Name: Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę izolacji długotrwałych i krótkoterminowych komórek macierzystych krwi przy użyciu systemu reporterowego Hoxb5. Technika ta pozwala badać mechanizmy odnowy komórkowej i heterogeniczność populacji HSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Hiroshi Kiyonari za opiekę nad zwierzętami i dostarczenie myszy odbiorcom w RIKEN BDR, a także Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka i Masaki Miyahashi za zarządzanie laboratorium na Uniwersytecie Kobe. Autorzy bardzo doceniają również nieustanne wsparcie dla tych prac. Masanori Miyanishi był wspierany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant Grants Numery JP17K07407 i JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders oraz AMED-PRIME, AMED w ramach grantu o numerze JP18gm6110020. Taro Sakamaki jest wspierany przez JSPS KAKENHI Granty o numerach JP21K20669 i JP22K16334 oraz był wspierany przez JSPS Core-to-Core Program oraz RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi otrzymał wsparcie od JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Wstępne kondycjonowanie myszy biorcy
<ol>
	<li>Przygotuj samce myszy kongenicznych C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni jako myszy biorców. Liczba myszy biorców zależy od protokołu eksperymentalnego. Zazwyczaj przygotowujemy 10-20 myszy na każdy stan.
	<ol>
		<li>Nakarm myszy wysterylizowaną wodą uzupełnioną enrofloksacyną (170 mg/l). Ponieważ napromieniowane myszy biorcze są bardzo podatne na infekcje, należy utrzymywać klatki w jak największej czystości. 
		UWAGA: Suplementacja antybiotykami rozpoczyna się 24 godziny przed napromienianiem i trwa przez 3 tygodnie po przeszczepie, aby uniknąć infekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napromienianie całego ciała
	<ol>
		<li>Napromienianie całego ciała niszczy komórki szpiku kostnego biorcy, aby zapewnić wszczepienie komórek dawcy. Przenieś myszy biorcę do klatki do napromieniania. Myszy biorcę należy napromieniować w sposób śmiertelny pojedynczą dawką 8,7 Gy na 12-16 godzin przed przeszczepem. 
		UWAGA: Dawka i czas promieniowania mogą się różnić w zależności od sprzętu. Śmiertelna dawka promieniowania powinna zostać potwierdzona za pomocą naświetlacza i szczepu myszy badacza.</li>
		<li>Wróć do ich klatek po napromieniowaniu całego ciała.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie komórek szpiku kostnego dawcy
<ol>
	<li>Przygotuj samca myszy Hoxb5-tri-mCherry w wieku 12 tygodni i poddaj mysz eutanazji poprzez ekspozycję na CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub przy użyciu metod zatwierdzonych przez lokalną komisję etyki zwierząt. 
	UWAGA: Objętość odczynnika na mysz jest opisana w poniższych krokach.</li>
	<li>W sterylnych warunkach usuń skórę i odsłoń kości (kość udowa, piszczelowa, miednica, kość ramienna). Wytnij główne mięśnie i zabierz kości (kość udową, piszczelową, miednicę, kość ramienną) od myszy. Umieść je w sterylnych naczyniach do hodowli komórkowych z lodowatym PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+.</li>
	<li>Przytnij mięśnie i tkanki włókniste z kości za pomocą pęsety, małych nożyczek i chusteczek, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Uważaj, aby nie złamać kości podczas tego kroku. Wyrzuć wszelkie złamane kości, aby zachować sterylność.</li>
	<li>Wysterylizuj moździerz i tłuczek 70% etanolem (EtOH) i pozwól im całkowicie wyschnąć. Zrównoważyć buforem barwiącym komórki (PBS wolny od Ca2 + i Mg2 + uzupełniony 2% inaktywowanym termicznie FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).</li>
