Name: Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę oznaczania czasu trwania fazy S w drożdżach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu analogu tymidyny EdU i chemii Click. Technika ta pozwala wykryć subtelne defekty replikacji DNA niewidoczne w klasycznych protokołach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Agence Nationale de la Recherche (ANR) i Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) za stypendia doktoranckie dla J.d.D.B.T. i Agence Nationale pour la Recherche (ANR) za wsparcie finansowe (grant ANR-18-CE12-0018-01). Cytometrię i mikroskopię wykonano w ośrodku obrazowania Montpellier MRI BioCampus.

1. Hodowla komórkowa S. cerevisiae
UWAGA: Użyte szczepy drożdży są wymienione w Tabeli 1
UWAGA: Czas trwania fazy S może być monitorowany na różne sposoby. W zależności od pytania, na które należy odpowiedzieć, komórki mogą być hodowane asynchronicznie lub synchronicznie po zatrzymaniu G1.
<ol>
	<li>Z asynchronicznie rosnących komórek S. cerevisiae 
	UWAGA: Metoda ta pozwala na określenie procentu komórek w fazie S w asynchronicznie rosnącej populacji komórek. Określając czas podwajania, można ekstrapolować czas trwania fazy S (i innych faz).
	<ol>
		<li>Zaszczepić komórki S. cerevisiae w 10 ml syntetycznej pożywki kompletnej (SC) o niskim stężeniu komórek (5 × 104 komórki/ml) w celu wyhodowania przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem orbitalnym przy 130 obr./min. 
		UWAGA: Stężenie mierzy się za pomocą licznika komórek. Aby skutecznie obliczyć czasy podwajania, zaleca się zaszczepienie kultury z hodowli nocnej, która nadal znajduje się w fazie wykładniczej (tj. Najlepiej poniżej 2 × 107 komórek/ml). Hodowla komórek w pożywce bogatej (YPD) nie jest zalecana, ponieważ wykrywanie EdU nie jest skuteczne.</li>
		<li>Następnego dnia rozcieńczyć komórki w 20 ml świeżej pożywki SC o końcowym stężeniu 5 × 105 komórek/ml.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 30 °C w wytrząsającej łaźni wodnej z wytrząsaniem poziomym przy 120 obr./min.</li>
		<li>Mierz stężenie komórek co godzinę, aż osiągnie 1 × 107 komórek/ml. 
		UWAGA: Ten krok pozwala na graficzne przedstawienie wzrostu stężenia komórek w czasie. Wzór stosowany do obliczania czasów podwojenia wyjaśniono w legendzie w tabeli 2.</li>
		<li>Postępuj równolegle do kroku 2 w celu znakowania EdU, gdy stężenie komórek wynosi około 2 × 106-5 × 106 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z komórek S. cerevisiae zsynchronizowanych z G1 
	UWAGA: Metoda ta pozwala na określenie, kiedy zaczyna się i kończy faza S za pomocą cytometrii przepływowej i/lub analiz mikroskopowych.
	<ol>
		<li>Zaszczepić komórki S. cerevisiae w 10 ml pożywki SC o niskim stężeniu komórek (5 × 104 komórki/ml) w celu przeprowadzenia hodowli przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem orbitalnym przy 130 obr./min. 
		UWAGA: Patrz uwagi po kroku 1.1.1.</li>
		<li>Następnego dnia rozcieńczyć komórki w 20 ml świeżej pożywki SC o końcowym stężeniu 2 × 106-3 × 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać 40 μl 1 mg/ml czynnika α rozcieńczonego w wodzie.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 30 °C z mieszaniem orbitalnym przy 130 obr./min przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać ponownie 40 μl 1 mg/ml czynnika α rozcieńczonego w wodzie.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 30 °C z mieszaniem orbitalnym przy 130 obr./min przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby monitorować zatrzymanie G1. Kontynuuj, jeśli więcej niż 90% komórek wykazuje shmoo, a pozostałe są zaokrąglonymi, niepączkującymi komórkami. 
		UWAGA: W zależności od użytego tła, zaleca się sonikację komórek przed wizualizacją shmoo. Dla tła W303 należy sonizować 2x, za każdym razem przez 2 s, przy amplitudzie 40-50.</li>
		<li>Wirować przez 3 minuty przy 1 500 × g. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 20 ml pożywki SC.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.8-1.2.9 raz. 
