Name: Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę przesiewową do identyfikacji związków modulujących cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał w raku piersi. Ta technika oparta na obrazowaniu umożliwia szybkie testowanie bibliotek chemicznych w celu odkrycia leków wspomagających aktywność komórek NK.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LV otrzymało dofinansowanie z grantów Krajowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE i OTKA K132193, K147482. Komórki CD16.176V.NK-92 uzyskano od dr Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, w imieniu Brink Biologics, lnc. San Diego, Kalifornia), są chronione patentami na całym świecie i były licencjonowane przez Nantkwest, lnc. Autorzy są wdzięczni Györgyowi Verebowi i Árpádowi Szöőrowi za pomoc w zastosowaniu linii komórkowej NK-92 oraz za porady techniczne.

UWAGA: Kluczowe etapy procedury analizy przedstawiono na Rysunku 2.
<img alt="Schemat ADCC; inkubacja komórek, trastuzumab, komórki NK i JIMT-1, analiza wysokoprzepustowa (high-content analysis)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64485/64485fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat badania przesiewowego ADCC. Komórki docelowe JIMT-1-EGFP wysiane na płytki HCS z 96 dołkami są traktowane związkami z biblioteki chemicznej. Następnie dodaje się niebarwione komórki NK (efektorowe) oraz trastuzumab, a płytkę obrazuje się w punkcie czasowym 0 oraz po 3 h inkubacji. Ocena ADCC opiera się na zmianie liczby żywych (przylegających do powierzchni) komórek docelowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64485/64485fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
1. Powlekanie płytki HCS
<ol>
	<li>Pokryj płytki 96-dołkowe do wysokoprzepustowego obrazowania (HSC) 50 µL/dołek pożywki JIMT-1 (pożywka DMEM/F-12 uzupełniona o 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,3 U/mL insuliny (100 IU/mL, Humulin R) oraz 1% penicyliny-streptomycyny).</li>
	<li>Umieść płytkę w inkubatorze CO2 na 1 h. 
	UWAGA: Pokrycie jest kluczowe dla przyczepienia komórek JIMT-1 do szklanej powierzchni płytki.</li>
</ol>
2. Wysiew komórek JIMT-1 z ekspresją wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP)
UWAGA: Komórki JIMT-1 ekspresujące EGFP zostały wygenerowane w naszej poprzedniej pracy18, a komórki hodowano w kolbach do hodowli tkankowej T25 w pożywce JIMT-1 (patrz skład w kroku 1.1).
<ol>
	<li>Przemyć komórki 2 mL sterylnego PBS.</li>
	<li>Do kolby dodać 1 mL trypsyny-EDTA i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze CO2 na 10 min.</li>
	<li>Po inkubacji opukać kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 odłączyły się od podłoża.</li>
	<li>Zatrzymać proces trawienia, dodając 2 mL pożywki JIMT-1, a następnie zebrać zawiesinę komórkową do probówki 15 mL.</li>
	<li>Policzyć komórki z użyciem 0,4% błękitu trypanowego (80 µL barwnika + 20 µL zawiesiny komórkowej) w komorze Bürkera i dostosować liczbę komórek do poziomu 133 000 komórek/mL.</li>
	<li>Odssać pożywkę do powlekania z płytki 96-dołkowej (krok 1.2).</li>
	<li>Do każdego dołka płytek HCS pipetować 75 µL zawiesiny komórkowej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pozostawić komórki do przytwierdzenia podczas inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2.</li>
</ol>
3. Wstępna inkubacja komórek JIMT-1 EGFP z biblioteką związków
<ol>
	<li>Odssać pożywkę z komórek JIMT-1 i dodać do studni 50 µL/well świeżej pożywki dla komórek JIMT-1. Przenieść płytkę do laboratorium wysokoprzepustowych przesiewów. 
	UWAGA: Użycie robota do manipulacji cieczami zwiększa wydajność i powtarzalność dodawania bibliotek związków.</li>
	<li>Przenieść badane związki z płytki biblioteki związków na płytkę testową za pomocą narzędzia z pinami skalibrowanego do objętości 25 nL. Powtórzyć tę czynność cztery razy. Cztery serie transferu zapewniają objętość końcową 100 nL (i końcowe stężenie 20 µM).</li>
	<li>Pomiędzy poszczególnymi krokami przemyć narzędzie z pinami, najpierw 50% DMSO, a następnie 70% etanolem.</li>
	<li>Inkubować płytki przez 1 h w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Rozpoczęcie testu ADCC poprzez dodanie komórek efektorowych
UWAGA: Komórki CD16.176V.NK92 (dalej nazywane komórkami NK92) hodowano w pożywce α-MEM uzupełnionej o 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% pirogronianu sodu, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 100 IU/mL IL-2.
