Name: Pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę pobierania wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ksenobiotyków na metabolizm roślin. Technika ta umożliwia kompleksową analizę metabolomiczną odpowiedzi stresowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspólnie wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (41877139), Główne Projekty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (41991335), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFD0800204), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (No. BK20161616), Plan "135" oraz Program Granic Chińskiej Akademii Nauk (ISSASIP1615).

Celem tego protokołu jest zapewnienie ogólnego procesu, od eksperymentu z hodowlą hydroponiczną do analizy metabolomicznej, kwantyfikując wpływ DEHP na wysięki z korzenia lucerny.
1. Eksperyment z kulturą hydroponiczną
UWAGA: Ten protokół przedstawia przykład eksperymentu z hydroponiczną hodowlą lucerny, mającego na celu uzyskanie sadzonek lucerny (Medicago sativa) pod wpływem różnych stężeń DEHP. Przeprowadzono trzy zabiegi: kontrolę bez żadnych dodatków oraz pożywkę wzbogaconą o 1 mg kg-1 i 10 mg kg-1 di(DEHP. Stężenia DEHP zostały ustalone zgodnie z rzeczywistą zawartością DEHP w soil23. Każda terapia składała się z sześciu powtórzeń.
<ol>
	<li>Nasiona lucerny sterylizować 0,1% podchlorynem sodu przez 10 min i 75% alkoholem etylowym przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Wysterylizowane nasiona kilkakrotnie przepłukać wodą destylowaną, a następnie wykiełkować na wilgotnej bibule filtracyjnej na sterylnej szalce Petriego w temperaturze 30 °C w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 20 jednolitych, kiełkujących, pulchnych nasion do koszyka do szczepienia w butelce hodowlanej wypełnionej pożywką, składającej się z (w μM): Ca(NO3)2,3,500; NH4H2PO4, 1,000; 3 węzłyKNO, 6 000; MgSO 4,000; Na2Kwas Fe-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 75; H3BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4,8; CuSO4, 0,3; oraz (NH4 )6Mo7O24, 0,02. Dostosować pH roztworu do 7,0 za pomocą 0,1 M KOH. Odnawiaj wszystkie rozwiązania co tydzień.</li>
	<li>Umieścić wszystkie butelki hodowlane w kontrolowanej komorze wzrostowej o natężeniu światła 150-180 μmol m-2 s-1 z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin każdego dnia, w temperaturze 27 °C i 20 °C, reprezentującej odpowiednio dzień (16 godzin) i noc (8 godzin).</li>
	<li>Po 2 tygodniach przenieś 15 jednolitych sadzonek lucerny do nowej szklanej butelki w celu przeprowadzenia eksperymentów hodowlanych w warunkach stresu DEHP 1 mg kg-1 i 10 mg kg-1. Owiń szklane butelki folią aluminiową i parafilmem, aby zapobiec fotolizie i ulatnianiu się DEHP. Aby zastosować te same warunki, owiń również butelki kontrolne folią aluminiową i parafolią. Codziennie uzupełniaj pożywkę, aby utrzymać poziom płynów.</li>
	<li>Losowo umieszczaj i obracaj butelki co 2 dni, aby zapewnić stałe warunki wzrostu sadzonek lucerny.</li>
	<li>Po 7 dniach uprawy wyjmij sadzonki lucerny z butelek i kilkakrotnie umyj ultraczystą wodą, przygotowując się do zbioru wysięków korzeniowych.</li>
</ol>
2. Zbieranie, ekstrakcja i analiza metabolomiczna wysięków korzeniowych
UWAGA: Ten protokół jest podzielony na trzy części: eksperyment z kolekcją, eksperyment z ekstrakcją i analiza metabolomiczna wysięków korzeniowych. Celem eksperymentu polegającego na pobieraniu jest przeniesienie metabolitów wydzielanych w próbkach roślinnych do systemu roztworu w celu późniejszej ekstrakcji.
<ol>
	<li>Eksperyment z kolekcją
	<ol>
		<li>Przenieś 10 jednolitych sadzonek lucerny do probówek wirówkowych wypełnionych 50 ml wysterylizowanej wody dejonizowanej. Zanurz korzenie w wodzie, aby zebrać wysięk korzeniowy na 6 godzin; Utrzymuj rurki w pozycji pionowej. Wykonać co najmniej sześć powtórzeń dla każdego zabiegu.</li>
		<li>Owiń probówki wirówkowe folią aluminiową, aby chronić korzenie przed światłem.</li>
		<li>Usuń rośliny i liofilizuj zebraną ciecz w celu profilowania metabolitów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment ekstrakcyjny
	<ol>
		<li>Dodać 1,8 ml roztworu ekstrakcyjnego (metanol:H2O= 3:1, V/V) do probówek i wirować przez 30 s.</li>
		<li>Przykładaj fale ultradźwiękowe do rurek przez 10 minut w lodowatej kąpieli wodnej.</li>
