Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, w skrócie ADCC, może być wywoływana przez komórki NK , które nazywamy komórkami NK, granulocytami i makrofagami. Są to komórki efektorowe ADCC. Jeśli przeciwciało, takie jak trastuzumab, które jest skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu, HER2, wiąże się z komórkami nowotworowymi, wówczas te komórki efektorowe wykorzystują swoje receptory FcyR do wiązania stałego regionu FC przeciwciał.

Przeciwciało łączy komórki nowotworowe i komórki efektorowe zawierające receptor FcyR, wywołując uwalnianie ich cytotoksycznych granulek. Prowadzi to do apoptozy komórek nowotworowych. ADCC może być skuteczny w przypadku nowotworów, które nie reagują na antyproliferacyjne działanie trastuzumabu.

Aby skonfigurować system ADCC, musimy wspólnie inkubować komórki raka piersi anty-HER2-dodatnie JIMT-1 z linią komórkową NK-92 w obecności przeciwciała anty-HER2 trastuzumabu. Linia komórkowa JIMT-1, której używamy do testu, stabilnie wyraża białko zielonej fluorescencji. Najpierw zakoduj 96-dołkową płytkę sitową o wysokiej zawartości za pomocą pożywki JIMT.

Odpipetować 50 mikrolitrów pożywki do każdego dołka płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 na jedną godzinę. Powłoka ma kluczowe znaczenie dla mocowania ogniw JIMT-1 do szklanej powierzchni płytki.

Na etapie powlekania trypsynizuj komórki JIMT-1. Umyj komórki dwoma mililitrami sterylnego PBS. Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA do kolby.

Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze CO2 na 10 minut. Po inkubacji postukaj w kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 się odłączyły. Zatrzymaj trawienie za pomocą dwóch mililitrów pożywki JIMT-1 i zbierz zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki.

Następnie policz komórki JIMT-1 za pomocą błękitu trypanowego w niebieskiej komorze odlewanej. Dostosuj liczbę komórek do 133 000 komórek na ml. Odessać podłoże powlekające, a następnie dodać 75 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.

Pozwól komórkom przyczepić się podczas całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2. Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 50 mikrolitrów świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek, a następnie przenieść płytkę do wysokoprzepustowego laboratorium przesiewowego. Robot służy do przenoszenia badanych związków na mikropłytki przesiewowe o wysokiej zawartości.

Za pomocą ramienia robota robot chwyta jednostkę narzędziową do sworzni, która jest skalibrowana do przenoszenia 25 nanolitrów. Przenieś łącznie 100 nanolitrów badanych związków z płytki biblioteki związków na płytkę testową w czterech etapach. Upewnij się, że końcowe stężenie badanych związków wynosi 20 mikromolowych.

Pomiędzy każdym krokiem najpierw umyj narzędzie do szpilek w 50% DMSO, a następnie w 70% etanolu. Inkubować płytkę przez godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Hodowla komórek NK w kolbach do hodowli tkankowych T25.

Podczas gdy trwa leczenie farmakologiczne komórek JIMT-1, zbierz komórki NK z kolby T25 do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Policz komórki NK-92 za pomocą błękitu trypanowego w niebieskiej komorze zliczającej. Dostosuj liczbę komórek do 400 000 komórek na ml.

Odwirować objętość zawiesiny komórek NK, która zawiera 400 000 komórek na ml w temperaturze 150 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Przygotować pożywkę ADCC, dodając 20 mikrogramów na ml przeciwciała anty-HER2 trastuzumabu do pożywki JIMT-1. Odpipetować 20 000 komórek NK w 50 mikrolitrach pożywki ADCC do docelowych komórek JIMT-1 GFP.

Ostateczna objętość wynosi 100 mikrolitrów, a końcowe stężenie trastuzumabu wynosi 10 mikrogramów na ml. Umieść płytkę testową w sprzęcie do analizy o wysokiej zawartości, który ma wbudowany inkubator ustawiony na 37 stopni Celsjusza. Płyty są obrazowane w dwóch punktach czasowych.

Po pierwsze, uzyskujemy obrazy natychmiast po dodaniu komórek efektorowych do komórek docelowych, a drugi zestaw obrazów jest wykonywany po trzech godzinach od dodania komórek NK. Najpierw wybierz rodzaj mikropłytki. Używaj 96-dołkowych płytek sitowych o wysokiej zawartości.

Wybierz, aby wybrać ostrość, ponieważ test jest przeprowadzany na płytkach z obiektywem 10x w trybie niekonfokalnym. Wybierz kategoryzację dwóch, aby podwoić stosunek sygnału do szumu. Wybierz odpowiednie kanały, czas ekspozycji, moc lasera, płaszczyznę ostrości i długość fali.

Wykonaj zdjęcia w jasnym polu o długości fali 650-760 nanometrów i wykryj komórki JIMT-1 transdukowane przez EGFP o wzbudzeniu 488 nanometrów i długości fali emisji 500-550 nanometrów. Przed rozpoczęciem pomiaru należy wykonać przykładowe zdjęcia z funkcją migawki w celu sprawdzenia poprawności ustawień. Na koniec ustaw liczbę pól i liczbę punktów czasowych dla obrazowania.

Wybierz na przykład dziewięć pól i dwa punkty czasowe. Aby przeanalizować wydajność ADCC, policz żywotne komórki JIMT-1 w kontrolnej studni ADCC. Użyj modułu drobnych komórek, aby wykryć obszary na obrazie, które odpowiadają komórkom.

Wykryj każdą komórkę jako obszar obrazu, który ma wyższą intensywność fluorescencji niż jego otoczenie. Wybierz komórki za pomocą wbudowanego algorytmu M o średnicy 80 mikrometrów. Ustawia czułość podziału, która rozdziela duży obiekt na mniejsze, na wartość 0,5.

Dostosuj wspólny próg, który jest najniższym poziomem intensywności pikseli, do zera. Wyklucz wykrywanie obszaru tła o wysokiej intensywności fluorescencji EGFP w dwóch krokach. Najpierw zastosuj funkcję obliczania właściwości intensywności, aby określić intensywność fluorescencji EGFP we wcześniej wybranym regionie komórek.

Następnie należy ustawić minimalny i maksymalny próg intensywności za pomocą opcji wyboru populacji, tak abyśmy uzyskali liczbę żywotnych komórek docelowych JIMT-1 GFP na końcu ADCC. Oblicz wydajność ADCC, dzieląc numer komórki wykrytej po trzech godzinach przez numer komórki wykrytej w czasie zero. Chcielibyśmy zademonstrować praktyczne zastosowanie naszej metody za pomocą reprezentatywnych wyników.

Ustawiliśmy płytkę testową z 16 związkami losowo zdjętymi z półek. Uwzględniliśmy również trzy związki: kolchicynę, winkrystynę i podofilotoksynę o oczekiwanym działaniu hamującym ADCC. DMSO zastosowano jako kontrolę negatywną.

Każdy lek stosowano w czterech powtórzeniach na płytce. Rysunek przedstawia wynik ekranu testowego. W grupie minus NK badano toksyczność leków na komórkach JIMT-1.

W grupie z dodatnim NK dodano komórki NK i trastuzumab, co spowodowało około 50% cytotoksyczności. Oczekiwany efekt inhibitora ADCC trzech badanych związków można było wykryć za pomocą testu. Stworzyliśmy system testów współhodowlanych modelujący klinicznie istotną interakcję między komórkami raka piersi, komórkami NK i terapeutycznym przeciwciałem monoklonalnym trastuzumabem.

Test opiera się na zautomatyzowanej mikroskopii połączonej z analizą obrazu i nadaje się do badań przesiewowych bibliotek związków chemicznych w celu identyfikacji leków modyfikujących ADCC. Procedura ta może być potencjalnie wykorzystana do identyfikacji cząsteczek adiuwantowych, które nasilają odpowiedź przeciwnowotworową lub do identyfikacji substancji chemicznych o niekorzystnym wpływie.