<ol>
	<li>Policz komórki NK92 przy użyciu błękitu trypanu (80 µL barwnika + 20 µL zawiesiny komórkowej). Dostosuj liczbę komórek do poziomu 400,000 cells/mL.</li>
	<li>Odwiruj 4 mL zawiesiny komórkowej przy 150 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj medium ADCC, dodając 20 µg/mL przeciwciała anty-HER2 (trastuzumabu) do medium JIMT-1.</li>
	<li>Resuspenduj osad komórek NK w 5 mL medium ADCC.</li>
	<li>Pipetuj 20,000 komórek NK w 50 µL medium ADCC do komórek docelowych JIMT-1. Objętość końcowa wynosi 100 µL, a końcowe stężenie trastuzumabu to 10 µg/mL.</li>
	<li>Umieść płytkę testową w urządzeniu do analizy wysokotreściowej (high-content analysis) z wbudowanym inkubatorem ustawionym na 37 °C.</li>
</ol>
5. Obrazowanie
UWAGA: Płytki należy obrazować w dwóch punktach czasowych: po pierwsze, natychmiast po dodaniu komórek efektorowych do komórek docelowych, a po drugie, 3 h po dodaniu komórek NK. Do obrazowania można wykorzystać analizator wysokoprzepustowy (high-content analyzer) wraz z oprogramowaniem lub odpowiednie alternatywy (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Wybierz typ płytki (96-well cell carrier ultra) z listy dostępnych płytek.</li>
	<li>Wybierz opcję Two peak autofocus, jeżeli badanie jest przeprowadzane w płytkach.</li>
	<li>Użyj obiektywu 10x w trybie niekonfokalnym.</li>
	<li>Wybierz Binning 2, aby podwoić stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Wykonaj obrazy w polu jasnym w zakresie 650-760 nm oraz obrazy fluorescencyjne komórek JIMT-1 transdukowanych EGFP przy długościach fal 488 nm (pobudzenie) i 500-550 nm (emisja).</li>
	<li>Wybierz liczbę pól oraz liczbę punktów czasowych dla obrazowania.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
UWAGA: Aby przeanalizować wydajność ADCC, należy zliczyć żywe komórki JIMT-1. Komórki docelowe zniszczone w procesie ADCC odrywają się od powierzchni i oddalają od płaszczyzny ogniskowej mikroskopu. W związku z tym różnica między liczbą żywych komórek na początku i na końcu reakcji ADCC odpowiada liczbie komórek docelowych wyeliminowanych przez ADCC. W celu zademonstrowania sposobu opracowania sekwencji oceny, w filmie pokazano kontrolną studzienkę ADCC.
<ol>
	<li>Użyj modułu Find cells, aby wykryć na obrazie obszary odpowiadające komórkom. 
	UWAGA: Każda komórka jest wykrywana jako obszar na obrazie o wyższej intensywności fluorescencji niż obszar go otaczający.</li>
	<li>Wybierz komórki, korzystając z wbudowanego algorytmu M, przyjmując minimalną średnicę 80 µm.</li>
	<li>Ustaw wartość Splitting sensitivity (czułość rozdzielania), która dzieli duży obiekt na mniejsze obiekty, na 0,5.</li>
	<li>Ustaw Common threshold (najniższy poziom intensywności pikseli) na 0.</li>
	<li>Wyklucz detekcję obszarów tła o wysokiej intensywności fluorescencji EGFP w dwóch krokach.