	<li>Umieść kości w moździerzu i dodaj 3 ml buforu barwiącego komórki. Zmiażdż kości tłuczkiem. Zdezagregować grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Powtarzaj krok 2.5, aż roztwór stanie się klarowny. Zwykle wystarczą trzy razy.</li>
</ol>
3. Separacja komórek c-kit+ przez sortowanie magnetyczne
<ol>
	<li>Barwienie przeciwciał do sortowania magnetycznego
	<ol>
		<li>Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do barwienia komórek. Dodać 10 μl szczurzej IgG (5 mg/ml) w celu zmniejszenia nieswoistego wiązania przeciwciał i delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety P1,000. Inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać przeciwciało c-Kit (klon 2B8) o stężeniu 4 μg/ml i wymieszać z pipetą P1,000. Inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Dodaj 5 ml buforu do barwienia komórek i dobrze wymieszaj. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g, 4 °C, 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do barwienia komórek.</li>
		<li>Dodaj 35 μl mikrogranulek anty-APC, aby wzbogacić komórki c-Kit+ i wymieszaj z pipetą P1,000. Inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Dodaj 4-5 ml buforu barwiącego komórki. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do barwienia komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Magnetyczne sortowanie ogniw c-Kit+
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby posortować komórki. Krótko mówiąc, zalać magnetyczną kolumnę sortującą 3 ml buforu do barwienia komórek. Przefiltrować próbkę (1 ml) przez sitko o wielkości 40 μm i załadować próbkę do magnetycznej kolumny sortującej.</li>
		<li>Przemyć, dodając trzykrotnie 3 ml buforu do barwienia komórek. Bufor do barwienia komórek należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty.</li>
		<li>Umieść magnetyczną kolumnę sortującą na lodowatej probówce o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml buforu do barwienia komórek. Wypłukać komórki, mocno wciskając tłok do kolumny. Utrzymuj przepływ na lodzie. 
		UWAGA: W przypadku przypadkowej utraty próbki utrzymujemy przepływ do końca eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie krwiotwórczych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Odwirować próbkę przygotowaną w kroku 3.2.3 w temperaturze 400 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać przeciwciało CD34 (klon RAM34) o stężeniu 50 μg/ml do osadu i inkubować na lodzie przez 60 min. 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie komórek podporowych w ciągu pierwszej godziny inkubacji z CD34 w celu skrócenia czasu przetwarzania.</li>
	<li>Przygotować główną mieszaninę przeciwciał zgodnie z tabelą 1. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do próbki i inkubować na lodzie przez 30 minut. Przeciwciało przeciwko antygenowi CD34 (klon; RAM34) wymaga 90 minut na wystarczające zabarwienie.</li>
	<li>Dodaj 4-5 ml buforu do barwienia komórek. Odwirować próbkę w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Dodać streptawidynę-BUV737 w stężeniu 3 μg/ml do osadu i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Dodaj 4-5 ml buforu do barwienia komórek. Odwirować próbkę w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl buforu do barwienia komórek. Próbkę należy przechowywać na lodzie.</li>
</ol>
5. Wspomaganie przygotowania komórek
<ol>
	<li>Przygotuj mysz kongeniczną CD45.1 + CD45.2 + w wieku 12 tygodni; najlepiej, aby była to mysz dawca. Poddaj mysz eutanazji poprzez narażenie na CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub przy użyciu metod zatwierdzonych przez lokalną komisję etyki zwierząt. 
