Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

dd-PCR jest bardzo czułą i dokładną metodą bezwzględnej kwantyfikacji docelowego DNA lub RNA. Jest stosowany do diagnozowania chorób, w przypadku gdy inne konwencjonalne metody nie dają dokładnych wyników. dd-PCR jest najbardziej czułą techniką wykrywania bardzo niskich ilości cząsteczek kwasu nukleinowego.

W przeciwieństwie do ilościowego PCR, dd-PCR nie wymaga żadnej kontroli genów w celu oceny ilościowej. Ze względu na swoją czułość i dokładność, dd-PCR może być używany jako narzędzie do diagnostyki molekularnej i badań z udziałem cząsteczek RNA o niskiej liczebności, takich jak mikro RNA i koliste RNA. Przed użyciem dd-PCR należy wykonać RT-PCR lub RT-qPCR, aby potwierdzić, że startery amplifikują swoje docelowe geny bez niespecyficznej amplifikacji PCR.

Na początek przygotuj sekwencję matrycy PCR o długości 200 nukleotydów, łącząc ostatnie 100 nukleotydów o całkowitej długości kolistej sekwencji RNA z pierwszymi 100 nukleotydami kolistej sekwencji RNA. Użyj sekwencji szablonów dla podkładu, zaprojektowanej przez narzędzie internetowe Primer 3. Weź jedną 10-centymetrową szalkę zawierającą około 5 milionów proliferujących komórek mioblastów C2C12 i jedną czterodniową różnicowaną miotubę C2C12 do izolacji RNA.

Umyj komórki 10 mililitrami 1X PBS trzy razy i wyrzuć PBS za pomocą pipety. Dodać jeden mililitr odczynnika do izolacji RNA i poddać komórki lizie przez energiczne pipetowanie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i wiruj przez 15 sekund.

Odwirować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 12 000 G. Pobrać 400 mikrolitrów górnej warstwy wodnej, załadować ją na kolumnę krzemionkową i wirować przez jedną minutę w temperaturze 12 000 G w temperaturze pokojowej. Przeprowadź przepływ do nowej rurki i dodaj 600 mikrolitrów 100% etanolu. Dodaj 20 mikrolitrów magnetycznych kulek krzemionkowych i umieść rurkę na termomikserze, ustawionym na 25 stopni Celsjusza i 1 200 obr./min na pięć minut.

Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 30 sekund lub do momentu, gdy roztwór stanie się klarowny. Zawiesić magnetyczne kulki krzemionkowe w 500 mikrolitrach buforu do płukania zawierającego 90% etanolu. Po umieszczeniu probówki na stojaku magnetycznym na 30 sekund, pozwól kulkom osiąść w kierunku magnesu i wyrzuć bufor za pomocą pipety.

Suszyć rurkę na powietrzu w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez trzy minuty na termomikserze, trzymając pokrywę otwartą. Dodaj 20 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i ponownie zawieś kulki. Zebrać rozpuszczony RNA w nowej probówce w celu oceny ilości i jakości za pomocą spektrofotometru.

Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i weź jeden mikrogram RNA do syntezy cDNA. Wymieszaj jeden mikrogram całkowitego RNA z jednym mikrolitrem mieszanki dNTP, czterema mikrolitrami 5-krotnego buforu odwrotnej transkryptazy, dwoma mikrolitrami 10-krotnego losowego startera odwrotnej transkryptazy, 0,25 mikrolitra enzymu odwrotnej transkryptazy i 0,5 mikrolitra inhibitora RNazy. Uzupełnić objętość do 20 mikrolitrów za pomocą wody wolnej od nukleaz.

Umieść probówkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie w temperaturze 50 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie umieść probówkę w temperaturze 85 stopni Celsjusza na pięć minut, aby dezaktywować enzym. Ustaw reakcję PCR 22 mikrolitrów w 0,2 mililitrowych probówkach lub paskach PCR, wraz z probówką kontroli ujemnej i probówkami kontrolnymi bez matrycy.