	<ol>
		<li>Najpierw użyj funkcji Calculate Intensity Properties, aby określić intensywność fluorescencji EGFP w wcześniej wybranym obszarze Cells.</li>
		<li>Ustaw minimalny i maksymalny próg intensywności za pomocą opcji Select population.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy%3A+an+alternative+promising+therapeutic+approach+against+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers.</a> Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present%2C+and+future+of+non-viral+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The past, present, and future of non-viral CAR T cells.</a> Frontiers in Immunology. 13, 867013(2022).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Ross, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HER-2+receptor+and+breast+cancer%3A+ten+years+of+targeted+anti-HER-2+therapy+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine.</a> Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).</li>
<li>Shitara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+trastuzumab+deruxtecan+and+safety+management+for+patients+with+HER2-positive+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer.</a> Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).</li>
<li>Gianni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+neoadjuvant+pertuzumab+and+trastuzumab+in+women+with+locally+advanced%2C+inflammatory%2C+or+early+HER2-positive+breast+cancer+%28NeoSphere%29%3A+a+randomised+multicentre%2C+open-label%2C+phase+2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Barok, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+causes+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity-mediated+growth+inhibition+of+submacroscopic+JIMT-1+breast+cancer+xenografts+despite+intrinsic+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance.</a> Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).</li>
<li>Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+cells+and+monoclonal+antibodies%3A+Two+partners+for+successful+antibody+dependent+cytotoxicity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261(2021).</li>
<li>Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+exploitation+of+neutrophils+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer.</a> Semin Immunol. 57, 101581(2021).</li>
<li>Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ADCC%3A+A+different+approach+to+HER2+breast+cancer+in+the+immunotherapy+era%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era.</a> Breast. 60, 15-25 (2021).</li>
<li>van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+by+chromium+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).</li>
<li>Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+antibody-dependent+cell+cytotoxicity+using+lactate+dehydrogenase+%28LDH%29+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement.</a> Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).</li>
<li>Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+ADCC+against+adherent+cells%3A+Impedance-based+detection+is+superior+to+release%2C+membrane+permeability%2C+or+caspase+activation+assays+in+resolving+antibody+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response.</a> Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).</li>
<li>Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thaw-and-use+target+cells+pre-labeled+with+calcein+AM+for+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).</li>
<li>Lee-MacAry, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+flow+cytometric+cell-mediated+cytotoxicity+assay+using+the+fluorophores+PKH-26+and+TO-PRO-3+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide.</a> Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).</li>
<li>Tanito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+natural+killer+cell-mediated+cell+killing+assay+based+on+the+leakage+of+an+endogenous+enzyme+or+a+pre-loaded+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore.</a> Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).</li>
<li>Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+high-content+screening+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Image-based high-content screening in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).</li>
<li>Guti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitargeted+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+sunitinib+induces+resistance+of+HER2+positive+breast+cancer+cells+to+trastuzumab-mediated+ADCC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).</li>
<li>Li, F., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+NK+cells+and+ADCC%3A+A+promising+immunotherapy+approach+in+targeted+therapy+for+HER2-positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1083462(2022).</li>
<li>Perussia, B., Loza, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+%28ADCC%29+and+reverse+ADCC+%28redirected+cytotoxicity%29+in+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).</li>
<li>Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+emtansine%3A+Mechanisms+of+action+and+resistance%2C+clinical+progress%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond.</a> Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Reakcja ADCC została opisana stosunkowo dawno temu. Opisano również kluczowe zdarzenia molekularne tego procesu19. Metody pomiaru ADCC wahają się od złotego standardu testu uwalniania chromu promieniotwórczego, testów uwalniania enzymów cytoplazmatycznych do kilku testów cytometrii przepływowej lub mikropłytek opartych na fluorescencji20. Jednak częstym ograniczeniem tych testów jest to, że nie nadają się one do zastosowań o wysokiej przepustowości. Wcześniej opracowaliśmy ...