	UWAGA: W podanym przykładzie myszy kongeniczne CD45.1 + CD45.2 + zostały wyhodowane we własnym zakresie przez skrzyżowanie B6. Myszy kongeniczne CD45.1 z myszami C57BL/6J16.</li>
	<li>W sterylnych warunkach weź zarówno kości udowe, jak i piszczelowe i umieść je w sterylnych naczyniach do hodowli komórkowych z lodowatym PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+. Przytnij mięśnie i tkanki włókniste z kości za pomocą pęsety i małych nożyczek.</li>
	<li>Odetnij oba końce kości ostrymi, sterylnymi nożyczkami. Użyj igły 23 G i strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej lodowatym buforem zawiesiny komórek (PBS wolny od Ca2 + i Mg2 + uzupełniony 2% inaktywowanym termicznie FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny), aby wypłukać szpik kostny do sterylnego naczynia do hodowli komórkowych z buforem zawiesiny komórek. Zdezagregować grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm za pomocą pipety P1 000. Policzyć liczbę komórek w zawiesinie komórek za pomocą hemocytometru i przygotować zawiesinę komórek szpiku kostnego zawierającą 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieść 200 μl zawiesiny komórek szpiku kostnego (2 x 105 komórek) na 96-dołkową płytkę o okrągłym dnie. Przechowywać na lodzie aż do użycia. 
	UWAGA: Płytki z okrągłym dnem są zalecane do łatwego zbierania komórek.</li>
</ol>
6. Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC sortowanie
<ol>
	<li>Konfiguracja bramkowania
	<ol>
		<li>Przenieść 400 μl próbki przygotowanej w kroku 4.5 do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie z zatrzaskiem z sitkiem o wielkości 35 μm. Przygotuj odczynnik do barwienia martwych komórek i dodaj go do próbki przed analizą zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Włącz cytometr przepływowy i uruchom oprogramowanie analityczne zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie naciśnij przycisk Załaduj i pobierz plik data. 
		UWAGA: W celu zwiększenia czystości sortowanych komórek zaleca się stosowanie cytometru przepływowego wyposażonego w pięć laserów i dyszę o średnicy 70 μm.</li>
		<li>Po wykluczeniu dubletów, martwych komórek i komórek dodatnich pod względem linii, bramka frakcji Lineage−c-Kit + Sca-1 +. Następnie wyklucz frakcję Flk2+. Następnie bramka Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC w CD150+CD34−/low fraction (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Wykonaj kompensację nakładania się widma w pierwszym eksperymencie. 
		UWAGA: Oczekuje się, że komórki dodatnie Hoxb5 będą reprezentować 20%-25% frakcji Lineage−c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34− / lowFlk2−.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortowanie Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC
	<ol>
		<li>Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości białka z 600 μl PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+ uzupełnionego 10% inaktywowanym termicznie FBS.</li>
		<li>Umieść probówkę o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml na urządzeniu do sortowania i posortuj Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC do probówki o pojemności 1,5 ml, korzystając ze strategii bramkowania ustawionej w kroku 6.1.3. W pierwszym sortowaniu należy użyć wydajności z trybu dokładności sortowania.</li>
		<li>Ustawić 96-dołkową płytkę z komórkami podporowymi przygotowanymi w kroku 5.5 na etapie automatycznego osadzania komórek (ACDU). Umieścić 1,5 ml probówki o niskiej zawartości białka, przygotowanej w kroku 6.2.2, do portu ładowania cytometru przepływowego.</li>
		<li>Posortuj Hoxb5pos lub Hoxb5neg pHSC na 96-dołkową płytkę z komórkami nośnymi, używając strategii bramkowania ustawionej w kroku 6.1.3. Posortuj 10 punktów Hoxb5lub Hoxb5neg pHSC, aby przetestować ich zdolność do samoodnawiania. 
		UWAGA: W celu zwiększenia czystości zaleca się podwójne sortowanie. W drugim sortowaniu należy użyć czystości jako zalecanego trybu precyzji sortowania.</li>
		<li>Zazwyczaj po podwójnym sortowaniu zbiera się 500-1,000pHSC Hoxb5 pos i 1,500-4,000Hoxb5 neg pHSC. Kontynuuj procedury przeszczepu tak szybko, jak to możliwe po sortowaniu HSC, aby zwiększyć żywotność komórek (najlepiej w ciągu 1-2 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przeszczep
<ol>
	<li>Umieścić 96-dołkową płytkę posortowaną przez HSC, przygotowaną w kroku 6.2.4, na lodzie. Z 96-dołkową płytką sortowaną przez HSC należy obchodzić się w sterylnych warunkach, najlepiej w kapturze komórki.</li>
	<li>Znieczulić mysz biorcę 2% izofluranem w komorze indukcyjnej znieczulenia gazowego. Gdy zwierzę zostanie w pełni znieczulone, usuń je i połóż na boku. Aby zapewnić wystarczające znieczulenie, upewnij się, że nie ma ruchu w odpowiedzi na szkodliwy bodziec.</li>
	<li>Po potwierdzeniu prawidłowego znieczulenia należy jak najszybciej wykonać iniekcję zaoczodołową, aby zapobiec odzyskaniu przytomności przez mysz. Iniekcja retroorbitalna trwa mniej niż 30 s. 