		UWAGA: Czynnik α jest zmywany w tych krokach, a komórki są uwalniane w cyklu komórkowym. Alternatywnie, czynnik α może być wypłukany przez przefiltrowanie komórek drożdży za pomocą filtra nitrocelulozowego o wielkości 1,2 μm za pomocą lejka umieszczonego na kolbie bocznej podłączonej do pompy próżniowej.</li>
		<li>Zbierz 1 ml komórek 2x co 5 minut i przejdź do kroku 2 dla etykietowania EdU. 
		UWAGA: Oznacz impulsowo komórki tylko z jednej z dwóch probówek za pomocą EdU. Komórki nieznakowane impulsowo służą do odróżniania komórek EdU-dodatnich od EdU-ujemnych na dwuwymiarowym wykresie jodku propidyny (PI)-EdU.</li>
		<li>Dodać 400 μl 1 mg/ml czynnika α rozcieńczonego w wodzie 30 minut po uwolnieniu. 
		UWAGA: Ta wysoka dawka czynnika α jest wymagana do zatrzymania komórek w fazie G1 następnego cyklu komórkowego i zapobieżenia ponownemu wejściu komórek w kolejną fazę S.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Etykietowanie EdU
<ol>
	<li>Przenieść 1 ml kultury komórkowej do probówki do mikrofuge o pojemności 2,0 ml zawierającej 1 μl 10 mM EdU. Dobrze wymieszaj przez inwersję. 
	UWAGA: Aby odróżnić komórki EdU-dodatnie od komórek EdU-ujemnych na dwuwymiarowym FACS PI-EdU, przenieś kolejny 1 ml kultury komórkowej do probówki do mikrofuge o pojemności 2,0 ml zawierającej 1 μl DMSO.</li>
	<li>Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 30 °C pod wpływem mieszania w wytrząsającej łaźni wodnej. 
	UWAGA: Trzy minuty wystarczą do wykrycia EdU za pomocą mikroskopu; 5 minut jest wymagane do optymalnego wykrycia EdU na cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję przez dodanie 100 μl 100% etanolu.
	<ol>
		<li>Zatrzymaj reakcję przez dodanie 100 μl 20% paraformaldehydu, jeśli wymagany jest pomiar wielkości komórek. 
		UWAGA: Jeśli architektura jądrowa komórek mitotycznych ma pozostać nienaruszona do dalszych analiz po reakcji Click, zalecamy utrwalenie komórek za pomocą 2% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej (RT), a nie umieszczanie komórek na lodzie, ponieważ ten ostatni powoduje depolimeryzację mikrotubul.</li>
		<li>Pozostaw ogniwa na 20 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu na kołysce o zmiennej prędkości przy 20 przechyleniach/min, aby utrwalić komórki przed dodaniem 100 μl 100% etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Utrwalanie i przenikanie komórek
<ol>
	<li>Granuluj komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrofuge. Usunąć supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl 70% etanolu. Dobrze wymieszaj, wirując.</li>
	<li>Pozostawić na ≥1 h w temperaturze pokojowej przy 20 nachyleniach/min na wahaczu o zmiennej prędkości, aby przepuszczalność komórek. 
	UWAGA: Komórki wyhodowane w pożywce SC nie granulują się dobrze, ponieważ mają tendencję do przyklejania się do ścianek mikrofuge. Dodatek etanolu poprawia granulowanie i zmniejsza utratę komórek. Komórki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc lub przez dłuższy czas w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
	<li>Umyj komórki 2x 500 μL 10% etanolu w PBS. 
	UWAGA: Mycie ma kluczowe znaczenie dla usunięcia niewbudowanego EdU z komórek.</li>
</ol>
4. Reakcja na kliknięcie
<ol>
	<li>Do analizy cytometrycznej
	<ol>
		<li>Granuluj komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrofuge. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Zawiesić osad w 200 μl PBS zawierającego 0,1 mg/ml RNazy A i 0,2 mg/ml proteinazy K.</li>
		<li>Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 50 °C, od czasu do czasu wstrząsając (lub przez noc w temperaturze 37 °C).</li>
		<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Umyj komórki 500 μl PBS.</li>
		<li>Granuluj komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrofuge. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować przez 30 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Dłuższe czasy nie są konieczne, a nawet wpływają negatywnie na skuteczność reakcji na kliknięcia.</li>
		<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Zawiesić osad w 300 μL PBS + 1% BSA.</li>
		<li>Rozmieść komórki między dwiema probówkami: 200 μl w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do reakcji Click i 100 μl w innej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do barwienia Sytox Green.</li>
		<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Do barwienia Sytox Green 
		UWAGA: Zdecydowanie zalecamy pobranie podwielokrotności do barwienia Sytox Green (bez kliknięcia) w celu uzyskania wysokiej jakości profili referencyjnych zawartości DNA. Rzeczywiście, reakcja Click silnie wygasza fluorescencję interkalantową, w tym fluorescencję Sytox Green i PI. W konsekwencji reakcja kliknięcia może zniekształcić odczyt zawartości DNA.