Immunoterapia z zastosowaniem przeciwciał przeciwnowotworowych, inhibitorów punktów kontrolnych układu odpornościowego lub limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR-T) stanowi potężne podejście w leczeniu raka1,2,3. Trastuzumab jest humanizowanym monoklonalnym przeciwciałem anty-HER-2 (ludzki receptor 2 dla czynnika wzrostu naskórka) stosowanym w leczeniu HER-2 dodatniego raka piersi we wczesnym stadium lub w formie przerzutowej, a także przerzutowego raka żołądka HER-2 dodatniego4,5,6. Działa on przede wszystkim poprzez hamowanie efektu stymulującego proliferację przez czynnik wzrostu naskórka4. Doniesiono jednak, że trastuzumab skutecznie wywołuje śmierć komórek nowotworowych nawet wtedy, gdy komórki te utraciły reaktywność na stymulację HER-27. Ten paradoksalny efekt przeciwciała wynika z cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)7. ADCC może być pośredniczone przez komórki NK (natural killer), granulocyty i makrofagi, określane zbiorczo jako komórki efektorowe ADCC8,9. Jeśli przeciwciało, takie jak trastuzumab, wiąże się z komórkami nowotworowymi, komórki efektorowe wykorzystują swoje receptory Fc do związania stałego (Fc) regionu przeciwciała. Przeciwciało tworzy pomost między komórkami nowotworowymi a komórkami efektorowymi posiadającymi receptor Fc, co wyzwala uwalnianie mediatorów cytotoksycznych10. Komórki NK uwalniają cytotoksyczną zawartość swoich ziarnistości zawierającą perforynę, aby wytworzyć pory w błonie komórkowej komórki docelowej, oraz granzym (wyzwalający szlaki sygnalizacyjne śmierci komórki) do synapsy immunologicznej, co prowadzi do apoptozy komórek nowotworowych (patrz Rycina 1).
<img alt="Schemat oddziaływania komórek NK i komórek nowotworowych z procesem wiązania FcγR-trastuzumab-HER2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64485/64485fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Oddziaływania komórek efektorowych i docelowych w ADCC. Receptor Fcγ na powierzchni komórki efektorowej NK rozpoznaje region Fc przeciwciała anty-HER2 trastuzumabu, swoistego dla cząsteczki HER2 wykazywanej na powierzchni komórki nowotworowej. W ten sposób między obiema komórkami tworzy się tzw. synapsa immunologiczna, co indukuje ukierunkowaną egzocytozę ziarnistości cytotoksycznych komórki efektorowej. Uwolnione cząsteczki perforyny i granzymu prowadzą w konsekwencji do apoptozy komórki docelowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64485/64485fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wcześniej opracowano kilka testów do ilościowego oznaczania cytotoksyczności, w tym ADCC. Złotym standardem jest metoda uwalniania radioaktywnego chromu, w której komórki docelowe są znakowane radioaktywnym izotopem 51Cr, a stopień ADCC określa się poprzez pomiar radioaktywności nadpływu z lizowanych komórek docelowych11. Ze względu na oczywiste problemy wynikające ze ściśle regulowanej obsługi, przechowywania i utylizacji radioaktywnych farmaceutyków i odpadów, metoda ta staje się coraz mniej popularna wśród naukowców zajmujących się naukami o życiu. Ponadto nie nadaje się ona do zastosowań wysokoprzepustowych. Pomiar aktywności enzymów (np. dehydrogenazy mleczanowej) uwalnianych z zabitych komórek docelowych może stanowić niepromieniotwórczą alternatywę dla testu 51Cr12. Testy te nie pozwalają jednak odróżnić śmierci komórek docelowych od śmierci komórek efektorowych. Metoda elektrycznego pomiaru impedancji między komórką a podłożem (ECIS) okazała się odpowiednia do ilościowego oznaczania ADCC13, jednak aparatura ECIS nie jest dostępna w większości laboratoriów, a sama technika nie jest kompatybilna z zastosowaniami lub przesiewaniem wysokoprzepustowym. Komórki znakowane fluorescencyjnie stanowią popularną alternatywę w wielu testach biologii komórki i są często wykorzystywane w cytometrii przepływowej lub aplikacjach opartych na czytnikach płytek14,15,16. Jednak testy te często obejmują etapy płukania lub są w inny sposób niekompatybilne z zastosowaniami wysokoprzepustowymi (np. techniki oparte na cytometrii przepływowej). Niektóre