		<li>Odwirować próbki w temperaturze 4 °C i 11 000 × g przez 15 minut.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść 200 μl supernatantu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pobrać 45 μl supernatantu z każdej próbki i wymieszać go z próbkami kontroli jakości (QC) o końcowej objętości 270 μl, która służy do kalibracji danych metabolomu próbek.</li>
		<li>Liofilizuj ekstrakty w koncentratorze próżniowym. Kontynuować suszenie za pomocą 5 μl wzorca wewnętrznego (rybonukleolu).</li>
		<li>Po odparowaniu w koncentratorze próżniowym dodać 30 μl chlorowodorku metoksyamiminacji (rozpuszczonego w pirydynie o stężeniu 20 mg mL-1) do probówek i inkubować probówki w temperaturze 80 °C przez 30 minut. Następnie dodać 40 μl odczynnika bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (BSTFA) (z 1% trimetylochlorosilanem [TMC], V/V) do próbek i umieścić probówki w temperaturze 70 °C na 1,5 godziny w celu derywatyzacji.</li>
		<li>Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i dodać 5 μl estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) (w chloroformie) do próbek kontroli jakości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza metabolomiczna
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 1,0 μl derywatyzowanych ekstraktów do systemu chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas czasu przelotu (GC-TOF-MS) w celu analizy profilowania metabolomicznego w trybie bezpodziałowym.
		<ol>
			<li>Do oddzielania wysięków korzeniowych należy użyć kolumny kapilarnej (30 m x 250 μm x 0,25 μm), z helem jako gazem nośnym o natężeniu przepływu 1,0 ml min-1. Ustawić temperaturę wtrysku na 280 °C i utrzymywać temperaturę przewodu przesyłowego i temperaturę źródła jonów odpowiednio na poziomie 280 °C i 250 °C.</li>
			<li>Do separacji należy użyć następującego programu pieca: 1 min ogrzewania izotermicznego w temperaturze 50 °C, 10 °C/min-1 rampy piekarnika do 310 °C i końcowe ogrzewanie izotermiczne w temperaturze 310 °C przez 8 minut.</li>
			<li>Wykonaj tryb zderzenia elektronów z energią -70 eV. Uzyskaj widma masowe w trybie pełnego monitorowania skanowania z zakresem skanowania masowego 50-500 m/z z szybkością 12,5 widma/s.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Filtruj poszczególne szczyty, aby usunąć szumy. Wartość odchylenia jest filtrowana na podstawie przedziału międzykwartylowego.</li>
		<li>Wypełnij brakujące wartości połową wartości minimalnych, ustandaryzuj i znormalizuj dane.</li>
		<li>Zaimportuj końcowe dane w .csv formacie do oprogramowania do analizy statystycznej w celu przeprowadzenia analizy wielowymiarowej.</li>
		<li>Wyszukaj metabolity w bazie danych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (zasób bazy danych do zrozumienia funkcji wysokiego poziomu i użyteczności systemu biologicznego) i sklasyfikuj metabolity do różnych kategorii, takich jak węglowodany, kwasy, lipidy, alkohole i aminy. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby skonstruować wykres kołowy, aby wskazać procent każdej kategorii we wszystkich wysiękach korzeniowych.</li>
		<li>Zastosuj nadzorowane rzuty ortogonalne do analizy dyskryminacji struktur utajonych (OPLS-DA), aby pokazać różnice między grupami.</li>
		<li>Badanie przesiewowe istotnie zmieniało metabolity jako metabolity różnicowe w oparciu o zmienne znaczenie w projekcji (VIP) > 1 i p < 0,05 (test Studenta).</li>
		<li>Wykorzystaj dane metabolomu do skonstruowania map cieplnych za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej i wykorzystaj zmiany fałdowania pod różnymi zabiegami do skonstruowania histogramów.</li>
		<li>Wyszukaj metabolity różnicowe w bazie danych KEGG i Pubchem i skompiluj szlaki metaboliczne zawierające metabolity różnicowe. Wykonaj analizę wzbogacania ścieżek lub analizę topologii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Protokół ten zawiera ogólne wskazówki dotyczące zbierania i pomiaru wysięków korzeniowych lucerny pod wpływem stresu DEHP, a także sposobu analizowania danych metabolomu. Należy zwrócić szczególną uwagę na kilka krytycznych kroków w tym protokole. W eksperymentach z kulturą hydroponiczną sadzonki lucerny hodowano hydroponicznie w szklanych butelkach wypełnionych pożywkami o różnych stężeniach DEHP. Szklane butelki powinny być chronione przed światłem poprzez przykrycie ich folią aluminiową przez cały okres hodowli, w cel...