		<ol>
			<li>Zawiesić osad komórkowy w 100 μl PBS.</li>
			<li>Przenieś 10-30 μl (w zależności od stężenia komórek) do probówki cytometru przepływowego zawierającej 300 μl 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 0,5 μM Sytox Green.</li>
			<li>Sonikuj 2x, za każdym razem przez 2 s, przy amplitudzie 40-50.</li>
			<li>Pozostawić w ciemności do czasu przetworzenia próbek na cytometrze przepływowym. 
			UWAGA: Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla reakcji kliknięcia
		<ol>
			<li>Przygotować świeży bufor barwnika azydkowego, mieszając odczynniki w następującej kolejności (ilość na jedną probówkę): 36 μl PBS, 2 μl 0,2 M CuSO4, 0,2 μl 2 mM Cy5 Azide i 2 μL 1 M kwasu askorbinowego. 
			UWAGA: Możliwe jest przygotowanie mieszanki wzorcowej buforu Azide Dye. Odczynniki należy mieszać w tej samej kolejności, jak podana powyżej.</li>
			<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 40 μl świeżo przygotowanej mieszanki barwników azydkowych. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.</li>
			<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
			<li>Umyj komórki 3x 300 μl 10% etanolu w PBS. 
			UWAGA: Przemywania mają kluczowe znaczenie dla wyeliminowania całego rozpuszczalnego azydku EdU-Cy5.</li>
			<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 50 μg/ml PI w PBS. Pozostaw na 10 minut w ciemności.</li>
			<li>Przenieść 10-30 μl zawiesiny komórek (w zależności od stężenia komórek) do probówki cytometru przepływowego zawierającej 300 μl 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.</li>
			<li>Sonikuj 2x, za każdym razem przez 2 s, przy amplitudzie 40-50.</li>
			<li>Pozostawić w ciemności do czasu przetworzenia próbek na cytometrze. 
			UWAGA: Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odczyt próbek Sytox Green za pomocą wzbudzenia niebieskiego lasera o długości fali 488 nm i filtra 530/30 BP. Zobacz Rysunek 1A, aby zapoznać się z typowymi wynikami. Odczytaj dwuwymiarowe próbki PI-EdU na wykresie punktowym przy użyciu niebieskiego lasera wzbudzenia przy długości fali 488 nm i filtra 615/20 BP dla PI (oś x) oraz czerwonego lasera wzbudzenia przy 640 nm i filtrze 660/20 BP (oś y). Zobacz Rysunek 1B dla typowych wyników. 
		UWAGA: <silna klasa="xfig">Rysunek 1C przedstawia typowy dwuwymiarowy wynik FACS PI-EdU dla komórek EdU-ujemnych. Pozwala na rozróżnienie komórek EdU-ujemnych od komórek EdU-dodatnich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do analizy mikroskopowej
	<ol>
		<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Zawiesić osad w 200 μl PBS + 1% BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Granuluj komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrofuge. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Przygotować świeży bufor barwnika azydkowego, mieszając odczynniki w następującej kolejności (ilość na jedną probówkę): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM azydku Dy-530, 2 μL 1 M kwasu askorbinowego. 
		UWAGA: Główną mieszankę buforu barwnika azydkowego można przygotować na świeżo, mieszając odczynniki w wyżej wymienionej kolejności.</li>
		<li>Zawiesić osad z 40 μl świeżo przygotowanego buforu barwnika azydkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.</li>
		<li>Granuluj komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrofuge. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Umyj komórki 2x 300 μl 10% etanolu w PBS. 
