Pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów
2 czerwca 2023
Wydzielanie wysięków z korzeni jest zazwyczaj zewnętrzną strategią detoksykacji roślin w warunkach stresu. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić wpływ ksenobiotyków na lucernę za pomocą niecelowanej analizy metabolomicznej.
Protokół ten opisuje, w jaki sposób oceniać wpływ ksenobiotyków na lucernę podczas niecelowanej analizy metabolomicznej. Technika jest bardzo prosta i wygodna w obsłudze i można zidentyfikować więcej rodzajów wysięków korzeniowych. Co pomaga w konstruowaniu metabolomicznego odcisku palca wysięków z korzeni roślin.
Rozpocznij sterylizację nasion medicago sativa lub lucerny, płucząc nasiona 0,1% podchlorynem sodu przez 10 minut. Następnie myj 75% alkoholem etylowym przez 30 minut. Następnie wysterylizowane nasiona kilkakrotnie opłucz wodą destylowaną.
A następnie wykiełkuj je na wilgotnej bibule filtracyjnej umieszczonej na sterylnej szalce Petriego. W 30 stopniach Celsjusza w ciemności. Po wykiełkowaniu przenieś 20 równomiernie kiełkujących, dużych, pulchnych nasion do kosza do szczepienia w butelce hodowlanej wypełnionej pożywką.
Umieść wszystkie butelki z kulturami w komorze wzrostowej w kontrolowanych warunkach. Po dwóch tygodniach przenieś 15 jednolitych sadzonek lucerny do nowej szklanej butelki, aby wystawić je na działanie jednego miligrama na kilogram i 10 miligramów na kilogram stresu DEHP w eksperymencie hodowlanym. Owiń szklane butelki do leczenia i kontroli folią aluminiową i parafilmem, aby zapobiec fotolizie i ulatnianiu się DEHP.
Codziennie uzupełniaj pożywkę, aby utrzymać poziom płynów. Losowo umieszczaj i obracaj butelki co dwa dni, aby zapewnić stałe warunki wzrostu sadzonek lucerny. Po siedmiu dniach uprawy wyjmij sadzonki lucerny z butelek.
I umyj je kilkakrotnie ultraczystą wodą, aby przygotować je do zbierania wysięków korzeniowych. Rozpocznij eksperyment z zbieraniem wysięku korzeniowego, przenosząc 10 jednolitych sadzonek lucerny do probówek wirówkowych wypełnionych 50 mililitrami wysterylizowanej wody dejonizowanej. Aby zebrać wysięk z korzeni, trzymaj rurki w pozycji pionowej przez sześć godzin, gdy korzenie są zanurzone w wodzie.
Po zakończeniu owiń probówki wirówkowe folią aluminiową, aby chronić korzenie przed światłem. Usunąć rośliny i liofilizować zebraną ciecz w celu profilowania metabolitów. Kontynuuj eksperyment ekstrakcji, dodając 1,8 mililitra roztworu ekstrakcyjnego do liofilizowanych próbek.
W wirze przez 30 sekund. Następnie przyłóż fale ultradźwiękowe do rurek przez 10 minut w lodowatej kąpieli wodnej. Przed odwirowaniem próbek.
Ostrożnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Odessać 45 mikrolitrów supernatantu z probówki wirówkowej i wymieszać go z próbkami kontroli jakości lub kontroli jakości w końcowej objętości 270 mikrolitrów. Po zakończeniu liofilizuj ekstrakty w koncentratorze próżniowym.
Po zakończeniu suszenia dodać pięć mikrolitrów wewnętrznego wzorca rybonukleazy i kontynuować suszenie. Po odparowaniu dodać 30 mikrolitrów roztworu chlorowodorku metoksyaminacji i inkubować probówki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 40 mikrolitrów odczynnika BSTFA do próbek przed umieszczeniem probówek w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 1,5 godziny w celu derywatyzacji.
Po zakończeniu inkubacji i osiągnięciu przez derywatyzowaną próbkę temperatury pokojowej, do derywatyzowanych próbek dodać pięć mikrolitrów estrów metylowych kwasów tłuszczowych rozpuszczonych w chloroformie. Za pomocą kolumny kapilarnej o wymiarach 30 metrów na 250 mikrometrów na 0,25 mikrometra oddziel jeden mikrolitr wysięku korzeniowego za pomocą helu z gazem nośnym o natężeniu przepływu 1,0 mililitra na minutę. Ustaw temperaturę wtrysku na 280 stopni Celsjusza.
I utrzymuj temperaturę linii przesyłowej na poziomie 280 stopni Celsjusza. Ustaw program piekarnika do separacji. Po rozdzieleniu ekstraktów należy wykonać spektrometrię mas w trybie zderzeń elektronów o energii minus 70 elektronowoltów.
Utrzymuj temperaturę źródła jonów na poziomie 250 stopni Celsjusza. Uzyskaj widma masowe w trybie pełnego monitorowania skanowania z zakresem skanowania masowego od 50 do 500 mas przez ładowanie z szybkością 12,5 widma na sekundę. W chromatografie próbki kontrolnej wykryto 778 pików.
Z czego 314 metabolitów zidentyfikowano zgodnie z widmami masowymi. Kwasy zostały dalej podzielone na kwasy tłuszczowe, aminokwasy, kwasy organiczne i kwasy fenolowe. Ponadto niektóre powszechne substancje ogólnie obecne w wysiękach korzeniowych wykryto również w wysiękach z korzeni lucerny, w tym pirymidyny, hydroksypirymidyny, flawonoidy, fenole, ketony, pirymidyny i diterpeny.