ftalan Di(2-etyloheksylu) (DEHP) to syntetyczny związek chemiczny, który jest szeroko stosowany w różnych tworzywach sztucznych i polimerach jako plastyfikator poprawiający ich plastyczność i wytrzymałość. W ciągu ostatnich kilku lat coraz więcej badań sugerowało, że DEHP jest substancją zaburzającą funkcjonowanie układu hormonalnego i ma niekorzystny wpływ na układ oddechowy, nerwowy i rozrodczy ludzi i innych zwierząt1,2,3. Biorąc pod uwagę ryzyko dla zdrowia, Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych, Unia Europejska i Chińskie Centrum Monitorowania Środowiska sklasyfikowały DEHP na liście priorytetowych zanieczyszczeń. Gleba została uznana za ważny pochłaniacz DEHP w środowisku, ze względu na stosowanie ściółkowania z tworzyw sztucznych i nawozów organicznych, nawadnianie ściekami i stosowanie osadów w gospodarstwach rolnych4. Zgodnie z oczekiwaniami, DEHP został powszechnie wykryty w glebach rolnych, których zawartość sięga nawet miligramów na kilogram wysuszonej gleby w niektórych regionach Chin5,6. DEHP może wnikać do roślin głównie przez korzenie i ulegać biomagnifikacji na różnych poziomach troficznych w ekosystemach glebowych7. W związku z tym w ostatnich dziesięcioleciach pojawiły się poważne obawy dotyczące stresu wywołanego przez DEHP w roślinach.
Rośliny są zazwyczaj narażone na działanie DEHP. Zaobserwowano, że stres DEHP wywiera niekorzystny wpływ na kiełkowanie nasion i prawidłowy metabolizm, hamując w ten sposób wzrost i rozwój roślin8,9. Na przykład DEHP może indukować uszkodzenia oksydacyjne komórek mezofilu, zmniejszać zawartość chlorofilu i osmolitów oraz zwiększać aktywność enzymów antyoksydacyjnych, co ostatecznie prowadzi do spadku plonów i jakości roślin jadalnych10,11. Jednak większość wcześniejszych badań nad reakcją roślin na stres DEHP koncentrowała się na stresie oksydacyjnym oraz cechach fizjologicznych i biochemicznych. Odpowiednie mechanizmy związane z metabolizmem roślin są mniej zbadane. Wysięki korzeniowe to ogólny termin opisujący związki, które korzenie roślin wydzielają i uwalniają do środowiska. Zostały one uznane za pożywki interakcji między roślinami a glebą ryzosferową, odgrywając ważną rolę we wspieraniu wzrostu i rozwoju roślin12. Powszechnie wiadomo, że wysięki korzeniowe stanowią około 30%-40% całego węgla fotosyntetycznego13. W zanieczyszczonym środowisku wysięki korzeniowe biorą udział w poprawie tolerancji roślin na stres związany z zanieczyszczeniami poprzez metabolizm lub wykluczenie zewnętrzne14. W związku z tym dogłębne zrozumienie reakcji wysięków korzeni roślin na stres związany z zanieczyszczeniem może pomóc w ujawnieniu podstawowych mechanizmów związanych z biochemią komórki i zjawiskami biologicznymi15.
Technologia metabolomiczna zapewnia skuteczną strategię jednoczesnego pomiaru dużej liczby małych molekułowych metabolitów w komórkach16,17, tissues18, a nawet wysięków organizmów19, w tym cukrów, kwasów organicznych, aminokwasów i lipidów. W porównaniu z tradycyjnymi lub klasycznymi metodami analizy chemicznej, podejście metabolomiczne znacznie zwiększa liczbę metabolitów, które można wykryć20, co może pomóc w identyfikacji metabolitów w sposób bardziej przepustowy i identyfikacji kluczowych szlaków metabolicznych. Metabolomika jest szeroko stosowana w dziedzinie badań nad reakcją biologiczną w środowiskach stresowych, takich jak metale ciężkie21, nowe zanieczyszczenia22 i nanocząstki19. Większość z tych badań na roślinach koncentrowała się na zmianach metabolicznych w wewnętrznych tkankach roślinnych, podczas gdy niewiele z nich dotyczyło reakcji wysięków korzeniowych na stres środowiskowy. W związku z tym celem niniejszej pracy jest przedstawienie ogólnych wytycznych dotyczących pobierania wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu DEHP na produkcję metabolitów. Wyniki posłużą jako wytyczne dotyczące metody dla dalszych badań metabolomiki roślin prowadzonych przez DEHP.

