocą uszczelniacza z folii aluminiowej. Umieść go w bloku maszyny do zgrzewania płyt, podgrzanym do 180 stopni Celsjusza, i zatrzaskaj uszczelkę, aby uszczelnić płytkę PCR. Następnie umieść płytkę w termocyklerze dd-PCR i ustaw temperaturę pokrywki na 105 stopni Celsjusza, a szybkość narastania na dwa stopnie Celsjusza na sekundę.Po zakończeniu PCR umieść płytkę na maszynie do liczenia kropel dd-PCR z uchwytem płytki we właściwej pozycji do liczenia kropel. Otwórz oprogramowanie do analizy kropel i skonfiguruj przebieg, podając dane wejściowe dotyczące próbki. Kliknij przycisk analizy, aby przeanalizować dane po zakończeniu odczytu kropli.Następnie kliknij przycisk Amplituda 1D, aby zobaczyć dodatnie i ujemne kropelki. Aby oddzielić krople dodatnie od kropel ujemnych, należy wyznaczyć wspólną linię progową dla wszystkich próbek o tym samym celu. Kliknij przycisk eksportu, aby wyeksportować cykliczne dane zliczania RNA jako plik csv.Wyeksportowane dane pokazują liczbę kolistych RNA obecnych w każdej próbce. Ręcznie oblicz liczbę kolistych RNA w każdej próbce na nanogram RNA, biorąc pod uwagę całkowitą ilość cDNA użytego w każdej reakcji. Analiza danych za pomocą oprogramowania QuantaSoft jest pokazana tutaj.Wszystkie próbki z wyjątkiem MT1 wykazały więcej niż 12 000 zliczeń kropel. Ponieważ całkowita liczba kropel była niska w MT1, próbka ta nie została uwzględniona w końcowej analizie danych. Co ciekawe, zaobserwowano wyraźną różnicę we wzorcu ekspresji Circ B i C2 w czterodniowym zróżnicowanym stanie miotubowym w porównaniu z komórkami mioblastów.Analiza obfitości Circ B i C2 pod względem liczby kopii wykazała, że trzy powtórzenia mioblastów C2C12 miały 76,8, 67 i 46 kopii na nanogram RNA, podczas gdy dwie próbki miotubki miały 558 i 610 kopii na nanogram RNA. Dane na wykresie słupkowym reprezentują średnią plus minus odchylenie standardowe dwóch do trzech kontrprób biologicznych. ddPCR jest jedną z najbardziej zaawansowanych metod pomiaru dokładnej ekspresji różnicowej docelowego kolistego RNA.Metoda ta będzie niezbędnym narzędziem do przyspieszenia badań nad cyrkularnym obiegiem zamkniętym i przemysłu diagnostycznego RNA w nadchodzącym roku.

quantification-of-circular-rnas-using-digital-droplet-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Poznaj cyfrowy PCR kropelkowy do kwantyfikacji kolistych RNA w komórkach mięśniowych C2C12. Ta metoda zapewnia wysoką czułość i dokładność bez konieczności stosowania genów kontrolnych.

Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

Przeglądaj więcej filmów