		UWAGA: Mycie ma kluczowe znaczenie dla wyeliminowania wszystkich rozpuszczalnych azydków Dy-530.</li>
		<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w PBS. Pozostaw na 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrowirówce. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Przemyć 300 μl PBS, aby usunąć nadmiar DAPI.</li>
		<li>Granuluj komórki przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g w mikrofuge. Odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.</li>
		<li>Zawiesić osad z 10-50 μl PBS w zależności od stężenia komórek.</li>
		<li>Sonikuj 2x, za każdym razem przez 2 s, przy amplitudzie 40-50, 
		UWAGA: Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
		<li>Pobrać pipetę 1,7 μl komórek na szklane szkiełko mikroskopowe i przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Natychmiast obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym z filtrami DAPI i TexasRed lub Cy3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+replication+of+individual+replicons+in+eukaryotic+replication+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories.</a> Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).</li>
<li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+Sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Lengronne, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+CDK+inhibitor+Sic1+prevents+genomic+instability+by+promoting+replication+origin+licensing+in+late+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).</li>
<li>Tanaka, S., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+G+1-cyclin+expression+induces+genomic+instability+by+preventing+efficient+pre-RC+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation.</a> Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).</li>
<li>Teixeira, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+deregulation+promotes+loss+of+specific+genomic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions.</a> Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).</li>
<li>Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+populations+growing+at+different+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).</li>
<li>McNeil, J. B., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+herpes+simplex+virus+thymidine+kinase+gene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).</li>
<li>Vernis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+efficient+thymidine+salvage+pathway+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+instability+of+yeast+cdc6-1%2Fcdc6-1+mutants+involves+chromosome+structure+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination.</a> Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).</li>
<li>Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+control+of+Mcm5+interaction+with+chromatin+in+cdc6-1+mutated+in+CDC-NTP+motif%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif.</a> DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).</li>
<li>Saner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+association+of+neighboring+replicons+creates+replication+factories+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast.</a> Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).</li>
<li>Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORC-dependent+and+origin-specific+initiation+of+DNA+replication+at+defined+foci+in+isolated+yeast+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei.</a> Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).</li>
<li>Lengronne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+BrdU+incorporation+in+TK%2B+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains.</a> Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+spindle+checkpoints+cooperate+during+S+phase+to+delay+mitosis+and+preserve+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).</li>
<li>Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+incorporation+for+FACS+and+microscopy+analysis+of+DNA+replication+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).</li>
<li>Ivanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+complete+DNA+synthesis+after+chromosome+segregation+begins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins.</a> Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Drożdże są głównym organizmem modelowym do badań cyklu komórkowego, jednak charakterystyka ich fazy S od dawna jest utrudniona przez ich niezdolność do włączenia egzogennych nukleozydów, takich jak BrdU, które są używane jako znaczniki replikacji DNA. Wyposażenie drożdży w wysoką ekspresję kinazy tymidynowej opryszczki pospolitej (TK) i dodanie ludzkiego transportera nukleozydów (hENT) w dużej mierze rozwiązało ten problem15,16. EdU jest bardziej wszechstronny ni...

Stabilność genomu poprzez podział mitotyczny jest zapewniona przez transmisję kompletnego i równego zestawu chromosomów do dwóch wytworzonych komórek progeniowych. Polega to na dokładnym zakończeniu serii zdarzeń zachodzących w danym czasie w każdej fazie cyklu komórkowego. W G1 źródła replikacji są licencjonowane po zrekrutowaniu kilku czynników licencjonowania, w tym Cdc61. W fazie S duplikacja całego genomu jest inicjowana z wielu aktywnych początków replikacji i wykonywana przez maszyny replikacyjne, które gromadzą się w mikroskopijnie widocznych ogniskach zwanych fabrykami replikacji2. W fazie M zduplikowane chromatydy siostrzane są przyłączane i dwukierunkowe na wrzecionie mitotycznym, aby umożliwić ich segregację na przeciwległe bieguny komórki mitotycznej3. Regulacja, prawidłowe zakończenie i czas trwania każdej fazy są kluczowe dla zapewnienia stabilności genomu. Rzeczywiście, przedwczesne wyjście z którejkolwiek z tych faz prowadzi do niestabilności genomu. Na przykład, krótsza G1 wywołana przez delecję pączkującego inhibitora drożdży CDK Sic1 lub przez nadekspresję cyklin G1 zmieni kolejną fazę S4,5,6. W związku z tym te deregulacje, związane lub nie ze stresem replikacyjnym, skutkują pęknięciami chromosomów, rearanżacjami i błędną segregacją4,5,6. W związku z tym monitorowanie czasu trwania fazy S i szerzej czasu trwania pozostałych faz cyklu komórkowego może mieć kluczowe znaczenie dla identyfikacji defektów występujących w różnych mutantach i w różnych warunkach stresowych.