<table><tbody><tr><td>Adonitol</td><td>SIGMA</td><td></td><td>&ge; 99%</td></tr><tr><td>Nasiona lucerny</td><td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Sartorius</td><td>BSA124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>REGIS Technologies</td><td></td><td>z 1% TMCS, v/v</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Fresco17</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna</td><td>Agilent</td><td>DB-5MS (30 m i czasy; 250 &mu; m i razy; 0,25 &m; m)</td><td></td></tr> <tr><td>ftalan di(2-etyloheksylu)</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FAMEs</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromatografia gazowa (GC)</td> <td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd szlifierski</td><td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td><td>JXFSTPRP-24</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy (MS)</td> <td>LECO</td><td>PEGASUS HT</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>CNW Technologies</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Chlorowodorek metoksyaminatio</td><td>TCI</td><td></td><td>AR</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Quality</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHG-9023A Pirydyna</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Adamas</td><td></td><td>Oprogramowanie</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>HPLC ROprogramowanie do analizy statystycznej (wzbogacanie ścieżek, topologia)</td></tr><tr><td>SIMCA16.0.2&nbsp;</td><td></td><td></td><td>oprogramowanie do analizy statystycznej (OPLS-DA itp.)</td></tr> <tr><td>Zamrażarka niskotemperaturowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma 900 seria</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwięki</td><td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td><td>YM-080S Suszarka próżniowa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Taicang Huamei fabryka instrumentów biochemicznych</td><td>LNG-T98</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Wysięki korzeniowe są głównym medium komunikacji, komunikacji i transferu energii między korzeniami roślin a otaczającym środowiskiem. Zmiana wydzielania wysięków korzeniowych jest zwykle zewnętrzną strategią detoksykacji roślin w warunkach stresowych. Protokół ten ma na celu wprowadzenie ogólnych wytycznych dotyczących zbierania wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) (DEHP) na produkcję metabolitów. Po pierwsze, sadzonki lucerny są uprawiane pod wpływem stresu DEHP w eksperymencie z kulturą hydroponiczną. Po drugie, rośliny przenosi się do probówek wirówkowych zawierających 50 ml wysterylizowanej ultraczystej wody przez 6 godzin w celu zebrania wysięków z korzeni. Roztwory są następnie liofilizowane w liofilizatorze próżniowym. Zamrożone próbki ekstrahuje się i derywatyzuje odczynnikiem bis(trimetylosilili)) trifluoroacetamidu (BSTFA). Następnie derywatyzowane ekstrakty są mierzone za pomocą systemu chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem mas czasu przelotu (GC-TOF-MS). Pozyskane dane metabolitowe są następnie analizowane w oparciu o metody bioinformatyczne. Zróżnicowane metabolity i znacząco zmienione szlaki metaboliczne powinny być dogłębnie zbadane, aby ujawnić wpływ DEHP na lucernę w świetle wysięków korzeniowych.

W tym doświadczeniu wysięki korzeni lucerny zostały zebrane, wyekstrahowane i przeanalizowane zgodnie z powyższymi metodami (Rysunek 1). Utworzono trzy grupy badawcze: kontrolną, z niskim stężeniem DEHP (1 mg L−1) oraz z wysokim stężeniem DEHP (10 mg L−1).
W chromatogramie kontrolnym wykryto łącznie 778 pików, z czego na podstawie widm masowych zidentyfikowano 314 metabolitów. Jak pokazano na Rysunku 2, metabolit...