popularne testy cytotoksyczności, które teoretycznie powinny nadawać się do ilościowego oznaczania ADCC, nie pozwalają na wiarygodne określenie wydajności ADCC13. Ostatnio, wraz z upowszechnieniem fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, testy obrazowe o wysokiej zawartości danych (high-content assays) stają się coraz bardziej popularne w różnych obszarach nauk o życiu17. Z jednej strony sprzęt do obrazowania komórek jest obecnie dość powszechny, a z drugiej strony z uzyskanych obrazów można zebrać niemal nieograniczoną liczbę parametrów morfologicznych. Dlatego postawiliśmy sobie za cel opracowanie testu ADCC kompatybilnego z przesiewaniem wysokoprzepustowym o wysokiej zawartości danych oraz wykazanie jego przydatności do przesiewania bibliotek związków.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy oparty na obrazowaniu test ADCC oraz demonstrujemy, w jaki sposób test ten może być wykorzystany do wysokoprzepustowego przesiewu obrazowego (High-Content Screening, HCS) w celu identyfikacji związków modulujących ADCC. Model opiera się na komórkach docelowych raka piersi JIMT-1, komórkach efektorowych CD16.176V.NK-92 oraz humanizowanym monoklonalnym przeciwciele anty-HER2 trastuzumab. Dzięki tej metodzie możliwe jest zidentyfikowanie leków, które mogą nasilać działanie NK w niszczeniu guzów, lub uzyskanie wglądu w mechanizm ADCC pośredniczonego przez komórki NK poprzez identyfikację małych cząsteczek zakłócających ADCC. Sugerujemy, że naukowcy z dziedziny nauk o życiu, dążący do ilościowego określenia cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki, ze szczególnym uwzględnieniem ADCC, mogą odnieść korzyść z zastosowania tego testu zarówno w badaniach podstawowych, jak i w rozwoju leków. Test ten może stanowić alternatywę w przypadku, gdy laboratorium ma dostęp do obrazowania fluorescencyjnego i analizy ilościowej obrazów oraz posiada w tym zakresie pewne doświadczenie.

<table><tbody><tr><td>5-fluorouracyl</td><td>Applichem</td><td>A7686</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka Cell Carrier Ultra</td><td>PerkinElmer</td><td>LLC 6055302</td><td></td></tr><tr><td>Betulin</td><td>Sigma</td><td>B9757</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>CD16.176V.NK92 ogniwa</td><td>Nankwest Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerulenin</td><td>ChemCruz</td><td>sc-396822</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200896</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Colchicine</td><td>Sigma</td><td>C9754</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Concanavalin-A</td><td>Calbiochem</td><td>234567</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>w biblioteka związków</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td>w JIMT-1 EGFP medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Etopozyd</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td>E1383</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biosurica</td><td>FB-1090/500</td><td>JIMT-1 EGFP i pożywka NK</td></tr><tr><td>Fisetin</td><td>Sigma</td><td>F4043</td><td>w bibliotece</td></tr> <tr><td>złożonejRobot do obsługi cieczy Freedom EVO</td><td>, TECAN,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gallotannin,</td><td>Fluka, Chemical Corp.</td><td>16201</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>35,050&ndash; 061</td><td>w oprogramowaniu NK medium</td></tr><tr><td>Harmony&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2 (Herzuma)</td><td>EGIS Pharmaceuticals, Budapeszt, Węgry</td><td>N/A Humulin</td><td></td></tr><tr><td>R (insulina)</td><td>Eli Lilly</td><td>HI0219</td><td>JIMT-1 EGFP podłoże</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis Hung&aacute; ria Kft.