Tradycyjna metoda pomiaru czasu trwania fazy cyklu komórkowego obejmuje prostą cytometrię przepływu zawartości DNA (Rysunek 1A) i opiera się na algorytmie dopasowania (dostępnym w większości programów do cytometrii) używanym do rozdzielenia populacji na frakcje fazowe G1, S i G2 + M od pików 1C i 2C. Ułamki są następnie mnożone przez czas podwojenia populacji7. Jednak ta metoda daje tylko wartości szacunkowe, wymaga jednorodnego rozkładu wielkości komórek w danej frakcji i nie ma zastosowania do kultur zsynchronizowanych. Aby zbadać czas trwania fazy S w komórkach ssaków, opracowano i szeroko stosowano kilka analogów tymidyny, w tym EdU. Ich wychwyt z pożywki zewnątrzkomórkowej i fosforylacja przez kinazę tymidynową (zwaną dalej TK) udostępniają je polimerazom DNA w celu włączenia ich w miejsca syntezy DNA (replikacja, rekombinacja, naprawa). Aby ominąć brak genu TK w komórkach Saccharomyces cerevisiae, szczepy drożdży zostały zmodyfikowane tak, aby umożliwić stabilną i konstytutywną ekspresję wirusa opryszczki pospolitej TK8 i ludzkiego równowagowego transportera nukleozydów (hENT1)9. Po włączeniu do DNA, EdU jest wykrywany poprzez selektywną reakcję Click, która chemicznie sprzęga jego ugrupowanie alkinowe z fluorochromami modyfikowanymi azydkiem10.
Ten artykuł dostarcza dwóch zoptymalizowanych kompleksowych protokołów do znakowania impulsowego asynchronicznych i synchronicznych komórek inżynieryjnych TK-hENT1 z EdU w celu precyzyjnej wizualizacji i pomiaru czasu trwania i dynamiki replikacji DNA, a także czasu trwania innych faz cyklu komórkowego, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>&alfa;-współczynnik&nbsp;</td><td>Genescript</td><td>RP01002</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>04-100--812-E</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi</td><td>Sigma</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Azydek di-sulfo-cyjaniny5 (Azydek Cy5)</td><td>Interchim</td><td>FP-JV6320</td><td>Alternatywa dla Alexa647-Azide</td></tr><tr><td>Dy-530</td><td>Dyomics</td><td>&nbsp; 530-10</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna)</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutne</td><td>odczynniki Carlo Erba</td><td>P013A10D16</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Euromedex</td><td>EU0090</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza</td><td>SIGMA</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Invitrogen</td><td>S-7020</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>OLS</td><td>CASY</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Agilent</td><td>NovoSampler Pro</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wstrząsowy</td><td>Infors</td><td>444-4230</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Woda do wytrząsania kąpiel</td><td>Julabo</td><td>SW22</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics</td><td>Vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia szerokokątna</td><td>Leica</td><td>THUNDER Imager</td><td>lub równoważny</td></tr></tbody></table>

oznaczanie czasu trwania fazy s przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w saccharomyces cerevisiae

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Replikacja DNA eukariotycznego jest wysoce regulowanym procesem, który zapewnia, że genetyczny plan komórki jest poprawnie zduplikowany przed segregacją chromosomów. Ponieważ defekty syntezy DNA leżą u podstaw rearanżacji chromosomów, monitorowanie replikacji DNA stało się niezbędne do zrozumienia podstaw niestabilności genomu. Saccharomyces cerevisiae jest klasycznym modelem do badania regulacji cyklu komórkowego, ale kluczowe parametry replikacji DNA, takie jak frakcja komórek w fazie S lub czas trwania fazy S, są nadal trudne do określenia. Protokół ten wykorzystuje krótkie i nietoksyczne impulsy 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), analogu tymidyny, w zmodyfikowanych komórkach drożdży TK-hENT1, a następnie jego wykrywanie przez reakcję Click, aby umożliwić wizualizację i kwantyfikację replikacji DNA z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Metoda ta może zidentyfikować wcześniej przeoczone defekty w fazie S i progresji cyklu komórkowego mutantów drożdży, umożliwiając w ten sposób scharakteryzowanie nowych graczy niezbędnych do zapewnienia stabilności genomu.