	UWAGA: Ponieważ czas iniekcji jest krótki, zabieg kończymy bez nakładania maści okulistycznej do oczu. Jeśli jednak zabieg trwa dłużej, zalecamy zastosowanie maści okulistycznej.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować komórki na posortowanej przez HSC 96-dołkowej płytce, aby je wymieszać. Zebrać komórki dawcy na płytce sortującej za pomocą strzykawki insulinowej 30 G i wstrzyknąć je do zaoczodołowego splotu żylnego myszy biorcy. Zalecana objętość do wstrzykiwań to ≤200 μl.</li>
	<li>Obserwuj, aż myszy będą przytomne i poruszają się w czystej klatce. Wróć do klatek po potwierdzeniu ich wyzdrowienia.</li>
</ol>
8. Analiza krwi obwodowej
<ol>
	<li>Zebrać 50 μl krwi obwodowej z żyły ogonowej i ponownie zawiesić ją ze 100 μl PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+ z 2 mM EDTA. Przenieść wszystkie próbki na płytkę 96-dołkową. Odwirować w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do lizy krwinek czerwonych i inkubować na lodzie przez 3 minuty. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut, a supernatant odrzucić. Powtórz jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do barwienia komórek. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przygotować główną mieszaninę przeciwciał zgodnie z tabelą 2. Dodać 50 μl głównej mieszanki przeciwciał i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 150 μl buforu do barwienia komórek. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do barwienia komórek. Odwirować próbki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić ponownie w 200 μl buforu do barwienia komórek i dodać odczynnik do barwienia martwych komórek przed analizą zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Analizuj chimeryzm krwi obwodowej za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano wcześniej16. Zbierz krew po 4 tygodniach, 8 tygodniach, 12 i 16 tygodniach po przeszczepie, aby śledzić rekonstrukcję wieloliniową. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej znajdują się na Rysunek 3.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%2C+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241 (4861), 58-62 (1988).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Ikuta, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+hematopoietic+stem+cells+express+mouse+c-kit+but+do+not+depend+on+steel+factor+for+their+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk-2+is+a+marker+in+hematopoietic+stem+cell+differentiation%3A+A+simple+method+to+isolate+long-term+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).</li>
<li>Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+repopulation+of+irradiated+mice+with+limiting+numbers+of+purified+hematopoietic+stem+cells%3A+In+vivo+expansion+of+stem+cell+phenotype+but+not+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function.</a> Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).</li>
<li>Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+reveals+multiple+functional+defects+of+aged+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+molecular+and+functional+platelet+bias+of+aged+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells.</a> Nature Communications. 7, 11075(2016).</li>
<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evi1+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%2C+and+its+expression+marks+hematopoietic+cells+with+long-term+multilineage+repopulating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).</li>
<li>Gazit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgd5+identifies+hematopoietic+stem+cells+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li>
<li>Chen, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+marks+long-term+haematopoietic+stem+cells+and+reveals+a+homogenous+perivascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche.</a> Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).</li>
<li>Ema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+self-renewal+capacity+in+single+hematopoietic+stem+cells+from+normal+and+Lnk-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice.</a> Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).</li>
<li>Yamamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+unveils+self-renewing+lineage-restricted+progenitors+generated+directly+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells.</a> Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CD11A+on+hematopoietic+stem+cells+denotes+the+loss+of+long-term+reconstitution+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%3A+Subtypes%2C+not+unpredictable+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).</li>
<li>Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+heterogeneity%3A+Implications+for+aging+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine.</a> Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+Providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Nishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimum+requirements+for+successful+haematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation.</a> British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).</li>
<li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Tradycyjnie, HSC zdefiniowane na powierzchni komórki zostały przygotowane do badania funkcji HSC, takich jak zdolność do samoodnawiania się i multipotencja 19,20,21. Jednak zdefiniowana immunofenotypowo (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) frakcja HSC zawiera dwie dyskretne populacje HSC: LT-HSCs i ST-HSCs 9,10.<s...