</td><td>PHC0026</td><td>w pożywce NK</td></tr><tr><td>Isatin</td><td>Sigma</td><td>114618</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11,140&ndash; 050</td><td>w podłożu NK</td></tr><tr><td>Na-pirogronian</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td>w podłożu</td></tr><tr><td>NK Naringenina</td><td>Sigma</td><td>N5893</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>NQDI-1</td><td>Sigma</td><td>SML0185</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Sprzęt do analizy wysokiej zawartości Opera Phenix</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna</td><td>Biosura</td><td>LM-A4118</td><td>JIMT-1 EGFP i pożywka NK</td></tr><tr><td>Pentoksyfilline</td><td>Sigma</td><td>P1784</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td>do mycia komórek</td></tr><tr><td>Podofilotoksyna</td><td>Sigma</td><td>P4405</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Kwercetyna</td><td>Sigma</td><td>Q4951</td><td>w bibliotece</td></tr> <tr><td>złożonejKwas garbnikowy</td><td>Sigma</td><td>T8406</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Temozolomid</td><td>Sigma</td><td>T2577</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4% roztwór</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>Siarczan winkrystyny</td><td>Sigma</td><td>V0400000</td><td>w bibliotece złożonej</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Sigma</td><td>M8042</td><td>w podłożu NK</td></tr></tbody></table>

test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunoterapia przeciwciałami specyficznymi dla antygenu lub inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych zrewolucjonizowała terapię raka piersi. Komórki raka piersi wykazujące ekspresję receptora naskórkowego czynnika wzrostu HER2 mogą być celem przeciwciała anty-HER-2 trastuzumabu. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) jest ważnym mechanizmem związanym z przeciwnowotworowym działaniem HER-2. Trastuzumab związany z komórkami nowotworowymi może być rozpoznawany przez receptory Fc komórek efektorowych ADCC (np. komórek NK), makrofagów i granulocytów), wyzwalając aktywność cytotoksyczną tych komórek odpornościowych prowadzącą do śmierci komórek nowotworowych. Postanowiliśmy opracować oparty na obrazie test do oznaczania ilościowego ADCC w celu identyfikacji nowych związków modulatorów ADCC za pomocą badań przesiewowych o wysokiej zawartości. W teście komórki raka piersi JIMT-1 z nadekspresją HER2 są hodowane wspólnie z komórkami NK-92 w obecności trastuzumabu, a śmierć komórek docelowych określa się ilościowo za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii i ilościowej analizy obrazu. Komórki docelowe odróżnia się od komórek efektorowych na podstawie ich fluorescencji EGFP. Pokazujemy, w jaki sposób biblioteki związków mogą być testowane w teście w celu identyfikacji leków modulujących ADCC. W tym celu stworzono płytkę testową biblioteki związków chemicznych przy użyciu losowo wybranych chemikaliów wysokowartościowych z półki laboratoryjnej. W bibliotece testowej znalazły się również trzy związki destabilizujące mikrotubule (kolchicyna, winkrystyna, podofilotoksyna), które mogą zakłócać migrację i degranulację komórek NK. Badanie przesiewowe zidentyfikowało wszystkie trzy związki kontroli pozytywnej jako trafienia potwierdzające przydatność metody do identyfikacji leków modyfikujących ADCC w bibliotece chemicznej. Dzięki temu testowi można przeprowadzić badania przesiewowe biblioteki związków w celu zidentyfikowania związków wzmacniających ADCC, które mogą być stosowane jako uzupełniające środki terapeutyczne w leczeniu pacjentów otrzymujących immunoterapię przeciwnowotworową. Ponadto metoda ta może być również stosowana do identyfikacji wszelkich niepożądanych skutków ubocznych hamujących ADCC leków terapeutycznych przyjmowanych przez pacjentów onkologicznych w różnych wskazaniach.

Aby zademonstrować działanie testu w praktyce, stworzono bibliotekę testową składającą się z 16 związków wybranych losowo z zasobów laboratoryjnych (Rysunek 3). Dodatkowo, jako kontrolę negatywną zastosowano DMSO, a jako kontrole pozytywne trzy związki hamujące polimeryzację mikrotubul (kolchicynę, winkrystynę i podofilotoksynę). Oczekiwano, że te ostatnie zahamują ADCC poprzez zakłócenie migracji komórek NK do komórek nowotworowych oraz degranulacji komórek NK. Wszystkie związki testowe ora...