Aby określić czas trwania fazy S, a szerzej czas trwania fazy G1 oraz G2 + M (krok protokołu 1.1), S. cerevisiae komórki typu dzikiego szczepu W303 (WT, Tabela 1) hodowano asynchronicznie w medium SC przez 7 h. Co godzinę monitorowano stężenie komórek w celu wyznaczenia czasu podwojenia (Rycina 2B). W tych warunkach wzrostu obliczony czas podwojenia wynosił 120 min ± 13 min w temperaturze 25 ˚C (Tabela 2). Gdy komórki znajdował...

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Protokół ten pozwala na precyzyjne określenie czasu trwania fazy S w zsynchronizowanych pączkujących komórkach drożdży. Jest to szybka, łatwa i powtarzalna metoda. Ponadto jest wystarczająco czuły, aby wykryć łagodne defekty syntezy, które nie są wykrywane przez klasyczne protokoły.Metoda ta będzie przydatna dla wielu badaczy zajmujących się regulacją cyklu komórkowego u pączkujących drożdży. Protokół ten zademonstrują Nicolas Talarek, starszy badacz, i Juan De Dios Barba Tena, doktorant w laboratorium. Zaszczepić komórki Saccharomyces cerevisiae w 10 mililitrach pożywki SC o niskim stężeniu komórek do hodowli przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem orbitalnym przy 130 obrotach na minutę.Następnego dnia rozcieńczyć komórki w 20 mililitrach świeżej pożywki SC o końcowym stężeniu dwa do trzech razy 10 do sześciu komórek na mililitr. W 40 mikrolitrach jednego miligrama na mililitr czynnika alfa rozcieńczonego w wodzie. Następnie hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza, z mieszaniem orbitalnym z prędkością 130 obrotów na minutę przez jedną godzinę.Powtórz ten krok raz. Wizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby monitorować zatrzymanie G1. Kontynuuj, jeśli ponad 90% komórek wykazuje shmoo, a pozostałe są zaokrąglonymi komórkami bez przylegania.Odwirować próbki przez trzy minuty w temperaturze 1 500 G. Następnie odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej i ponownie zawiesić komórki w 20 mililitrach pożywki SC. Powtórz ten krok raz. Zbieraj jeden mililitr komórek dwa razy co pięć minut i przystąp do etykietowania EDU.Dodaj 400 mikrolitrów czynnika alfa 30 minut po uwolnieniu. Przenieść jeden mililitr kultury komórkowej do dwumililitrowej probówki do mikrofugi zawierającej jeden mikrolitr 10-milimolowego EDU, dobrze wymieszanego przez inwersję. Aby odróżnić komórki EDU dodatnie od komórek ujemnych EDU na dwuwariantnych faktach Pi EDU, przenieś kolejny mililitr kultury komórkowej do dwumililitrowej probówki mikrofuge zawierającej jeden mikrolitr DMSO.Inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod wpływem mieszania w wstrząsającej łaźni wodnej. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 mikrolitrów 100% etanolu. Granulować komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrofudze.Usunąć supernatant za pomocą pipety próżniowej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach 70% etanolu i dobrze wymieszać przez wirowanie. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na co najmniej jedną godzinę z prędkością 20 nachyleń na minutę na kołysce o zmiennej prędkości, aby przepuszczalność komórek.Granulować komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrowirówce i wyrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej. Umyj ogniwa dwukrotnie 500 mikrolitrami 10% etanolu i PBS. Osadzać komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrodymie i wyrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.Zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS zawierających RNazę A i proteinazę K. Inkubować od jednej do dwóch godzin w temperaturze 50 stopni Celsjusza z okazjonalnym wstrząsaniem lub przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Granulować komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrowirówce i wyrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej. Umyj komórki 500 mikrolitrami PBS.Następnie osadzać komórki i odrzucać supernatant, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS z 1% BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie osadzać komórki, odrzucać supernatant, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach PBS zawierających 1% BSA. Rozłóż komórki do dwóch mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Pierwsza z nich powinna składać się z 200 mikrolitrów kultury komórkowej do reakcji Click, a druga probówka powinna zawierać 100 