Na podstawie wyniku VIP sporządzono mapę cieplną, aby zobrazować zmienność metabolitów różnicowych między różnymi terapiami DEHP. W porównaniu z próbkami kontrolnymi, ekspozycja na DEHP istotnie zmieniła zawartość 50 metabolitów i wysięków z korzenia lucerny. Głównie zawiera niektóre węglowodany i niskocząsteczkowe kwasy organiczne.
Analiza szlaków metabolicznych wykazała, że DEHP znacząco hamuje metabolizm węglowodanów, które są produktem fotosyntezy, co wskazuje, że DEHP może do pewnego stopnia hamować fotosyntezę lucerny. Dla każdego zabiegu należy wykonać co najmniej wysięk z korzeni nasiennych, aby zapewnić dokładną analizę danych metabolomicznych. Możemy określić różnicowy metabolizm i dalej badać ważne zasady w zachowaniu zanieczyszczeń w środowisku.
Interakcje między roślinami a szerszą społecznością biologiczną można rozszyfrować głównie za pomocą tej metody.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę oceny wpływu ksenobiotyków na lucernę z wykorzystaniem nietargetowanej analizy metabolomicznej. Podkreśla on znaczenie wydzielin korzeniowych jako strategii detoksykacji roślin w warunkach stresu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Metabolomika
- Reakcje na stres środowiskowy
Wstęp
- Wydzieliny korzeniowe odgrywają kluczową rolę w interakcjach roślin z ich środowiskiem.
- Ksenobiotyki mogą wpływać na zdrowie i metabolizm roślin.
- Nietargetowana metabolomika umożliwia kompleksowe profilowanie metabolitów.
- Zrozumienie tych interakcji może dostarczyć cennych informacji dla praktyk rolniczych.
Cel badania
- Ocena wpływu ksenobiotyków na lucernę.
- Identyfikacja różnych rodzajów wydzielin korzeniowych.
- Stworzenie metabolicznego profilu (fingerprintu) wydzielin korzeniowych roślin.
Zastosowane metody
- Sterylizacja nasion lucerny przy użyciu podchlorynu sodu i alkoholu etylowego.
- Płukanie nasion wodą destylowaną po sterylizacji.
- Zastosowanie technik nietargetowanej analizy metabolomicznej.
- Identyfikacja metabolitów w wysiękach korzeniowych.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja różnych wysięków korzeniowych.
- Wgląd w mechanizmy detoksykacji lucerny.
- Ustalenie profilu metabolomicznego do dalszych badań.
- Wykazanie skuteczności metody w ocenie odpowiedzi roślin na ksenobiotyki.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania reakcji roślin na stresory środowiskowe.
- Wydzieliny korzeniowe są kluczowe dla zrozumienia stanu zdrowia roślin w warunkach stresu.
- Podejście to można zastosować w odniesieniu do innych gatunków roślin w celu uzyskania szerszych informacji.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nietargetowany profil metaboliczny wysięków korzeni lucerny pod wpływem stresu wywołanego DEHP umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach interakcji między rośliną a środowiskiem, istotnych dla procesów biotechnologii agrochemicznej i środowiskowej. Ilościowa analiza metabolitów różnicowych zwiększa wiarygodność predykcyjną w odniesieniu do szlaków odpowiedzi na stres, dostarczając danych dla wczesnych etapów odkryć i badań translacyjnych nad wpływem ksenobiotyków. Niniejszy schemat postępowania pozycjonuje metabolomikę wysięków korzeniowych jako powtarzalne narzędzie do oceny odporności roślin i strategii detoksykacji w ramach całego portfolio badawczego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków detoksykacji roślin w odpowiedzi na ekspozycję na ksenobiotyki.
- Wspiera funkcjonalną walidację stresowych zmian metabolicznych na styku korzeń-gleba.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w identyfikacji kluczowych metabolitów i szlaków do dalszych badań.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane odciski metabolomiczne do późniejszych analiz porównawczych.
- Standaryzuje proces pobierania wysięków korzeniowych oraz pomiary GC-TOF-MS w celu zapewnienia powtarzalności.
- Generuje wyniki ilościowe odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu stresorów środowiskowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje zmiany metabolitów z odkryciem biomarkerów środowiskowych w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój strategii łagodzenia stresu u roślin kandydujących.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy oddziaływań między rośliną a środowiskiem, istotnych dla zrównoważonego rolnictwa.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z ciągiem odkryć, od wczesnego testowania hipotez dotyczących odpowiedzi roślin na stres, po identyfikację kluczowych biomarkerów metabolicznych i przedklinyczną walidację mechanizmów detoksykacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę składu wysięków korzeniowych w oparciu o hipotezę w warunkach określonego stresu ksenobiotycznego.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe profile metabolitów do analizy porównawczej różnych warunków.
- Analityka: Zapewnia bogate w treści dane GC-TOF-MS oraz wyniki bioinformatyczne do mapowania szlaków metabolicznych.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany metabolomiczne ze strategiami biomarkerów środowiskowych, gdy są one wspierane przez analizę szlaków.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany schemat postępowania, który można dostosować do innych systemów roślinnych i czynników stresogennych.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie mechanizmów odpowiedzi roślin na stres oraz walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne procesy metabolomiczne.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do decyzji go/no-go w zakresie ograniczania ryzyka środowiskowego i strategii odporności upraw.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację badań nad interakcjami roślin ze środowiskiem w programach B+R z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie metabolomiki roślin oraz obsługi aparatury GC-TOF-MS.
- Wymaga solidnej infrastruktury analitycznej do wysokoprzepustowego przetwarzania próbek i analizy danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów pobierania próbek i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych modeli roślin i stresorów środowiskowych poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od rygorystycznych powtórzeń i kontroli jakości w celu uzyskania wiarygodnych wyników metabolomicznych.