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, w skrócie ADCC, może być wywoływana przez komórki NK , które nazywamy komórkami NK, granulocytami i makrofagami. Są to komórki efektorowe ADCC. Jeśli przeciwciało, takie jak trastuzumab, które jest skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu, HER2, wiąże się z komórkami nowotworowymi, wówczas te komórki efektorowe wykorzystują swoje receptory FcyR do wiązania stałego regionu FC przeciwciał.Przeciwciało łączy komórki nowotworowe i komórki efektorowe zawierające receptor FcyR, wywołując uwalnianie ich cytotoksycznych granulek. Prowadzi to do apoptozy komórek nowotworowych. ADCC może być skuteczny w przypadku nowotworów, które nie reagują na antyproliferacyjne działanie trastuzumabu.Aby skonfigurować system ADCC, musimy wspólnie inkubować komórki raka piersi anty-HER2-dodatnie JIMT-1 z linią komórkową NK-92 w obecności przeciwciała anty-HER2 trastuzumabu. Linia komórkowa JIMT-1, której używamy do testu, stabilnie wyraża białko zielonej fluorescencji. Najpierw zakoduj 96-dołkową płytkę sitową o wysokiej zawartości za pomocą pożywki JIMT.Odpipetować 50 mikrolitrów pożywki do każdego dołka płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 na jedną godzinę. Powłoka ma kluczowe znaczenie dla mocowania ogniw JIMT-1 do szklanej powierzchni płytki.Na etapie powlekania trypsynizuj komórki JIMT-1. Umyj komórki dwoma mililitrami sterylnego PBS. Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA do kolby.Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze CO2 na 10 minut. Po inkubacji postukaj w kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 się odłączyły. Zatrzymaj trawienie za pomocą dwóch mililitrów pożywki JIMT-1 i zbierz zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki.Następnie policz komórki JIMT-1 za pomocą błękitu trypanowego w niebieskiej komorze odlewanej. Dostosuj liczbę komórek do 133 000 komórek na ml. Odessać podłoże powlekające, a następnie dodać 75 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.Pozwól komórkom przyczepić się podczas całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2. Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 50 mikrolitrów świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek, a następnie przenieść płytkę do wysokoprzepustowego laboratorium przesiewowego. Robot służy do przenoszenia badanych związków na mikropłytki przesiewowe o wysokiej zawartości.Za pomocą ramienia robota robot chwyta jednostkę narzędziową do sworzni, która jest skalibrowana do przenoszenia 25 nanolitrów. Przenieś łącznie 100 nanolitrów badanych związków z płytki biblioteki związków na płytkę testową w czterech etapach. Upewnij się, że końcowe stężenie badanych związków wynosi 20 mikromolowych.Pomiędzy każdym krokiem najpierw umyj narzędzie do szpilek w 50% DMSO, a następnie w 70% etanolu. Inkubować płytkę przez godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Hodowla komórek NK w kolbach do hodowli tkankowych T25.Podczas gdy trwa leczenie farmakologiczne komórek JIMT-1, zbierz komórki NK z kolby T25 do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Policz komórki NK-92 za pomocą błękitu trypanowego w niebieskiej komorze zliczającej. Dostosuj liczbę komórek do 400 000 komórek na ml.Odwirować objętość zawiesiny komórek NK, która zawiera 400 000 komórek na ml w temperaturze 150 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Przygotować pożywkę ADCC, dodając 20 mikrogramów na ml przeciwciała anty-HER2 trastuzumabu do pożywki JIMT-1. Odpipetować 20 000 komórek NK w 50 mikrolitrach pożywki ADCC do docelowych komórek JIMT-1 GFP.Ostateczna objętość wynosi 100 mikrolitrów, a końcowe stężenie trastuzumabu wynosi 10 mikrogramów na ml. Umieść płytkę testową w sprzęcie do analizy o wysokiej zawartości, który ma wbudowany inkubator ustawiony na 37 stopni Celsjusza. Płyty są obrazowane w dwóch punktach czasowych.Po pierwsze, uzyskujemy obrazy natychmiast po dodaniu komórek efektorowych do komórek docelowych, a drugi zestaw obrazów jest wykonywany po trzech godzinach od dodania komórek NK. Najpierw wybierz rodzaj mikropłytki. Używaj 96-dołkowych płytek sitowych o wysokiej zawartości.Wybierz, aby wybrać ostrość, ponieważ test jest przeprowadzany na płytkach z obiektywem 10x w trybie niekonfokalnym. Wybierz kategoryzację dwóch, aby podwoić stosunek sygnału do szumu. Wybierz odpowiednie kanały, czas ekspozycji, moc lasera, płaszczyznę ostrości i długość fali.Wykonaj zdjęcia w jasnym polu o długości fali 650-760 nanometrów i wykryj komórki JIMT-1 transdukowane przez EGFP o wzbudzeniu 488 nanometrów i długości fali emisji 500-550 nanometrów. Przed rozpoczęciem pomiaru należy wykonać przykładowe zdjęcia z funkcją migawki w