Dodaj 11 mikrolitrów głównej mieszanki dd-PCR, 5,5 mikrolitra okrągłej mieszanki starterów do przodu i do tyłu specyficznej dla RNA o stężeniu jednym mikromolowym i 5,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz, aby ustawić probówki reakcyjne NTC. Podobnie, aby ustawić probówki reakcyjne, dodaj 11 mikrolitrów głównej mieszanki dd-PCR, 5,5 mikrolitra okrągłej mieszanki starterów specyficznych dla RNA do przodu i do tyłu o stężeniu jednym mikromolowym i 5,5 mikrolitra cDNA. W celu wytworzenia kropelek przenieś 20 mikrolitrów mieszaniny PCR z 0,2 mililitrowych probówek PCR do dołków na próbki wkładu z generatorem kropel.

Ostrożnie dodaj 70 mikrolitrów oleju do wytwarzania kropel do studzienek olejowych wkładu generatora kropel za pomocą pipety. Przykryj wkład generatora kropel gumową uszczelką i umieść go w maszynie generatora kropel, aby uzyskać próbkę mieszanki kropel oleju, generowaną w studzienkach kropelkowych wkładu. W celu amplifikacji PCR przenieś 40 mikrolitrów mieszanki kropelek oleju z dołków kropelkowych wkładu generatora kropel na 96-dołkową płytkę PCR za pomocą pipety.

Uszczelnij 96-dołkową płytkę PCR za pomocą uszczelniacza z folii aluminiowej. Umieść go w bloku maszyny do zgrzewania płyt, podgrzanym do 180 stopni Celsjusza, i zatrzaskaj uszczelkę, aby uszczelnić płytkę PCR. Następnie umieść płytkę w termocyklerze dd-PCR i ustaw temperaturę pokrywki na 105 stopni Celsjusza, a szybkość narastania na dwa stopnie Celsjusza na sekundę.

Po zakończeniu PCR umieść płytkę na maszynie do liczenia kropel dd-PCR z uchwytem płytki we właściwej pozycji do liczenia kropel. Otwórz oprogramowanie do analizy kropel i skonfiguruj przebieg, podając dane wejściowe dotyczące próbki. Kliknij przycisk analizy, aby przeanalizować dane po zakończeniu odczytu kropli.

Następnie kliknij przycisk Amplituda 1D, aby zobaczyć dodatnie i ujemne kropelki. Aby oddzielić krople dodatnie od kropel ujemnych, należy wyznaczyć wspólną linię progową dla wszystkich próbek o tym samym celu. Kliknij przycisk eksportu, aby wyeksportować cykliczne dane zliczania RNA jako plik csv.

Wyeksportowane dane pokazują liczbę kolistych RNA obecnych w każdej próbce. Ręcznie oblicz liczbę kolistych RNA w każdej próbce na nanogram RNA, biorąc pod uwagę całkowitą ilość cDNA użytego w każdej reakcji. Analiza danych za pomocą oprogramowania QuantaSoft jest pokazana tutaj.

Wszystkie próbki z wyjątkiem MT1 wykazały więcej niż 12 000 zliczeń kropel. Ponieważ całkowita liczba kropel była niska w MT1, próbka ta nie została uwzględniona w końcowej analizie danych. Co ciekawe, zaobserwowano wyraźną różnicę we wzorcu ekspresji Circ B i C2 w czterodniowym zróżnicowanym stanie miotubowym w porównaniu z komórkami mioblastów.

Analiza obfitości Circ B i C2 pod względem liczby kopii wykazała, że trzy powtórzenia mioblastów C2C12 miały 76,8, 67 i 46 kopii na nanogram RNA, podczas gdy dwie próbki miotubki miały 558 i 610 kopii na nanogram RNA. Dane na wykresie słupkowym reprezentują średnią plus minus odchylenie standardowe dwóch do trzech kontrprób biologicznych. ddPCR jest jedną z najbardziej zaawansowanych metod pomiaru dokładnej ekspresji różnicowej docelowego kolistego RNA.

Metoda ta będzie niezbędnym narzędziem do przyspieszenia badań nad cyrkularnym obiegiem zamkniętym i przemysłu diagnostycznego RNA w nadchodzącym roku.