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), które posiadają zdolność do samoodnawiania się i wielomocność, znajdują się na szczycie hierarchii hematopoetycznej 1,2. W 1988 roku Weissman i współpracownicy po raz pierwszy wykazali, że izolację mysich HSC można osiągnąć za pomocą cytometrii przepływowej3. Następnie stwierdzono, że frakcja zdefiniowana przez kombinację markerów powierzchni komórki, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, zawiera wszystkie HSC u myszy4,5,6,7,8.
Immunofenotypowo zdefiniowane (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC (zwane dalej pHSC) były wcześniej uważane za funkcjonalnie jednorodne. Jednak ostatnie analizy pojedynczych komórek wykazały, że pHSC nadal wykazują niejednorodność pod względem zdolności do samoodnawiania się9,10 i multipotency11,12. W szczególności wydaje się, że we frakcji pHSC istnieją dwie populacje pod względem ich zdolności do samoodnawiania: długoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste (LT-HSC), które mają ciągłą zdolność do samoodnawiania, oraz krótkoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste (ST-HSC), które mają przejściową zdolność do samoodnawiania9,10.
Do tej pory molekularne mechanizmy zdolności do samoodnawiania się, które odróżniają LT-HSC i ST-HSC, pozostają słabo poznane. Kluczowe znaczenie ma wyizolowanie obu populacji komórek w oparciu o ich zdolności do samoodnawiania się i odkrycie leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych. Wprowadzono również kilka systemów reporterskich do oczyszczania LT-HSCs13,14,15; jednak czystość LT-HSC definiowana przez każdy system reporterowy jest zmienna, a wyłączne oczyszczanie LT-HSC nie zostało do tej pory osiągnięte.
Dlatego opracowanie systemu izolacji dla LT-HSC i ST-HSC przyspieszy badania nad zdolnością do samoodnawiania się we frakcji pHSC. W izolacji LT-HSC i ST-HSC, badanie wykorzystujące wieloetapowe, bezstronne badania przesiewowe zidentyfikowało pojedynczy gen, Hoxb5, który jest niejednorodnie wyrażany w pHSC frakcja16. Ponadto analiza szpiku kostnego myszy reporterowych Hoxb5 wykazała, że około 20%-25% frakcji pHSC składa się z komórekpos Hoxb5. Konkurencyjny test transplantacyjny z użyciem Hoxb5pos pHSC i Hoxb5neg pHSC wykazał, że tylko Hoxb5pos pHSC posiadają długoterminową zdolność do samoodnawiania, podczas gdy Hoxb5neg pHSC tracą swoją zdolność do samoodnawiania się w krótkim czasie, co wskazuje, że Hoxb5 identyfikuje LT-HSC w pHSC fraction16.
Tutaj demonstrujemy krok po kroku protokół izolowania LT-HSC i ST-HSC za pomocą systemu reporterskiego Hoxb5. Ponadto przedstawiamy konkurencyjny test transplantacyjny w celu oceny zdolności do samoodnawiania się Hoxb5pos/neg pHSC (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Ten system reporterski Hoxb5 pozwala nam prospektywnie izolować LT-HSC i ST-HSC i przyczynia się do zrozumienia cech specyficznych dla LT-HSC.