Wydzielanie wysięków z korzeni jest zazwyczaj zewnętrzną strategią detoksykacji roślin w warunkach stresu. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić wpływ ksenobiotyków na lucernę za pomocą niecelowanej analizy metabolomicznej.

Pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób oceniać wpływ ksenobiotyków na lucernę podczas niecelowanej analizy metabolomicznej. Technika jest bardzo prosta i wygodna w obsłudze i można zidentyfikować więcej rodzajów wysięków korzeniowych. Co pomaga w konstruowaniu metabolomicznego odcisku palca wysięków z korzeni roślin.Rozpocznij sterylizację nasion medicago sativa lub lucerny, płucząc nasiona 0,1% podchlorynem sodu przez 10 minut. Następnie myj 75% alkoholem etylowym przez 30 minut. Następnie wysterylizowane nasiona kilkakrotnie opłucz wodą destylowaną.A następnie wykiełkuj je na wilgotnej bibule filtracyjnej umieszczonej na sterylnej szalce Petriego. W 30 stopniach Celsjusza w ciemności. Po wykiełkowaniu przenieś 20 równomiernie kiełkujących, dużych, pulchnych nasion do kosza do szczepienia w butelce hodowlanej wypełnionej pożywką.Umieść wszystkie butelki z kulturami w komorze wzrostowej w kontrolowanych warunkach. Po dwóch tygodniach przenieś 15 jednolitych sadzonek lucerny do nowej szklanej butelki, aby wystawić je na działanie jednego miligrama na kilogram i 10 miligramów na kilogram stresu DEHP w eksperymencie hodowlanym. Owiń szklane butelki do leczenia i kontroli folią aluminiową i parafilmem, aby zapobiec fotolizie i ulatnianiu się DEHP.Codziennie uzupełniaj pożywkę, aby utrzymać poziom płynów. Losowo umieszczaj i obracaj butelki co dwa dni, aby zapewnić stałe warunki wzrostu sadzonek lucerny. Po siedmiu dniach uprawy wyjmij sadzonki lucerny z butelek.I umyj je kilkakrotnie ultraczystą wodą, aby przygotować je do zbierania wysięków korzeniowych. Rozpocznij eksperyment z zbieraniem wysięku korzeniowego, przenosząc 10 jednolitych sadzonek lucerny do probówek wirówkowych wypełnionych 50 mililitrami wysterylizowanej wody dejonizowanej. Aby zebrać wysięk z korzeni, trzymaj rurki w pozycji pionowej przez sześć godzin, gdy korzenie są zanurzone w wodzie.Po zakończeniu owiń probówki wirówkowe folią aluminiową, aby chronić korzenie przed światłem. Usunąć rośliny i liofilizować zebraną ciecz w celu profilowania metabolitów. Kontynuuj eksperyment ekstrakcji, dodając 1,8 mililitra roztworu ekstrakcyjnego do liofilizowanych próbek.W wirze przez 30 sekund. Następnie przyłóż fale ultradźwiękowe do rurek przez 10 minut w lodowatej kąpieli wodnej. Przed odwirowaniem próbek.Ostrożnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Odessać 45 mikrolitrów supernatantu z probówki wirówkowej i wymieszać go z próbkami kontroli jakości lub kontroli jakości w końcowej objętości 270 mikrolitrów. Po zakończeniu liofilizuj ekstrakty w koncentratorze próżniowym.Po zakończeniu suszenia dodać pięć mikrolitrów wewnętrznego wzorca rybonukleazy i kontynuować suszenie. Po odparowaniu dodać 30 mikrolitrów roztworu chlorowodorku metoksyaminacji i inkubować probówki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 40 mikrolitrów odczynnika BSTFA do próbek przed umieszczeniem probówek w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 1,5 godziny w celu derywatyzacji.Po zakończeniu inkubacji i osiągnięciu przez derywatyzowaną próbkę temperatury pokojowej, do derywatyzowanych próbek dodać pięć mikrolitrów estrów metylowych kwasów tłuszczowych rozpuszczonych w chloroformie. Za pomocą kolumny kapilarnej o wymiarach 30 metrów na 250 mikrometrów na 0,25 mikrometra oddziel jeden mikrolitr wysięku korzeniowego za pomocą helu z gazem nośnym o natężeniu przepływu 1,0 mililitra na minutę. Ustaw temperaturę wtrysku na 280 stopni Celsjusza.I utrzymuj temperaturę linii przesyłowej na poziomie 280 stopni Celsjusza. Ustaw program piekarnika do separacji. Po rozdzieleniu ekstraktów należy wykonać spektrometrię mas w trybie zderzeń elektronów o energii minus 70 elektronowoltów.Utrzymuj temperaturę źródła jonów na poziomie 250 stopni Celsjusza. Uzyskaj widma masowe w trybie pełnego monitorowania skanowania z zakresem skanowania masowego od 50 do 500 mas przez ładowanie z szybkością 12,5 widma na sekundę. W chromatografie próbki kontrolnej wykryto 778 pików.Z czego 314 metabolitów zidentyfikowano zgodnie z widmami masowymi. Kwasy zostały dalej podzielone na kwasy tłuszczowe, aminokwasy, kwasy organiczne i kwasy fenolowe. Ponadto niektóre powszechne substancje ogólnie obecne w wysiękach korzeniowych wykryto również w wysiękach z korzeni lucerny, w tym pirymidyny, hydroksypirymidyny, flawonoidy, fenole, ketony, pirymidyny i diterpeny.Na podstawie wyniku VIP sporządzono mapę cieplną, aby zobrazować zmienność metabolitów różnicowych między różnymi terapiami DEHP. W porównaniu z próbkami kontrolnymi, ekspozycja na DEHP istotnie zmieniła zawartość 50 metabolitów i wysięków z korzenia lucerny. Głównie zawiera niektóre węglowodany i niskocząsteczkowe kwasy organiczne.Analiza szlaków metabolicznych wykazała, że DEHP znacząco hamuje metabolizm węglowodanów, które są produktem fotosyntezy, co wskazuje, że DEHP może do pewnego stopnia hamować fotosyntezę lucerny. Dla każdego zabiegu należy wykonać co najmniej wysięk z korzeni nasiennych, aby zapewnić dokładną analizę danych metabolomicznych. Możemy określić różnicowy metabolizm i dalej badać ważne zasady w zachowaniu zanieczyszczeń w środowisku.Interakcje między roślinami a szerszą społecznością biologiczną można rozszyfrować głównie za pomocą tej metody.

