Test biologiczny śmiertelności przy użyciu Artemia salina L.

Protokół ten jest bardzo przydatnym narzędziem do wstępnej ogólnej oceny toksyczności na różnych typach próbek, takich jak ekstrakty, frakcje i związki z różnych źródeł naturalnych lub syntetycznych. Główną zaletą naszego protokołu jest to, że jest bardzo łatwy i tani oraz może być stosowany na wielu próbkach jednocześnie. Co więcej, ręcznie robiony sprzęt poprawia niezawodność witryny.

Na tym etapie techniki przeprowadzamy badania przesiewowe w celu wybrania próbek na podstawie ich wstępnego profilu toksyczności ogólnej, które zostaną poddane dalszym specyficznym testom, takim jak ekspansywne linie komórkowe lub nawet testy in vivo. Metoda ta jest wykorzystywana głównie w dziedzinie chemii leków i innych produktów do badań przesiewowych próbek biotycznych. Nasz protokół może być również stosowany do innych rodzajów próbek, takich jak nanosystemy.

Występując po raz pierwszy, zachowaj cierpliwość, ponieważ wymaga to doskonałych umiejętności obserwacji i dużej uwagi poświęconej wszystkim parametrom zgłaszanym przez Marcię Filipe i Verę Isca, doktoranci z naszego laboratorium pomogą zademonstrować tę procedurę. Zacznij od umieszczenia pojemnika w kształcie lejka w czarnym wsporniku i obrócenia lejka w odpowiednim kierunku, aby zobaczyć znak poziomu i kran. Aby wykonać ręcznie robiony sprzęt do migracji, wytnij górną część dwóch plastikowych butelek o pojemności 0,5 litra, aby uzyskać ostateczną wysokość 12 centymetrów.

Utwórz otwór o średnicy 1,5 centymetra z jednej strony i siedem centymetrów od dna każdej butelki i włóż 13-centymetrową gumową rurkę między dwa otwory. Uszczelnij otwory gorącym klejem i pozostaw do wyschnięcia na 15 minut. Połóż butelki na płaskiej powierzchni i napełnij je wodą, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków.

Dodaj 28 gramów soli do 800 mililitrów wody z kranu, aby przygotować sztuczny roztwór soli lub solę solankową z krewetek w stężeniu 35 gramów na litr. Wymieszaj go z mieszadłem, aż cała sól dokładnie się rozpuści. Aby przygotować próbki, należy rozpuścić odpowiednią ilość każdego ekstraktu i związku dimetylosulfotlenku lub DMSO w końcowym stężeniu 10 miligramów na mililitr.

Następnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów każdej próbki w nowej mikroprobówce wirówkowej, używając 990 mikrolitrów sztucznego roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 miligrama na mililitr. Pod wyciągiem w kolbie Erlenmeyera przygotować roztwór dichromianu potasu w wodzie destylowanej o stężeniu jednego miligrama na mililitr. Napełnij naczynie wylęgowe pożywką do oznaczenia 500 mililitrów i dodaj jedną łyżkę lub około 0,5 grama cyst krewetek solankowych do roztworu soli.

Zamknij pojemnik. Umieść lampę skierowaną bezpośrednio w stronę urządzenia i włącz ją. Podłącz system dostarczania powietrza do złącza umieszczonego na górze urządzenia i włącz pompę.

Cysty krewetek solankowych wylęgają się w sztucznym roztworze soli pod wpływem intensywnego napowietrzania, ciągłego oświetlenia i stabilnej temperatury. Po 24 do 48 godzinach, gdy jaja się wyklują, wyłącz pompę powietrza i poczekaj, aż naupliusy zostaną oddzielone od pustych pojemników na jajka. Aby oddzielić niewyklute jaja od żywych naupliiów, otwórz kran wylotowy na dole i wylej zawartość lejka do jednego z pojemników ręcznie robionego pojemnika na sprzęt migracyjny.

Upewnij się, że roztwór zawierający nauplia i resztki niewyklutych jaj znajduje się poniżej poziomu probówki. Umieść sprzęt w inkubatorze na cztery godziny, a następnie do drugiego pojemnika dodaj pozostały roztwór soli powyżej wysokości probówki. Przykryj pojemnik naupliami i pozostałościami niewyklutych jaj za pomocą folii aluminiowej i umieść lampę na drugim pojemniku z samym roztworem soli.

Krewetki solankowe zostaną przyciągnięte przez światło i będą migrować z jednego pojemnika do drugiego, co doprowadzi do skutecznego oddzielenia jaj od żywej artemii. Z pojemnika do zbioru zebrać 900 mikrolitrów roztworu soli fizjologicznej zawierającego od 10 do 15 naupliów i umieścić roztwór w jednym dołku na 24-dołkowej płytce. Wszystkie próbki są badane w poczwórnych odstępach.

Dodać 100 mikrolitrów każdej kontroli ujemnej. Kontrola pozytywna, sztuczny roztwór soli i każda z próbek do studzienek i inkubować płytkę pod oświetleniem przez 24 godziny. Po 24 godzinach zarejestruj liczbę martwych larw w każdej studzience pod mikroskopem lornetkowym przy 12-krotnym powiększeniu.

Dodać 100 mikrolitrów roztworu dichromianu potasu, aby wywołać śmierć pozostałych żywych larw i odczekać sześć godzin. Policz całkowitą martwą larwę w każdym dołku pod mikroskopem i określ wskaźnik śmiertelności zgodnie z równaniem pokazanym na ekranie. Wykonaj wszystkie testy w trzech egzemplarzach i oblicz odchylenia standardowe.

Na koniec wyraź wyniki jako średnią z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy ma wewnętrzne poczwórne duplikaty plus minus odchylenia standardowe. Na rysunku przedstawiono strukturę wybranych związków wyekstrahowanych z gatunków Plectranthus i otrzymanych w drodze półsyntezy. Na tym zdjęciu pokazano nowo wyklute nauplia Artemia Salina, widziane pod mikroskopem.

Ten obraz graficzny przedstawia śmiertelność Artemia Salina po 24 godzinach ekspozycji na cztery ekstrakty metanolowe z gatunku Plectranthus na poziomie 0,1 miligrama na mililitr. Wszystkie ekstrakty były akceptowalne pod względem ogólnej toksyczności przy użyciu tego testu. Tutaj sól odpowiada roztworowi soli lub ślepej próbie.

Jako kontrolę pozytywną zastosowano dichromian potasu, a jako kontrolę ujemną DMSO. Wszystkie badane ekstrakty wykazały bardzo zachęcające wyniki z bardzo niskimi wartościami procentowymi śmiertelności porównywalnymi do tych zarejestrowanych dla ślepej próby i kontroli ujemnej. Śmiertelność Artemia Salina po 24 godzinach ekspozycji na pięć czystych związków w dawce 0,1 miligrama na mililitr przedstawiono na tym rysunku.

Z tych danych jasno wynika, że tylko pięć wykazuje minimalną toksyczność przy użyciu tego testu Należy pamiętać w szczególności o trzech krokach, wylęganiu, migracji i zbieraniu. W związku z tym mamy oddzielone inne krewetki i liczby do pracy. Wstępne miejsce to prosty i tani model toksyczności kanału w porównaniu z innymi miejscami, takimi jak hodowla komórkowa lub danio pręgowany.

Co więcej, można następnie wykorzystać droższe miejsca cytotoksyczności.