celu sprawdzenia poprawności ustawień. Na koniec ustaw liczbę pól i liczbę punktów czasowych dla obrazowania.Wybierz na przykład dziewięć pól i dwa punkty czasowe. Aby przeanalizować wydajność ADCC, policz żywotne komórki JIMT-1 w kontrolnej studni ADCC. Użyj modułu drobnych komórek, aby wykryć obszary na obrazie, które odpowiadają komórkom.Wykryj każdą komórkę jako obszar obrazu, który ma wyższą intensywność fluorescencji niż jego otoczenie. Wybierz komórki za pomocą wbudowanego algorytmu M o średnicy 80 mikrometrów. Ustawia czułość podziału, która rozdziela duży obiekt na mniejsze, na wartość 0,5.Dostosuj wspólny próg, który jest najniższym poziomem intensywności pikseli, do zera. Wyklucz wykrywanie obszaru tła o wysokiej intensywności fluorescencji EGFP w dwóch krokach. Najpierw zastosuj funkcję obliczania właściwości intensywności, aby określić intensywność fluorescencji EGFP we wcześniej wybranym regionie komórek.Następnie należy ustawić minimalny i maksymalny próg intensywności za pomocą opcji wyboru populacji, tak abyśmy uzyskali liczbę żywotnych komórek docelowych JIMT-1 GFP na końcu ADCC. Oblicz wydajność ADCC, dzieląc numer komórki wykrytej po trzech godzinach przez numer komórki wykrytej w czasie zero. Chcielibyśmy zademonstrować praktyczne zastosowanie naszej metody za pomocą reprezentatywnych wyników.Ustawiliśmy płytkę testową z 16 związkami losowo zdjętymi z półek. Uwzględniliśmy również trzy związki: kolchicynę, winkrystynę i podofilotoksynę o oczekiwanym działaniu hamującym ADCC. DMSO zastosowano jako kontrolę negatywną.Każdy lek stosowano w czterech powtórzeniach na płytce. Rysunek przedstawia wynik ekranu testowego. W grupie minus NK badano toksyczność leków na komórkach JIMT-1.W grupie z dodatnim NK dodano komórki NK i trastuzumab, co spowodowało około 50% cytotoksyczności. Oczekiwany efekt inhibitora ADCC trzech badanych związków można było wykryć za pomocą testu. Stworzyliśmy system testów współhodowlanych modelujący klinicznie istotną interakcję między komórkami raka piersi, komórkami NK i terapeutycznym przeciwciałem monoklonalnym trastuzumabem.Test opiera się na zautomatyzowanej mikroskopii połączonej z analizą obrazu i nadaje się do badań przesiewowych bibliotek związków chemicznych w celu identyfikacji leków modyfikujących ADCC. Procedura ta może być potencjalnie wykorzystana do identyfikacji cząsteczek adiuwantowych, które nasilają odpowiedź przeciwnowotworową lub do identyfikacji substancji chemicznych o niekorzystnym wpływie.

high-content-screening-assay-for-identification-antibody-dependent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje test do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP) przez fagocyty mleka matki. Znakowane fluorescencyjnie mikrosfery sprzężone z kompleksem antygen-przeciwciało są łączone z zawiesiną komórkową wyizolowaną z mleka matki w celu wywołania zależnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej przez leukocyty fagocytarne. Po znakowaniu komórek przeciwciałami przeciwko powszechnemu antygenowi leukocytarnemu (CD45), cytometria przepływowa służy do pomiaru intensywności...

Test in vitro do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał za pomocą fagocytów

Ten film demonstruje test in vitro oceniający cytotoksyczne działanie limfocytów CAR T na sferoidy guza 3D wyrażające białka fluorescencyjne. W tej ocenie wykorzystuje się czerwoną sondę fluorescencyjną Annexin V, która wiąże się z odsłoniętymi resztami fosfatydyloseryny na zewnętrznym płatku apoptotycznych komórek rakowych po interakcjach z komórkami CAR T. Czerwona fluorescencja emitowana przez sondę pomaga w odróżnieniu tych komórek od zdrowych emitujących zieloną fluorescencję.

Test in vitro do oceny cytotoksyczności limfocytów CAR T wobec sferoid nowotworowych

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Celem badania była ocena biologicznego wpływu 15 składników dymu papierosowego przy użyciu kombinacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji i platformy opartej na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do oceny toksykologicznej in vitro. Badanie to dostarcza informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i sposobów działania badanych związków.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Poznaj zautomatyzowaną metodę przesiewową do identyfikacji związków modulujących cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał w raku piersi. Ta technika oparta na obrazowaniu umożliwia szybkie testowanie bibliotek chemicznych w celu odkrycia leków wspomagających aktywność komórek NK.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową (Wideo) | JoVE Journal

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Przeglądaj więcej filmów