<table><tbody><tr><td>0,2 ml pasek z 8 probówkami, nasadka kopułkowa</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Strzykawka do insuliny</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30G</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 & mikro; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem z sitkiem do komórek</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Roztwór do barwienia żywotności</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 well U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator z pułapką kolba</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotyna (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6. Myszy kongeniczne CD45.1&nbsp;</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A Baytril</td><td></td></tr><tr><td>10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II na specjalne zamówienie&nbsp;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant bare buffer</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotyna (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -Biotyna (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -BV421 (145-2C11)</td><td>Myszy</td><td></td> kongeniczne BioLegend 100341 <td></td></tr><tr><td>CD45.1/CD45.2</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Wyhodowane w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 553775 <td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotyna (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotyna (53-6.7)</td><td></td>Probówka wirówkowa <td>BioLegend</td> 100704 <td></td></tr><tr><td>15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) bez Ca i Mg, płyn&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo wersja 10</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Best theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotyna (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mMyszy wiśniowe (C57BL/6J tło)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wyhodowane w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>IgG z surowicy szczurów, klasy technicznej, >=80% (SDS-PAGE), buforowany roztwór wodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA&nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy&nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka do hodowli tkankowej (do komórki adhezyjnej) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>Separator MidiMACS</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Klatki dla myszy</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>Wielofunkcyjna wirówka chłodnicza</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina penicyliny i streptomycyny</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Zaprawa porcelanowa &phi; 120mm z tłuczkiem</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Białkowa tubka LoBind 1,5 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela ze stali nierdzewnej</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik żył ogonowych dla myszy standard</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotyna (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5ml Koncentryczna strzykawka Luer-Slip</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna Terumo 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

Zdolność do samoodnawiania się i potencjał różnicowania wielu linii są ogólnie uważane za cechy definiujące hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC). Jednak liczne badania sugerują, że w kompartmencie HSC istnieje funkcjonalna niejednorodność. Niedawne analizy pojedynczych komórek wykazały istnienie klonów HSC o różnym losie komórek w obrębie przedziału HSC, które są określane jako tendencyjne klony HSC. Mechanizmy leżące u podstaw niejednorodnych lub słabo odtwarzalnych wyników są słabo poznane, zwłaszcza w odniesieniu do długości samoodnawiania, gdy oczyszczone frakcje HSC są przeszczepiane za pomocą konwencjonalnego barwienia immunologicznego. W związku z tym kluczowe znaczenie dla rozwiązania tego problemu ma ustanowienie powtarzalnej metody izolacji długoterminowych HSC (LT-HSC) i krótkoterminowych HSC (ST-HSC), zdefiniowanej na podstawie długości ich samoodnawiania. Korzystając z bezstronnych, wieloetapowych badań przesiewowych, zidentyfikowaliśmy czynnik transkrypcyjny, Hoxb5, który może być wyłącznym markerem LT-HSC w układzie krwiotwórczym myszy. Na podstawie tego odkrycia ustaliliśmy linię myszy reporterowych Hoxb5 i z powodzeniem wyizolowaliśmy LT-HSC i ST-HSC. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół izolacji LT-HSC i ST-HSC za pomocą systemu reporterskiego Hoxb5. Ta metoda izolacji pomoże naukowcom lepiej zrozumieć mechanizmy samoodnawiania się i biologiczne podstawy takiej heterogeniczności w kompartmencie HSC.

Wcześniej zdolność do samoodnawiania była mierzone za pomocą konkurencyjnych testów transplantacyjnych, w których przyjmuje się, że komórki macierzyste krwi (HSC) dawcy zachowują zdolność do samoodnawiania tylko wtedy, gdy w krwi obwodowej biorcy obserwowane są wieloliniowe komórki dawcy17. Ponadto w kilku raportach zdefiniowano LT-HSC jako komórki, które nadal produkują komórki krwi obwodowej kilka miesięcy po drugiej transplantacji szpiku kostnego10,<sup class=...