collection-alfalfa-root-exudates-to-study-impact-di-2-ethylhexyl

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Ten manuskrypt opisuje, jak tempo metabolizmu herbicydów może być skutecznie określone ilościowo za pomocą wyciętych liści z chwastów dwuliściennych, zmniejszając w ten sposób zmienność i usuwając wszelkie możliwe zakłócające efekty pobierania lub translokacji herbicydów, zwykle obserwowane w testach na całej roślinie.

Pomiar tempa metabolizmu herbicydów w chwastach dwuskrzydłowych za pomocą testu wyciętych liści

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Celem tego artykułu jest opisanie protokołu ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek przylegających do analizy metabolomicznej, w szczególności elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas.

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne.

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Obecny protokół opisuje prostą i efektywną metodę transportu kwasów perfluoroalkilowych w pszenicy na duże odległości.

Badanie transportu kwasów perfluoroalkilowych na duże odległości w pszenicy za pomocą techniki ekspozycji z rozszczepionymi korzeniami

Obecny protokół opisuje prostą i skuteczną metodę identyfikacji metabolitów 2,4-dibromofenolu w roślinach.

Wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach

Protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach.

Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

Przedstawiamy protokół dla opartego na szkle, półhydroponicznego systemu eksperymentalnego, wspierającego wzrost różnych filogenetycznie odrębnych roślin z mikrobami lub bez. System jest kompatybilny z różnymi podłożami wzrostowymi i umożliwia nieniszczące pobieranie próbek wysięku korzeniowego do dalszej analizy.

Wszechstronny system szklanych słoików do półhydroponicznego profilowania wysięku korzeniowego

Demonstrujemy średnioprzepustową metodę ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzeszków ziemnych przy użyciu ultra wydajnej chromatografii cieczowej. Metoda ta została opracowana specjalnie do analiz dzikich gatunków pajęczaków zagrożonych przez aflatoksynogenne gatunki Aspergillus.

Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Poznaj metodę pobierania wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ksenobiotyków na metabolizm roślin. Technika ta umożliwia kompleksową analizę metabolomiczną odpowiedzi stresowych.

Pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów

Przeglądaj więcej filmów