Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Protokół ten pozwala na precyzyjne określenie czasu trwania fazy S w zsynchronizowanych pączkujących komórkach drożdży. Jest to szybka, łatwa i powtarzalna metoda. Ponadto jest wystarczająco czuły, aby wykryć łagodne defekty syntezy, które nie są wykrywane przez klasyczne protokoły.

Metoda ta będzie przydatna dla wielu badaczy zajmujących się regulacją cyklu komórkowego u pączkujących drożdży. Protokół ten zademonstrują Nicolas Talarek, starszy badacz, i Juan De Dios Barba Tena, doktorant w laboratorium. Zaszczepić komórki Saccharomyces cerevisiae w 10 mililitrach pożywki SC o niskim stężeniu komórek do hodowli przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem orbitalnym przy 130 obrotach na minutę.

Następnego dnia rozcieńczyć komórki w 20 mililitrach świeżej pożywki SC o końcowym stężeniu dwa do trzech razy 10 do sześciu komórek na mililitr. W 40 mikrolitrach jednego miligrama na mililitr czynnika alfa rozcieńczonego w wodzie. Następnie hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza, z mieszaniem orbitalnym z prędkością 130 obrotów na minutę przez jedną godzinę.

Powtórz ten krok raz. Wizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby monitorować zatrzymanie G1. Kontynuuj, jeśli ponad 90% komórek wykazuje shmoo, a pozostałe są zaokrąglonymi komórkami bez przylegania.

Odwirować próbki przez trzy minuty w temperaturze 1 500 G. Następnie odrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej i ponownie zawiesić komórki w 20 mililitrach pożywki SC. Powtórz ten krok raz. Zbieraj jeden mililitr komórek dwa razy co pięć minut i przystąp do etykietowania EDU.

Dodaj 400 mikrolitrów czynnika alfa 30 minut po uwolnieniu. Przenieść jeden mililitr kultury komórkowej do dwumililitrowej probówki do mikrofugi zawierającej jeden mikrolitr 10-milimolowego EDU, dobrze wymieszanego przez inwersję. Aby odróżnić komórki EDU dodatnie od komórek ujemnych EDU na dwuwariantnych faktach Pi EDU, przenieś kolejny mililitr kultury komórkowej do dwumililitrowej probówki mikrofuge zawierającej jeden mikrolitr DMSO.

Inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod wpływem mieszania w wstrząsającej łaźni wodnej. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 mikrolitrów 100% etanolu. Granulować komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrofudze.

Usunąć supernatant za pomocą pipety próżniowej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach 70% etanolu i dobrze wymieszać przez wirowanie. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na co najmniej jedną godzinę z prędkością 20 nachyleń na minutę na kołysce o zmiennej prędkości, aby przepuszczalność komórek.

Granulować komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrowirówce i wyrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej. Umyj ogniwa dwukrotnie 500 mikrolitrami 10% etanolu i PBS. Osadzać komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrodymie i wyrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej.

Zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS zawierających RNazę A i proteinazę K. Inkubować od jednej do dwóch godzin w temperaturze 50 stopni Celsjusza z okazjonalnym wstrząsaniem lub przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Granulować komórki przez dwie minuty w temperaturze 10 000 G w mikrowirówce i wyrzucić supernatant za pomocą pipety próżniowej. Umyj komórki 500 mikrolitrami PBS.

Następnie osadzać komórki i odrzucać supernatant, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS z 1% BSA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie osadzać komórki, odrzucać supernatant, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach PBS zawierających 1% BSA. Rozłóż komórki do dwóch mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Pierwsza z nich powinna składać się z 200 mikrolitrów kultury komórkowej do reakcji Click, a druga probówka powinna zawierać 100 mikrolitrów kultury komórkowej do barwienia sytox green.

Następnie zagnieździć komórki i wyrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej. W celu barwienia sytox green zawieś ponownie osad komórkowy w 100 mikrolitrach PBS. Następnie, w zależności od stężenia komórek, przenieś od 10 do 30 mikrolitrów do probówki cytometru przepływowego zawierającej 300 mikrolitrów zielonej mieszanki sytox.

Sonikować próbki dwa razy przez dwie sekundy przy amplitudzie od 40 do 50%Pozostawić w ciemności do czasu przetworzenia próbek na cytometrze przepływowym. W przypadku reakcji Click ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu barwnika azydkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 60 minut.

Zdestylować komórki i odrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej. Następnie umyj ogniwa trzykrotnie 300 mikrolitrami 10% etanolu w PBS. Następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach po 50 mikrogramów na mililitr jodku propidyny w PBS i pozostaw na 10 minut w ciemności.

W zależności od stężenia komórek przenieś od 10 do 30 mikrolitrów zawiesiny komórek do probówki cytometru przepływowego zawierającej 300 mikrolitrów 50-milimolowego Tris HCl, pH 7,5. Sonikuj dwa razy przez dwie sekundy przy amplitudzie od 40 do 50. Pozostaw próbki w ciemności do czasu przetworzenia ich na cytometrze.

Odczytaj zielone próbki sytox za pomocą wzbudzenia niebieskiego lasera o długości 488 nanometrów i filtra pasmowego 530 na 30. Odczytaj próbki Bavaria Pi EDU na wykresie punktowym za pomocą niebieskiego lasera wzbudzenia o długości fali 488 nanometrów i filtra pasmowego o wymiarach 615 na 20 dla osi X Pi oraz czerwonego lasera wzbudzającego o długości 640 nanometrów, filtra pasmowego o wymiarach 660 na 20 dla osi Y. W analizie biwariantnego cytometru EDU Pi zaobserwowano trzy populacje komórek.

W temperaturze 25 stopni Celsjusza około 27% populacji komórek znajdowało się w fazie G1, 29% w fazie S, a około 44% w fazie G2 plus M. W zsynchronizowanych komórkach czas trwania fazy S może wynosić około 25 minut w zależności od czasu, w którym zawartość DNA zmieniła się z jednego C na dwa C na profilu sytox green flow cytometr. Znakowanie impulsów EDU dokładnie określiło czas trwania fazy S.

15 minut po uwolnieniu wykryto frakcję komórek EDU dodatnich, co wskazuje na początek fazy S. Postęp przez fazę S był obserwowany przez chmurę komórkową poruszającą się w górę i w prawo na wykresie Bavaria Pi EDU. W końcu, po 35 minutach od uwolnienia, część komórek była EDU ujemna, ale z dwukrotnie większą ilością DNA wskazującą, że faza S się zakończyła, a komórki znajdowały się w fazie G2 plus M.

Pomimo zaobserwowanej wysokiej synchronizacji, niektóre komórki zakończyły fazę S 60 minut po uwolnieniu, a faza S została zakończona dla całej populacji około 65 minut po uwolnieniu. Bardzo ważne jest, aby mieć idealną synchronizację i zapobiec przechodzeniu komórek w drugą fazę S. Komórki można obrazować za pomocą mikroskopu, gdzie można monitorować i określać ilościowo prognozowanie replikacji jądrowego DNA.

Technika ta pomoże zidentyfikować przeoczone mutanty, które mają łagodne defekty fazy S, a także defekty czasu trwania cyklu komórkowego.