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

Długoterminowa i krótkoterminowa metoda izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych lub HSC pomoże naukowcom lepiej zrozumieć mechanizmy odnawiania komórek i biologiczne podstawy heterogeniczności w kompartmencie HSC. Zidentyfikowano czynnik transkrypcyjny Hoxb5, który może być wyłącznym markerem długotrwałych HSC. Na tej podstawie ustalono linię myszy reporterowych Hoxb5 i z powodzeniem wyizolowano długoterminowe i krótkoterminowe HSC.Aby rozpocząć pobieranie komórek szpiku kostnego dawcy, wysterylizuj moździerz i tłuczek 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Zrównoważ je z buforem barwiącym komórki, składającym się z suplementów zawierających PBS bez wapnia i magnezu. Umieść kości wyizolowane od samca myszy Hoxb5-tri-mCherry dawcy w moździerzu i dodaj trzy mililitry buforu barwiącego komórki.Rozetrzyj kości tłuczkiem, a następnie zdezagreguj grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania i przenieś zawiesinę komórkową przez sitko do komórek o średnicy 100 mikronów do 50-mililitrowej probówki. Powtórz proces ze świeżym buforem do barwienia komórek, aż roztwór stanie się klarowny. Zwykle wystarczy powtórzenie trzy razy, aby uzyskać klarowne rozwiązanie.Po odizolowaniu kości udowych i piszczelowych od myszy kongenicznej CD45.1.2, odetnij oba końce kości ostrymi, sterylnymi nożyczkami. Za pomocą igły o rozmiarze 23 G wyposażonej w pięciomililitrową strzykawkę wypełnioną lodowatym buforem zawiesiny komórek, wypłucz szpik kostny do sterylnego naczynia do hodowli komórek zawierającego bufor zawiesiny komórek. Zdezagreguj grudki komórek za pomocą delikatnego pipetowania, a następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów za pomocą pipety P1000.Aby skonfigurować bramkowanie, przygotuj próbkę zgodnie z instrukcjami podanymi w tekście i przenieś jej 400 mikrolitrów do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie z zatrzaskową nasadką sitkową o grubości 35 mikronów. Przygotować i dodać do próbki odczynnik do odcedzania martwych komórek przed analizą, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie włącz cytometr przepływowy i uruchom oprogramowanie analityczne zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie naciśnij Załaduj, aby rozpocząć pobieranie danych. Po wykluczeniu dubletów, martwych komórek i komórek dodatnich linii, bramka frakcji ujemnej linii, c-kit-dodatniej, Sca-1-dodatniej. Następnie wyklucz frakcję Flk2-dodatnią.Następnie bramkują Hoxb5-dodatnie lub Hoxb5-ujemne pHSC w frakcji CD150-dodatniej, CD34-ujemnej lub niskiej. Następnie przygotuj 1,5-milimetrową niskobiałkową rurkę wiążącą z 600 mikrolitrami PBS bez wapnia i magnezu, uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS. Aby przeprowadzić sortowanie pHSC Hoxb5-dodatniego lub Hoxb5-ujemnego, należy ustawić przygotowaną 1,5-mililitrową probówkę wiążącą o niskiej zawartości białka na urządzeniu do sortowania i posortować Hoxb5-dodatnie lub Hoxb5-ujemne pHSC do probówki, stosując wcześniej wspomnianą strategię bramkowania.W pierwszym sortowaniu należy użyć wydajności z trybu dokładności sortowania. Ustawić 96-dołkową płytkę z wcześniej przygotowanymi komórkami podporowymi na stoliku automatycznego osadzania komórek. Następnie ustaw 1,5-mililitrową rurkę wiążącą o niskiej zawartości białka na port ładowania cytometru przepływowego.Sortuj Hoxb5-dodatnie lub Hoxb5-ujemne pHSC na 96-dołkową płytkę z komórkami nośnymi, stosując wcześniej wspomnianą strategię bramkowania. Sortuj 10 Hoxb5-dodatnich lub