mikrolitrów kultury komórkowej do barwienia sytox green.Następnie zagnieździć komórki i wyrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej. W celu barwienia sytox green zawieś ponownie osad komórkowy w 100 mikrolitrach PBS. Następnie, w zależności od stężenia komórek, przenieś od 10 do 30 mikrolitrów do probówki cytometru przepływowego zawierającej 300 mikrolitrów zielonej mieszanki sytox.Sonikować próbki dwa razy przez dwie sekundy przy amplitudzie od 40 do 50%Pozostawić w ciemności do czasu przetworzenia próbek na cytometrze przepływowym. W przypadku reakcji Click ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu barwnika azydkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.Zdestylować komórki i odrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej. Następnie umyj ogniwa trzykrotnie 300 mikrolitrami 10% etanolu w PBS. Następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach po 50 mikrogramów na mililitr jodku propidyny w PBS i pozostaw na 10 minut w ciemności.W zależności od stężenia komórek przenieś od 10 do 30 mikrolitrów zawiesiny komórek do probówki cytometru przepływowego zawierającej 300 mikrolitrów 50-milimolowego Tris HCl, pH 7,5. Sonikuj dwa razy przez dwie sekundy przy amplitudzie od 40 do 50. Pozostaw próbki w ciemności do czasu przetworzenia ich na cytometrze.Odczytaj zielone próbki sytox za pomocą wzbudzenia niebieskiego lasera o długości 488 nanometrów i filtra pasmowego 530 na 30. Odczytaj próbki Bavaria Pi EDU na wykresie punktowym za pomocą niebieskiego lasera wzbudzenia o długości fali 488 nanometrów i filtra pasmowego o wymiarach 615 na 20 dla osi X Pi oraz czerwonego lasera wzbudzającego o długości 640 nanometrów, filtra pasmowego o wymiarach 660 na 20 dla osi Y. W analizie biwariantnego cytometru EDU Pi zaobserwowano trzy populacje komórek.W temperaturze 25 stopni Celsjusza około 27% populacji komórek znajdowało się w fazie G1, 29% w fazie S, a około 44% w fazie G2 plus M. W zsynchronizowanych komórkach czas trwania fazy S może wynosić około 25 minut w zależności od czasu, w którym zawartość DNA zmieniła się z jednego C na dwa C na profilu sytox green flow cytometr. Znakowanie impulsów EDU dokładnie określiło czas trwania fazy S.15 minut po uwolnieniu wykryto frakcję komórek EDU dodatnich, co wskazuje na początek fazy S. Postęp przez fazę S był obserwowany przez chmurę komórkową poruszającą się w górę i w prawo na wykresie Bavaria Pi EDU. W końcu, po 35 minutach od uwolnienia, część komórek była EDU ujemna, ale z dwukrotnie większą ilością DNA wskazującą, że faza S się zakończyła, a komórki znajdowały się w fazie G2 plus M.Pomimo zaobserwowanej wysokiej synchronizacji, niektóre komórki zakończyły fazę S 60 minut po uwolnieniu, a faza S została zakończona dla całej populacji około 65 minut po uwolnieniu. Bardzo ważne jest, aby mieć idealną synchronizację i zapobiec przechodzeniu komórek w drugą fazę S. Komórki można obrazować za pomocą mikroskopu, gdzie można monitorować i określać ilościowo prognozowanie replikacji jądrowego DNA.Technika ta pomoże zidentyfikować przeoczone mutanty, które mają łagodne defekty fazy S, a także defekty czasu trwania cyklu komórkowego.

determination-s-phase-duration-using-5-ethynyl-2-deoxyuridine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Opisano metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do identyfikacji fazy S i analizy dynamiki cyklu komórkowego w hermafrodytycznej linii zarodkowej C. elegans przy użyciu analogu tymidyny EdU. Ta metoda nie wymaga transgenów i jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym.

Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU

Ten protokół dostosowuje pomiary cyklu komórkowego do wykorzystania na platformie cytometrii masowej. Dzięki wieloparametrowym możliwościom cytometrii masowej, bezpośredni pomiar inkorporacji jodu umożliwia identyfikację komórek w fazie S, podczas gdy markery cyklu wewnątrzkomórkowego umożliwiają scharakteryzowanie każdego stanu cyklu komórkowego w szeregu warunków eksperymentalnych.

Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę oznaczania czasu trwania fazy S w drożdżach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu analogu tymidyny EdU i chemii Click. Technika ta pozwala wykryć subtelne defekty replikacji DNA niewidoczne w klasycznych protokołach.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów