Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Długoterminowa i krótkoterminowa metoda izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych lub HSC pomoże naukowcom lepiej zrozumieć mechanizmy odnawiania komórek i biologiczne podstawy heterogeniczności w kompartmencie HSC. Zidentyfikowano czynnik transkrypcyjny Hoxb5, który może być wyłącznym markerem długotrwałych HSC. Na tej podstawie ustalono linię myszy reporterowych Hoxb5 i z powodzeniem wyizolowano długoterminowe i krótkoterminowe HSC.

Aby rozpocząć pobieranie komórek szpiku kostnego dawcy, wysterylizuj moździerz i tłuczek 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Zrównoważ je z buforem barwiącym komórki, składającym się z suplementów zawierających PBS bez wapnia i magnezu. Umieść kości wyizolowane od samca myszy Hoxb5-tri-mCherry dawcy w moździerzu i dodaj trzy mililitry buforu barwiącego komórki.

Rozetrzyj kości tłuczkiem, a następnie zdezagreguj grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania i przenieś zawiesinę komórkową przez sitko do komórek o średnicy 100 mikronów do 50-mililitrowej probówki. Powtórz proces ze świeżym buforem do barwienia komórek, aż roztwór stanie się klarowny. Zwykle wystarczy powtórzenie trzy razy, aby uzyskać klarowne rozwiązanie.

Po odizolowaniu kości udowych i piszczelowych od myszy kongenicznej CD45.1.2, odetnij oba końce kości ostrymi, sterylnymi nożyczkami. Za pomocą igły o rozmiarze 23 G wyposażonej w pięciomililitrową strzykawkę wypełnioną lodowatym buforem zawiesiny komórek, wypłucz szpik kostny do sterylnego naczynia do hodowli komórek zawierającego bufor zawiesiny komórek. Zdezagreguj grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania, a następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów za pomocą pipety P1000.

Aby skonfigurować bramkowanie, przygotuj próbkę zgodnie z instrukcjami podanymi w tekście i przenieś jej 400 mikrolitrów do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie z zatrzaskową nasadką sitkową o grubości 35 mikronów. Przygotować i dodać do próbki odczynnik do odcedzania martwych komórek przed analizą, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie włącz cytometr przepływowy i uruchom oprogramowanie analityczne zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie naciśnij Załaduj, aby rozpocząć pobieranie danych. Po wykluczeniu dubletów, martwych komórek i komórek dodatnich linii, bramka frakcji ujemnej linii, c-kit-dodatniej, Sca-1-dodatniej. Następnie wyklucz frakcję Flk2-dodatnią.

Następnie bramkują Hoxb5-dodatnie lub Hoxb5-ujemne pHSC w frakcji CD150-dodatniej, CD34-ujemnej lub niskiej. Następnie przygotuj 1,5-milimetrową niskobiałkową rurkę wiążącą z 600 mikrolitrami PBS bez wapnia i magnezu, uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS. Aby przeprowadzić sortowanie pHSC Hoxb5-dodatniego lub Hoxb5-ujemnego, należy ustawić przygotowaną 1,5-mililitrową probówkę wiążącą o niskiej zawartości białka na urządzeniu do sortowania i posortować Hoxb5-dodatnie lub Hoxb5-ujemne pHSC do probówki, stosując wcześniej wspomnianą strategię bramkowania.

W pierwszym sortowaniu należy użyć wydajności z trybu dokładności sortowania. Ustawić 96-dołkową płytkę z wcześniej przygotowanymi komórkami podporowymi na stoliku automatycznego osadzania komórek. Następnie ustaw 1,5-mililitrową rurkę wiążącą o niskiej zawartości białka na port ładowania cytometru przepływowego.

Sortuj Hoxb5-dodatnie lub Hoxb5-ujemne pHSC na 96-dołkową płytkę z komórkami nośnymi, stosując wcześniej wspomnianą strategię bramkowania. Sortuj 10 Hoxb5-dodatnich lub Hoxb5-ujemnych pHSC, aby przetestować ich zdolność do samoodnawiania. Wykresy cytometrii przepływowej analizy szpiku kostnego myszy Hoxb5-tri-mCherry dawcy wykazały, że około 20 do 25% komórek we frakcji pHSC zdefiniowanej przez linię ujemną, c-kit-dodatnią, Sca-1-dodatnią, CD150-dodatnią, CD34-ujemną lub niską, Flk2-ujemną było Hoxb5-dodatnie pHSC.

Pokazano tutaj reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej analizy krwi obwodowej myszy biorców. Co więcej, analiza krwi obwodowej myszy biorców po pierwotnym przeszczepie wykazała, że chociaż Hoxb5-dodatnie i Hoxb5-ujemne pHSC wykazywały podobny chimeryzm dawcy cztery tygodnie po przeszczepie, ciągłą hematopoezę obserwowano tylko u biorców Hoxb5-dodatnich pHSC. Hoxb5-ujemne HSC zaczęły tracić zdolność do wytwarzania komórek krwiotwórczych osiem tygodni po przeszczepie.

W analizie wtórnego przeszczepu tylko biorcy pHSC z dodatnim wynikiem Hoxb5 wykazywali silną hematopoezę. W przeciwieństwie do tego, komórki dawcy prawie nie obserwowano u myszy z biorcą pHSC Hoxb5-ujemnym, co sugeruje, że pHSC Hoxb5-ujemne straciły zdolność do samoodnawiania się w ciągu 16 tygodni od pierwotnego przeszczepu. Protokół ten trwa zwykle od dziewięciu do 12 godzin, dlatego ważne jest, aby utrzymać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cały czas trwania procedur, aby utrzymać żywotność komórek.