Hoxb5-ujemnych pHSC, aby przetestować ich zdolność do samoodnawiania. Wykresy cytometrii przepływowej analizy szpiku kostnego myszy Hoxb5-tri-mCherry dawcy wykazały, że około 20 do 25% komórek we frakcji pHSC zdefiniowanej przez linię ujemną, c-kit-dodatnią, Sca-1-dodatnią, CD150-dodatnią, CD34-ujemną lub niską, Flk2-ujemną było Hoxb5-dodatnie pHSC.Pokazano tutaj reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej analizy krwi obwodowej myszy biorców. Co więcej, analiza krwi obwodowej myszy biorców po pierwotnym przeszczepie wykazała, że chociaż Hoxb5-dodatnie i Hoxb5-ujemne pHSC wykazywały podobny chimeryzm dawcy cztery tygodnie po przeszczepie, ciągłą hematopoezę obserwowano tylko u biorców Hoxb5-dodatnich pHSC. Hoxb5-ujemne HSC zaczęły tracić zdolność do wytwarzania komórek krwiotwórczych osiem tygodni po przeszczepie.W analizie wtórnego przeszczepu tylko biorcy pHSC z dodatnim wynikiem Hoxb5 wykazywali silną hematopoezę. W przeciwieństwie do tego, komórki dawcy prawie nie obserwowano u myszy z biorcą pHSC Hoxb5-ujemnym, co sugeruje, że pHSC Hoxb5-ujemne straciły zdolność do samoodnawiania się w ciągu 16 tygodni od pierwotnego przeszczepu. Protokół ten trwa zwykle od dziewięciu do 12 godzin, dlatego ważne jest, aby utrzymać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cały czas trwania procedur, aby utrzymać żywotność komórek.

isolation-method-for-long-term-and-short-term-hematopoietic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten film demonstruje technikę generowania myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS). Krwiotwórcze komórki macierzyste CD34 + (HSC) są izolowane z ludzkich komórek kożucha krwi pępowinowej za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. HSC CD34+ są namnażane w pożywce wzrostowej wzbogaconej o cytokiny i kriokonserwowane. Na koniec rozmrożone HSC wstrzykuje się do mysiego szczeniaka z niedoborem odporności w celu ustalenia mysiego modelu HIS.

Izolowanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wytworzenia myszy z ludzkim układem odpornościowym

Ten protokół umożliwia utrzymanie w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro poprzez naśladowanie mikrośrodowiska szpiku kostnego przy użyciu obfitych kwasów tłuszczowych, cholesterolu, niższych stężeń cytokin i niedotlenienia.

Metoda hodowli w celu utrzymania w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

To badanie ustaliło stabilną i efektywną metodę izolacji, hodowli i funkcjonalnego określania komórek macierzystych CD34+ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych (CD34+ VW-SCs). Ta łatwa do naśladowania i efektywna czasowo metoda izolacji może być wykorzystana przez innych badaczy do badania potencjalnych mechanizmów związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Opisujemy protokół ekstrakcji wysokiej jakości jąder z indukowanych kriokonserwowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących ze zrębu/śródbłonka i komórek krwi, aby wspierać analizy sekwencjonowania nowej generacji pojedynczego jądra. Wytwarzanie wysokiej jakości, nienaruszonych jąder jest niezbędne w eksperymentach multiomicznych, ale dla niektórych laboratoriów może stanowić barierę wejścia w tę dziedzinę.

Izolacja jądrowa z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z in vitro

Poznaj metodę izolacji długotrwałych i krótkoterminowych komórek macierzystych krwi przy użyciu systemu reporterowego Hoxb5. Technika ta pozwala badać mechanizmy odnowy komórkowej i heterogeniczność populacji HSC.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów